文摘
毛囊的毛乳头(DP)和真皮鞘(DS)支持和维护上皮干细胞的增殖和分化产生头发纤维。针对监管属性,在这项研究中,我们调查了毛囊真皮细胞之间的相互作用(DP和DS)和胚胎干细胞(ESCs);诱导多能干细胞(万能);和造血的干细胞。我们发现coculture ESCs的毛囊真皮细胞或支持他们长期维护一个显然未分化状态的细胞则建立了差异化分析,未分化的ESCs的免疫细胞化学和rt - pcr标记。我们进一步表明,细胞因子参与ESC支持也表达了培养毛囊真皮细胞,为维护提供一个可能的解释在cocultures ES细胞具备干细胞。相同的细胞因子表达在毛囊原位在卵泡增长模式更符合角色的活动比干细胞维护。最后,我们表明,老鼠的毛囊真皮细胞培养提供良好的基质支持造血作用在一个既定的coculture模型。人体毛囊真皮细胞代表一个可访问的和容易的传播来源馈线多能细胞,造血的细胞,有可能用于临床应用。
1。介绍
成人毛囊真皮细胞数量大量的再生,归纳,和支持功能,在成人和发展毛囊(1,2),结合其他细胞类型包括角膜和羊膜(3,4]。实验,成人毛囊真皮细胞的亚种群显示了广泛的干细胞功能,和多能——包括代骨、脂肪和肌肉在体外(5- - - - - -7]。此外,真皮细胞可以区分造血的血统在活的有机体内和在体外,(8,9)和特征类似于胚胎神经嵴干细胞(10]。在这方面,他们的行为类似于干细胞的数量从成人骨髓,分离的常见来源成体干细胞(11]。有趣的是,细胞分离成人骨髓也支持功能,特别是在支持造血干细胞和胚胎干细胞(ESCs)在体外(12- - - - - -14]。骨髓细胞表皮角化细胞的支持在体外皮肤重新化验(15和皮肤伤口愈合期间16与毛囊真皮细胞),展示重要的相似之处(17,18]。
ESCs,来源于哺乳动物囊胚的内细胞团19- - - - - -21),保留他们的发展潜力经过长时间的文化分化下所有三个胚层细胞系在活的有机体内和在体外。诱导多能干细胞(万能),这几乎相当于ESCs,最初生成的重编程体细胞,这一过程通过使用virus-mediated基因转导的几个关键因素22,23]。而老鼠的ESCs(制)没有支线细胞连续培养gelatin-coated板块的白血病抑制因子(生活)24人类的ESCs],为)或细胞则会区分文化存在的细胞因子。未分化的人类传播的ESCs或细胞则通常由coculture小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)支线层。改善人类多能细胞临床方面的潜在应用,已经取得了相当大的进展建立feeder-free文化定义为系统或万能25- - - - - -27),方法,包括发展在特定的细胞基质(28,29日),在悬挂文化30.)或定义的无血清培养基(31日]。另一种方法是mef替换为来自人体的细胞。例如,骨髓基质细胞(BMSC) (13),新生儿皮肤成纤维细胞、基质细胞(32- - - - - -34],[羊膜间充质细胞35),或人类胎儿细胞系(36)都被雇佣为支线细胞。然而,人类支线层要求给料机的使用细胞类型是交通便利,容易传播,有效地维护和放大未分化为适合临床使用。
不同类型的相邻细胞之间的相互作用在发育生物学器官形成的主要机制。针对毛囊真皮细胞的归纳属性(1,2),我们开始着手调查coculture其对公司的影响在体外期待,真皮细胞会产生一些指令影响公司的差异化。然而,我们发现毛囊真皮细胞似乎是有效的维护公司的处于未分化状态。这是经诱导分化后制以及多个血统长期coculture和通过调查未分化的标志特征的表达公司的rt - pcr和免疫荧光。我们随后研究了真皮文化的机制可以支持公司通过检查的表达细胞因子il - 6的家人,知道维持小鼠胚胎干细胞多能性是至关重要的在体外通过gp130受体和JAK / STAT通路。平行调查也进行毛囊,毛囊上皮干细胞的基础上假设可能被ES程控处于未分化状态保持机制。这是不支持的观察,但家庭细胞因子il - 6的患病率和gp130受体在毛囊的功能作用gp130 / JAK / STAT信号在毛囊活动。当人体毛囊真皮细胞的能力保持为hiPSCs处于未分化状态评估,它被证实,像啮齿动物细胞同行,毛囊真皮细胞的优于皮肤成纤维细胞的能力维护和支持hESC和iPSC文化。最后,考虑到明显的相似之处骨髓基质细胞和毛囊真皮/间质(17),我们执行coculture实验探讨毛囊真皮细胞的能力来支持造血的活动。在这里,卵泡细胞是平等的如果不是比骨骨髓来源基质细胞在实验条件下工作。
这些观察监管的影响皮肤和毛囊上皮干细胞,以及确认毛囊真皮细胞有可能是一个有用的支线细胞来源的支持和一系列的干细胞类型的放大。
2。材料和方法
2.1。毛囊DP和DS细胞隔离和文化
DP和DS microdissected触须毛囊的成人PVG老鼠或BalbC Zin40老鼠如前所述[37]。来自动物的动物组织是依法安置机构杜伦大学的指导方针。人类DP和DS microdissected从皮肤活检如前所述2),与皮肤活检获得匿名丢弃组织依照赫尔辛基的指导方针。皮肤真皮成纤维细胞(SF)文化建立了外植体加上切碎的啮齿动物拦路强盗或人类interfollicular头皮皮肤。自发地改变了老鼠毛乳头细胞,RDP-B [38),也用作控制线。连接建立后,细胞被维护在MEM(σ)补充10%的边后卫(Gibco)和抗生素(σ)(真皮细胞培养基)37°C, 5%的公司2,使每2 - 4周。
2.2。小鼠ESC文化
鼠标CGR8 ESCs经常培养在丝裂霉素C-inactivated MEF支线层在格拉斯哥MEM补充10%的边后卫,100μ米β巯基乙醇(Gibco), 2毫米谷酰胺,1%不重要的氨基酸,0.25% NaHCO3, 1毫米丙酮酸(σ),和1000 U /毫升的生活(Chemicon)(公司的媒介)。细胞种植在0.1%明胶(σ)涂布6-well盘子和分裂的比率1:3和1:6 - 1:8之前成为支流。两个CGR8细胞系转染GFP-expressing向量被用于各种化验;一个指定CGR8-GFP,表达GFP CAGG发起人在公司逃脱了沉默,并被用来跟踪分化和未分化cocultures制,而第二个指定CGR8 Rex1-EGFP,表达GFP Rex-1启动子的控制下,并被用来定位未分化cocultures制。制是稳定转染的雷克斯1-EGFP向量(一种礼物从n . Benvenisty博士)39),使用TransFast (Promega)按照制造商的协议。CGR8 Rex1-EGFP细胞经常保持在制MEF支线层介质与400年的周期性的重新选择μg / ml G418培养基。
2.3。制的2 d Coculture啮齿动物皮肤细胞
的CGR8 Rex1-EGFP CGR8-GFP细胞用于coculture实验。最初,啮齿动物DP、DS或科幻细胞被镀在4×105细胞每口井6-well文化板块(相同的细胞密度作为支线层mef)。Subconfluent制被播种在每个支线层。啮齿动物cocultures是通过每两天的分裂率1:6。第二组实验进行中,啮齿动物DP或DS层建立在35毫米文化菜,到500年,3000年,5000年或10000年雷克斯1-EGFP制被添加到每道菜时皮肤层达到80%融合。这些cocultures被保持长达4周没有分裂。第三组cocultures也执行但真皮细胞被播种在身体脱离制多孔膜插入(0.45μ孔隙大小,猎鹰),放在6-well包含制板。
cocultures都经常保持皮肤细胞中,没有生活,但一些样品也生长在ESC分化培养基(制中没有的生活)。至少3套真皮/ ES细胞cocultures建立,并在毛囊真皮细胞,实验重复至少6次。真皮细胞之间的通道2和通道7使用超过30%的通道1通道3。
2.4。公司文化与真皮Cell-Conditioned媒介
获得条件培养基,啮齿动物真皮细胞或皮肤/ ES细胞cocultures孵化了真皮细胞中48小时。之后,时间中收集和离心机(30分钟,3300 rpm)去除细胞碎片和上层清液储存在−20°C,以供将来使用。制被培养10天的条件培养基(CM)稀释1:1与ESC分化培养基。这些细胞的形态与制制同期的培养基培养有或没有生活。
2.5。3 d Coculture啮齿动物细胞
CGR8制和PVG鼠DP或DS细胞在三种不同比例的混合酶斯卡灵:真皮细胞(1:1,1:3,1:10)。3 d文化生成使用挂滴法;10μl滴细胞悬液在ESC分化培养基中含有大约400混合细胞被放在盖子上的细菌中(nontissue culture-treated)菜肴充满磷酸缓冲盐(PBS)。几套cocultures利用毛囊真皮细胞的染色和DiI CGR8-GFP制制和毛囊真皮细胞可以在混合文化。培养3天后,骨料被转移到细菌培养皿和维护在ESC分化培养基悬浮。分化是调查显微镜、免疫荧光和rt - pcr embryoid-like机构经过9天的文化。
2.6。公司的文化的差异
CGR8-GFP制与DP从cocultures分离或DS细胞。中被撤cocultures和细胞与PBS洗两次。30μl利用解决方案的体积(胰蛋白酶、versene和小鸡等离子体;σ)是在200年μl自动吸管提示并多次驱逐和吸气coculture直到可以看到空白的小区域的细胞层。提示的内容被排入gelatin-coated 35毫米培养皿,和细胞简要扩展公司的媒介被镀前为0.54×106每90 mm细胞生成EBs的细菌培养皿。经过短暂的暂停期,EBs可以观察到;媒介是改变每2天通过离心法EBs在800转3分钟,resuspending新鲜ESC分化培养基。EBs被暴露在不同条件下促进分化。
2.6.1。神经元分化分析
EB建立4天后,all-trans-retinoic酸(σ),在ESC分化培养基稀释,添加到悬挂文化(最终浓度为10−7米)。这是重复6天。到了第八天,大约50 EBs转移到gelatin-coated 60毫米菜肴和孵化与ESC分化培养基β巯基乙醇(禁止分化并排除中这个阶段)2天。18μ米阿糖胞苷(Ara-C)添加10天,菜被孵化进一步优化neuron-like细胞数(2天40]。对分化细胞进行了免疫细胞化学与NF200化验(12天),特定于神经纤维细丝主要抗体。
2.6.2。脂肪细胞的分化分析
这个是根据建立的方法(41)和由此产生的文化是沾油红O检测脂质(5]。
2.6.3。内胚层分化分析
6天之后形成,EBs镀到35毫米0.1% gelatin-coated菜肴和维护在ESC分化培养基。12天后,与介质的变化每隔一天,这些细胞被固定和染色白蛋白抗体和alpha-1-fetoprotein。
2.7。人类ESC和iPSC文化
人类H9 ESC的线和iPSC建立和验证在我们实验室被用于这项研究。细胞生长在mitomycin-inactivated mef和hESC包含淘汰赛DMEM培养基,100μ米β巯基乙醇,1毫米谷酰胺,1%不重要的氨基酸,20%血清替代(表达载体),penicillin-streptomycin 1%和8 ng / ml FGF2(表达载体),每日更换。
2.8。为其文化,则从人体皮肤真皮支线层
最初,mitomycin-inactivated MEF或人工DP, DS,科幻小说被播种在4×105细胞每6-well文化板块在真皮的媒介。1天之后,为其或万能被播种在每天喂食器和美联储hESC媒介。hESC iPSC细胞被孵化通道每4 - 5天1毫克/毫升胶原酶IV(表达载体)37°C或机械分离,然后删除刚做好的喂食器。文化是固定的,与硝基蓝四唑和5-bromo-4-chloro-3孵化-indolyphosphate(电视台/ BCIP)底物溶液检测碱性磷酸酶活性。对于免疫细胞化学分析,殖民地脱离他们的喂食器和播种到室幻灯片涂ESC-qualified基底膜基质在MEF-conditioned hESC媒介2天前固定和分析。
2.9。流式细胞术的为
流式细胞术分析,为其收集使用胶原酶静脉治疗(1毫克/毫升5分钟)短暂accutase孵化紧随其后。细胞悬浮在染色缓冲区(PBS + 5% FCS) 106细胞/毫升。105细胞被染色和TRA-1-60 SSEA-4(微孔),或Oct4 (Santa Cruz)抗体在10μg / ml最终浓度。几个洗进行染色缓冲区之前与二次抗体染色。细胞被洗了三次,resuspended在染色前缓冲与流式细胞仪分析了石中剑使用CellQuest (BD)。10000事件是获得每个样本,propidium碘染色(1μg / ml)被用来区分活与死细胞。
2.10。逆转录聚合酶链反应
从2 d和3 d cocultures总RNA,啮齿动物DP和DS细胞培养,公司的文化有或没有的生活,解剖触须毛囊(灯泡,mid-follicle,和上层滤泡)是准备使用完全RNA工具包(Ambion)所描述的制造商。
污染消除了基因组DNA DNase我消化(DNA-free装备,Ambion)。大约1μg总RNA从每个样本反向转录(上标2 RT,英杰公司)使用oligo-dT引物。PCR当时使用Taq执行(英杰公司)与特定的引物(表设置为每一个基因1)。PCR反应进行了如下:94°C 5分钟;20 - 94°C的周期为30年代,gene-specific退火温度为30年代,60年代和72°C;5分钟和72°C。
2.11。免疫细胞化学
培养细胞被固定在甲醇(2分钟,−20°C)或4%多聚甲醛在PBS(10分钟,室温),阻止了对非特异性结合,permeabilized 0.1% triton X孵化前初级抗体(表2)在室温下1小时或隔夜在4°C。主要抗体孵育后,细胞被冲洗在PBS和孵化与二次抗体在黑暗中在室温下1小时。彩色样本安装玻璃盖玻片下Mowiol (Calbiochem)和可视化蔡司Axiovert 135显微镜。孤立的老鼠触须毛囊被冻结在10月(琼脂科学)在液态氮或嵌入在一夜之间4°C多聚甲醛固定后石蜡。抗体绑定在石蜡包埋组织可视化使用VECTASTAIN ABC-AP工具包(山羊免疫球蛋白、向量实验室)。
2.12。骨髓基质细胞培养
小鼠骨髓基质细胞(BMSC)主要文化建立了如前所述[42]。肌力基质细胞系是一个永生化细胞系原本孤立的从德克斯特文化43]。文化是经常通过如前所述,被镀成35毫米盘子p3和p4和允许发展融合。
2.13。造血祖细胞的分离和纯化
老鼠(6 Balb / c)被颈椎错位,并从他们的股骨骨髓收集冲洗用PBS使用25 g针和1毫升注射器。红细胞被孵化细胞溶解10分钟在低渗的氯化铵溶液(7.5%)在室温下,剩下的有核细胞是通过离心收集2000 rpm在PBS和洗3次。生存能力是由台盼蓝排斥,细胞数和resuspended PBS。这些都是分为c-kit-enriched或减少人口的磁激活细胞分选仪(mac)系统(Miltenyi研究,Bergisch-Gladbach,德国)。
2.14。基质支持实验
这些实验的总结战略补充图所示S1。基质支持通道之间的实验用老鼠DP和DS 3和5作为基质层,通过与主小鼠骨髓基质细胞或肌力鼠标基质细胞系作为积极的控制。基质细胞都生长在MEM FCS为10%。支流被播种与基质层5未分离骨髓有核细胞。或者,他们被播种c-kit-enriched (MACS-bound)人口或耗尽(MACS-run通过)人口从105骨髓有核细胞。Cocultures维持28天,不依从细胞收获每七天,用于CFU-M化验。实验重复6次,细胞人数进入Excel和标准差计算使用Excel。
2.15。CFU-A化验
CFU-A化验进行本质上如前所述[44]。简而言之,支持0.5毫升0.6%琼脂层Alpha-MEM包含100 (Gibco-Invitrogen)μl每毫升的条件培养基细胞系AF1-19T (gm - csf)的来源和L929 (csf)的来源被镀成的井24-well盘子。细胞(2000 /)覆盖在0.5毫升的镀介质(相同的支持层,但使用0.15%琼脂)。板有限公司培养了20天的10%2在湿润的孵化器。实验重复6次,殖民地的人数进入Excel和标准差计算使用Excel。
3所示。结果
3.1。扩大公司Cocultured啮齿动物DP或DS细胞
当制cocultured毛囊真皮细胞(Z40或PVG血统)在皮肤细胞中,我们观察到殖民地的增长形成的未分化的制类似mef当补充了生活。制住在离散殖民地的真皮细胞单层(数字1(一),1(d)1(g))和表达EGFP的控制下Rex-1(未分化的公司的标记,数字1(b),1(e)1(h))。啮齿动物细胞没有mitotically逮捕,要么是分裂一起制每2或3天或维护作为支流层制下的殖民地。在多个实验,最长的连续coculture制与啮齿动物真皮细胞8通道或4周(取决于所使用的方法)cocultures之前被用于其他测试。制了啮齿动物科幻文化时,殖民地成为奉承以及独特的外观(图1(一)),失去了Rex-1-directed GFP表达(图1(b))和Oct4表达式(图1(c))。然而,无论coculture方法论,mES细胞生长在滤泡真皮细胞(DP或DS)显示没有明显的菌落形态(数据的损失1(d)和1(g)),或者Rex-1-directed GFP的表达(数字1(e)和1(h))或分化的证据表明的多能性标记Oct4(数字1(f)和1(我))。八个或更多通道后啮齿动物DP和DS细胞,扩大mES细胞分开他们cocultures使用rt - pcr和分析各种ES多能性和分化的基因表达标记。高水平的Oct4和Nanog表达式被发现在制DP和DS上培养的细胞,但当培养没有生活或支线层(图1(j))。制cocultured DP和DS真皮中(特别是在DS细胞)细胞不表达显著水平的分化标记等节点,GLU-R6,Brachyury,法新社,竞技场队伍在任何时候,而这些都是高度表达在胚胎分化培养基培养制第6 - 14天。
3.2。啮齿动物DP的支持作用和DS制是通过可溶性因子介导的
建立了多功能制可以维护在卵泡coculture真皮细胞的未分化状态,我们接下来研究了如果这个过程是由可溶性因子。如前所观察到的,之间有明显对比公司的维护在完成公司的媒介(密集的殖民地与几分化细胞)和那些在ESC分化培养基培养(众多形态变化)(数据2(一)和2(b))。当我们维护制从DP / ES cocultures条件真皮中,我们发现,这是最有效的保持未分化的公司形态,与DS / ES - DP -,和DS only-conditioned媒体逐渐不那么有效。然而,在所有条件培养基培养,更大比例的公司保持一个典型的公司形态比文化维护在ESC分化培养基(图2(c)),这表明由真皮细胞分泌的可溶性因子(无论是ESCs的存在和缺乏)防止的ESCs的分化。
3.3。ES细胞的表达支持细胞因子在体外和在活的有机体内
为了确定哪些可溶性因子可能参与调节公司的维护,利用rt - pcr检测记录潜在的候选人被认为与公司的支持;Nanog,Oct4,生活,据,OSM,CT-1表达了在DP、DS和BMSC曾被证明支持未分化的ESCs的扩张(13]。骨形成家族成员(BMP)也被牵连在公司的监管与生活相结合45]。BMP2在DP和DS细胞检测,而BMP4表达式在DP通常较低的细胞相比,DS和BMSC(图2(d))。培养啮齿动物DP和DS细胞表达高水平的生活,CT-1,Nanog,据比BMSC, Oct4(在低水平)和OSM表达式的BMSC,但不是在皮肤细胞。相反,Nanog表示在DP和DS细胞但没有检测到BMSC(图2(d))。
检查在活的有机体内感兴趣的细胞因子的表达,mid-anagen触须毛囊从三个Zin40解剖老鼠作为RNA的来源。据,生活,CT-1和受体组件CNTFRα表示在所有地区mid-anagen毛囊,OSM并不表示在可比水平(图2(e))。我们调查了本地化的一个子集,这些完整的毛囊细胞因子的免疫组织化学,有趣的是,我们发现生活的定位(图2(f)),并据(图2(g))不仅是局限于真皮细胞群。事实上,而不是DP和DS中高度表达,生活似乎集中在周围上皮立即DP,而据似乎更一般的分布,局部表达上三分之一的DP和更低的DS,加上高水平的上皮本地化。因为白介素家族细胞因子调查这里所有通过一个包含gp130受体复杂,我们还研究了gp130分布完整的毛囊(图2(h))。再一次,这是目前主要的滤泡上皮细胞层,与不同的表达式DP /上皮边界。特别隆起地区更高的卵泡(图2(我)),上皮细胞显示强劲gp130 immunolabelling(图2(我))。
3.4。毛囊真皮细胞在三维文化中无法避免ES细胞分化
有表明毛囊真皮细胞可以抑制公司的差异化在2 d文化中,我们接下来研究了如果他们能防止分化3 d公司的文化。EBs包含生产制只或1:1,3:1,或10:1的比例毛囊真皮悬滴制的文化。在EB文化的早期阶段(2 - 4天),它是指出,将毛囊真皮细胞倾向于调节EB的形成,与EB的包含DP或DS细胞比仅由公司,不定期的和经常不止一个EB形成在每个挂掉(图3(a))。一旦EBs被转移到悬浮培养,他们持续增长了9 - 12天,通常生产大囊肿包含cardiomyocyte-like(跳动)细胞。我们发现仍然这样不管有多少包括真皮细胞,尽管更高比例的真皮细胞通常导致更小的囊肿。毛囊真皮细胞就无法形成囊肿,而维持紧密的细胞很少或根本没有增加大小。在EBs,似乎皮肤细胞不调和,而剩余的聚合(图3(b))。令人惊讶的是,然而,在所有情况下,公司迅速长出皮肤细胞和表达分化标记没有出现在2 d cocultures(图3(c))。我们发现的生活和真皮细胞的增加越来越多的EBs可以防止这种情况(数据未显示);因此,对于所有后续的实验中,我们使用一个1:1的比例真皮:ESCs EB的形成。制迅速失去了的表情Oct4和Nanog,进一步确认未分化制没有维护,虽然生活表达没有大幅下调。我们发现分化标记表示不同的模式差异化制所示的2 d文化(比较数据1(j)和3(c), ESC),没有任何的证据GluR6表达和重大损失BMP4表达式3 d公司的文化。
3.5。Cocultured制保持分化潜力的文化
制直接分化神经元分化试验时,我们观察到的网络neuron-like细胞后12天文化。EBs Axon-like预测扩展网络,在协会与其他细胞类型坚持文化底物(图4(a))。细胞来自cocultures PVG和Z40, DP,和DS细胞都给了积极的结果在这个试验,至少65%的EBs neuron-like细胞的生产网络。
最大的数字神经发展观察细胞来自6天Z40 DS:制cocultures 90%的EBs neuron-like细胞。证实这些细胞神经丝的免疫细胞化学标记神经元,并与GFP colocalization还证实,他们来自制(图4(b))。
在脂肪细胞分化试验,制隔绝PVG Z40, DP, DS cocultures给持续积极的结果。在实验文化,油红O染色显示小脂滴和大型lipid-filled补丁从几个细胞到细胞50细胞紧紧挤在一起(图4(c))。大约有30%的每种文化表现出高水平的脂质沉积。
从所有cocultures内胚层分化试验,制给了积极的结果。小集群GFP-positive CGR8-GFP细胞免疫反应性的白蛋白(图4(d)和alpha-feta-1-protein(图)4(e))。正如所料,这些由不超过总数的1%的细胞群。
3.6。维护为其与细胞则通过毛囊真皮料层
证明制后保持coculture处于未分化状态的毛囊真皮细胞,我们接下来问人类毛囊真皮细胞可以作为有效的为其喂食器和万能。当我们培养为人类DP mitotically不活跃或DS喂食器多个段落,高水平的SSEA-4, TRA-1-60, OCT4表达和维护由流式细胞术(图5(a))。尽管所有DP和DS线测试能够保持为表达高水平的这些标记,很明显,一些线路比其他人更有效。的Immunolabelling DP-supported为NANOG抗体和OCT4显示染色水平相当于那些为其培养mef(数据所示5(b) -5(e))。随后,当我们培养的人类细胞则mitotically灭活mef(数字6(一)-6(d)),人类科幻(数字6(e) -6(h))、DP(数字6(我)6(左))或DS(数字6(m) -6(p)),我们发现,他们保持了典型hESC-like出现毛囊真皮喂食器,在离散核胞质比高的殖民地。iPSC生长在mef, DP,或DS喂几个段落仍为多能性标记碱性磷酸酶阳性,Tra-1-60,交易- 1 - 81。相比之下,失去了表达这些标记的细胞则在短时间内增长interfollicular科幻喂食器。
3.7。毛囊真皮细胞造血祖细胞的支持
所有基质细胞类型似乎支持造血的细胞,所表示的典型的鹅卵石形态的细胞表面的文化(补充图S2)。
细胞计数显示,DP和DS文化至少有效骨髓基质和肌力细胞系在支持coculture不依从的增殖细胞实验(图7(一))。这是特别的情况未分离或c-kit-enriched人群。流式细胞术与CD45证实造血的细胞产生(数据未显示),但这可能是由于成熟细胞的有丝分裂。为了调查认为造血祖细胞是否被支持的基质文化,不依从细胞受到殖民地使用CFU-A化验。图7 (b)表明CFU-A殖民地的数量与DP coculture后或DS文化似乎比从传统Dexter-type骨髓基质细胞培养。这增加造血的祖c-kit-enriched人口数量尤其明显。
(一)
(b)
4所示。讨论
最初的假设当前的工作是毛囊真皮细胞,cocultured多能ESCs时,可能会沿着血统的滤泡上皮细胞诱导分化。毛囊真皮细胞的诱导力已经被很好地记录下来了(1,2]。Nonfollicular上皮与DP时将形成毛囊细胞或胚胎从毛皮肤真皮3,4),展示能力的DP细胞直接分化的细胞在附近,被认为是他们在成人毛囊生理作用1,46]。在我们的手中,老鼠触须毛囊毛乳头细胞失去这种感应能力4通道在文化47]。已经表明,ESCs区分在真皮和表皮血统生产组织与胚胎皮肤暴露在皮肤成纤维细胞(产生的因素48];它似乎合理的假定毛囊真皮会诱导分化以及卵泡血统。与工作假说,毛囊真皮细胞保持啮齿动物和人类的ESCs和处于未分化状态的细胞则长期coculture之后。作为预处理和postinductive鼠真皮乳头文化同样显示,影响胚胎干细胞,看来这种现象并不与损失DP-inductive属性。公司生产的殖民地,在混合cocultures或文化ESCs的真皮和没有联系,都是相同的那些由生活或一个MEF支线层(经TEM(数据未显示),免疫细胞化学,rt - pcr,和雷克斯1-EGFP CGR8细胞)。人类和老鼠的ESCs保留高水平的内在Oct4 Nanog表达式,来维持多能性在活的有机体内和在体外(49- - - - - -51]。人类卵泡细胞真皮馈线上培养的细胞则还保留了高水平的细胞表面抗原Tra-1-60和交易- 1 - 81,相当于则生长在MEF表达的水平,证明未分化的细胞则可以有效地维持毛囊真皮细胞(DP和DS)。这些标记的未分化为其迅速消失在分化(52),就像看到当细胞种植在控制纤维母细胞支线层。我们还表明,公司保留他们的多能性通过执行差异化coculture化验后诱导分化成细胞细胞系来源于三种微生物层。观察,在3 d coculture,毛囊真皮细胞无法防止ES细胞分化的典型拟胚体反映了强大的3 d环境的影响ES行为和事实有种族隔离的结构中两种细胞类型。也可能在3 d,真皮细胞有不同的分泌。
制的行为暴露在皮肤细胞——在2 d或coculture-conditioned媒体,或在文化细胞被0.45物理分离μM过滤器,表明可溶性因素出现在媒体由皮肤分泌的细胞(包括ESCs的存在和缺乏),与抑制分化的能力。类似的研究发现可以保持未分化MEF-conditioned介质分泌因素为其没有馈线的细胞(53]。细胞因子白介素家族的四个成员(生活,据CT-1, OSM)已被证明保持未分化制在体外通过LIFR gp130 / STAT通路(24,54- - - - - -58]。因此,我们审问的mrna文化,发现记录的三种细胞因子,生活,据,CT-1被发现在皮肤细胞。此外,我国已知与制药业合作来维持公司的多能性(45),和BMP2 BMP4毛囊真皮细胞培养检测。我们还发现,培养DP和DS表达Nanog,生活/ STAT3通路的下游效应在维护公司的多能性(49]。此外,能保持未分化为没有馈线细胞的存在高水平的Nanog [51]。这些细胞因子的表达在体外提出了有趣的可能性,他们可能发挥功能作用在活的有机体内。本地化的制药业和据卵泡结束灯泡表明他们是生理有关。过去的研究认为他们是发起人和抑制剂的分化和增殖27,24,54- - - - - -57,59- - - - - -61年),过程主要发生在卵泡结束灯泡,是毛囊的循环性质的关键活动。此外,我们注意到强烈隆起地区gp130表达式的毛囊外根鞘,这房子主要的毛囊上皮干细胞群。然而,细胞因子表达的相对缺乏毛囊的毛乳头细胞的灯泡,但的存在生活,据,CT-1mid-anagen卵泡的mRNA在所有领域,表明毛囊内广泛的函数,而不是一个特定的角色在滤泡上皮干细胞的维护。同样,的表达CNTFRα信使rna在卵泡表明,il - 6的家人不太可能具备干细胞的具体参与维护周围的滤泡上皮细胞的真皮。看来真皮细胞的机制支持ES细胞维护没有明显的相似之处与滤泡上皮干细胞活动的监管。上述细胞因子的贡献毛囊生物学的各个方面还有待充分定义虽然有报道gp130 / JAK / STAT通路之间的连接和毛囊活动。白细胞介素- 6本身已经与头发生长抑制和滤泡回归(62年,63年]。此外,在小鼠,JAK-STAT3信号需要自发的生长期的开始64年]。Stat5激活毛囊的DP最近被证明引发毛囊进入成长阶段(生长期)[65年],我们中的一个(AMC)最近表明,药物抑制JAK / STAT通路诱导休息(静止期)毛囊的生长期,(66年]。
消除动物材料在推导和长期为其文化或细胞则是一个重要的目标之前,这些细胞临床治疗中的应用。动物喂食器和血清风险非人类病原体对人类细胞的介绍和转移,提高移植排斥的风险当细胞引入患者(67年,68年]。
广泛的支线细胞类型的媒体,feeder-free系统(已被调查25,34),包括xeno-free系统推导为使用人类血清和人包皮成纤维细胞支线层(69年]。人体毛囊真皮细胞可以同样用于hESC推导和长期维护。此外,最近的细胞则来自老鼠的毛囊DP细胞使用单个转录因子(70年),则是从人类毛囊DP细胞(71年]。最近的一份报告表明,人类毛囊真皮(间质)细胞维持他在一个未分化的条件72年]。我们的工作支持这一发现和扩展了人类“诱导多能性”细胞。因此,毛囊真皮细胞可能平行人类和小鼠脂肪细胞的特性,可以用来建立万能feeder-independent方式和馈线细胞支持不同的多能干细胞(73年]。
先前的研究显示强烈的相似之处毛囊真皮细胞和骨髓细胞(17]。因此,我们的研究结果,毛囊真皮细胞支持造血作用在一定程度上令人吃惊。然而,真皮细胞显然是相当于甚至优于骨髓细胞基质支持。因为我们之前证明培养毛囊真皮细胞可以产生殖民地CFU-A化验和恢复辐照小鼠的造血作用8),这就提出了一个问题,在多大程度上毛囊真皮细胞对造血的池。这不是探索,需要未来的工作。尽管如此,脂肪msc也被报道支持造血作用优于骨髓细胞(74年]。脂肪细胞的一个特征是他们表达CXCL12 (SDF-1)造血作用的主要监管机构,也强烈表达的培养毛囊真皮细胞(见附加图S2)。这将是惊人的,如果毛囊真皮细胞被经常采用的支持人类细胞多能给旅行的方向朝着feeder-free方法(25- - - - - -31日)和替代人类的候选细胞类型的可用性32- - - - - -35]。然而,毛囊真皮细胞实现重要的标准,包括被便利,容易传播,有效地保持未分化为。此外,哪里有一个支持细胞移植的临床作用,如造血作用[74年,75年),毛囊真皮细胞有优势。这些细胞被剥削的过程中用于生产新毛囊治疗脱发和改善皮肤移植的创建。因此,这些细胞的生物工艺安全工作为临床移植已经在火车,让他们最终的上下文中使用干细胞支持一个更合理的命题。
5。结论
在这里,我们表明,coculture ESCs的毛囊真皮细胞或细胞则可以支持他们的长期维护。我们进一步表明,滤泡细胞支持造血的活动。这可能潜在好处在临床情况下,动物的消除支线层是必要的应用程序之前的多能细胞治疗和应用间充质干细胞的数量超出自己的直接治疗用途,包括作为支持细胞其他移植细胞类型的角色。
缩写
| DP: | 真皮乳头 |
| DS: | 真皮鞘 |
| ESCs: | 胚胎干细胞 |
| 制: | 鼠标的ESCs |
| 则: | 诱导多能干细胞 |
| EBs: | 拟胚体 |
| CM: | 条件培养基 |
| 伴着: | 骨髓基质细胞 |
| MEF: | 小鼠胚胎成纤维细胞。 |
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
刘骏,克莱尔·a·希金斯和珍娜·c·怀特豪斯贡献了同样的生产。
确认
作者感谢博士的n . Benvenisty遗传学在希伯来大学,耶路撒冷,以色列,礼物的雷克斯1-EGFP向量和皮肤的支持基金会的克莱尔·a·希金斯()和NYSTEM(安吉拉·m . global)。作者感谢阳光容和鑫张的帮助和亚当·吉尔摩阅读手稿。这项工作是由一个医学研究理事会资助(G1000846)科林·a·B·Jahoda额外的支持生物技术和生物科学研究委员会(BBS / B / 14458)和科林·a·B·Jahoda尼古拉斯洞。
补充材料
补充材料包括示意图说明方法和过程用于支持造血的化验和rt - pcr标记表达式显示相似毛囊真皮细胞和骨髓细胞。特别是,都表达基质细胞衍生因子1 (SDF-1)在造血作用具有重要的作用。补充图S1:示意图显示策略用于比较的支持毛囊真皮细胞和骨髓基质细胞的血细胞。补充图S2: rt - pcr表明造血的环境的重要标志,包括血小板反应蛋白- 1,V-CAM 1和SDF-1表示在骨髓基质细胞(BM) S-17永生的基质细胞培养线,毛囊真皮乳头(DP)和真皮鞘细胞(DS)(两种如图所示)。(补充材料)