转录组和DNA Methylome Triclosan-Induced心肌细胞分化过程中动力学毒性

文摘

心脏的发展是一个动态的过程,对环境敏感的化学物质。三氯生是广泛使用的抗菌剂和报道运输在胎盘和影响胚胎发育。在这里,我们使用人类胚胎干细胞(hESC)派生的心肌细胞(CMs)来确定TCS暴露心脏发展的影响。TCS治疗后,分化过程明显阻塞和自发的跳动CMs的利率也降低了。转录组分析显示,cardiogenesis基因的失调,包括GATA4和TNNT2。此外,DNA甲基化也改变了TCS曝光,尤其是在那些地区GATA主题浓缩。这些改变的转录组和DNA甲基化都是与信号通路相关积分心发展。我们的发现表明TCS暴露可能导致心肌细胞分化毒性和提供新的深入了解环境因素调节心脏发育期间DNA甲基化和基因表达。

1。介绍

心脏是一个动态的发展过程,发生复杂的转录程序和信号通路1]。Cardiomyogenesis正是由顺序控制基因调控措施,在心脏转录因子早期规范过程中发挥重要作用[2]。表观遗传修饰尤其是DNA甲基化起着至关重要的作用在调节心脏发展基因的转录3]。最近的研究表明,异常的DNA甲基化模式与心脏病有关(4]。

人类胚胎干细胞(为),分化成心肌细胞的能力(CMs)在文化、作为在体外模型探讨分子胚胎心脏发育的过程。最近的数据表明,这种分化过程概括胚胎cardiogenesis的类似的发展模式在活的有机体内(5]。hESC-derived CMs有心脏基因,蛋白质,和形态结构,因此可以正确地预测环境因素包括化学物质的毒性。

三氯生(TCS),作为广谱抗菌药物,广泛应用于家庭和个人护理产品(pcp),如肥皂,牙膏和除臭剂。它是最常检测和高度集中的化学物质在环境和人类6]。TCS被发现在人类样本包括尿液、血清、血浆、和人类母乳7,8]。TCS的浓度在人类是好几个μ-3620年(范围:< 2.3 g / L水平μg / L) (9]。研究表明,TCS会通过胎盘运输并进一步影响胎儿发育(7,10]。被检测出含有高水平的TCS的孕妇。在最近的一项研究中,TCS在孕产妇尿样中值为21.6μ0.1 g / L (~μ米)(11]。TCS的最大水平预计将达到299人μg / L (~ 1μ米)在怀孕期间产妇尿12]。这项研究还显示,产妇血清和脐带血清配对之间的正相关关系。TCS水平增加产妇血清中发现异常有显著相关性出生包括心脏病和心力衰竭,但潜在的分子机制影响心脏的发展仍不清楚。

在目前的研究中,调查TCS暴露是否会引起心脏毒性在胚胎发育期间,hESC-based心脏分化模型被用来探索TCS的潜在影响。有趣的是,我们发现TCS接触抑制的分化为成CMs和自发的跳动的CMs。通过基因表达和DNA甲基化分析,我们注意到,TCS暴露CM标记基因表达和DNA甲基化的影响。我们的研究结果将为表观遗传信息在TCS的毒性机制。

2。方法

2.1。H9为其分化成CMs

H9为,购自上海生物化学与细胞生物学研究所,中国科学院,被播种到1% matrigel-coated 6-well盘子mTeSR1介质(干细胞技术,猫。不。05850),80 - 90%的融合。H9为其培养和分化成CMs通过使用monolayer-based定向分化协议如前所报道(13]。简而言之,序贯治疗Gsk3抑制剂和Wnt信号抑制剂进行刺激cardiogenesis。H9培养在mTeSR1接触CHIR99021(谢立克,前4天猫。不。S1263)天0和IWR-1(σ,猫。不。I0161)第三天RPMI / B27没有胰岛素介质(生活技术,猫。不。A1895601)。文化媒体取代RPMI / B27介质从7天到20天。 Differentiation was determined by microscopical inspection of cells starting at day 8 of differentiation. Cardiac mesoderm cells could spontaneously develop into functional contracting CMs.

2.2。TCS治疗

TCS(≥97.0%)是获得Sigma-Aldrich有限公司(圣路易斯,密苏里州,美国)。《创世纪》评价TCS的影响在厘米,TCS在浓度为1μM添加0天的区别。H9受到一个21天的分化过程与TCS或车辆控制(DMSO溶液,0.1%v/v)治疗。TCS的最终浓度分化试验中使用的是基于我们初步的细胞毒性试验结果。

考察形态学上的变化,每天在显微镜下拍摄的。自发的跳动的CMs记录使用视频摄像系统在倒置显微镜下。描述的结构H9-derived CMs,疣状心肌肌钙蛋白T (cTnT)和sarcomericα辅肌动蛋白。对于心脏分化率的评估,NKX2.5表达水平检测。短暂,CMs与多聚甲醛固定,permeabilized Triton x - 100的0.1%。然后CMs与初级抗体cTnT孵化(生活技术,猫。不。与抗体一起ma5 - 12960)α辅肌动蛋白(Sigma-Aldrich猫。不。A7811)或抗体NKX2.5(细胞信号技术,猫。不。8792)在4°C一夜之间,其次是二次抗体孵化。个别和合并图像检测的信号进行使用荧光显微镜(奥林巴斯、东京、日本)。每组的荧光细胞的密度是量化和计算通过使用ImageJ软件。相对强度值控制和暴露组之间的比较。总的来说,心脏分化功能,形态,CMs的打击率是TCS-treated和对照组之间相比。所有实验至少重复三次,和提供的图片代表典型的结果。

2.3。全基因组甲基化分析

在20天的分化,细胞在文化随后丰富商业厘米净化设备(Cellapy,北京,中国,猫。不。CA2005100)。然后收集的DNA纯化厘米。英飞纳姆MethylationEPIC BeadChips被用于的决心超过850000 CpG甲基化水平的网站。Bisulfite-treated DNA样本根据Illumina公司提供的协议处理。的BeadChips Illumina公司HiScan平方扫描仪进行扫描,和原始数据导入GenomeStudio提取强度。探针位于性染色体和检测大于0.01的值在一个或多个样本删除。我们也排除探头,映射到多个地方bisulfite-converted基因组或重叠的位置已知的snp。甲基化数据处理用冠军包(14]。甲基化的信号强度和unmethylated州规范化使用beta-mixture分位数正常化(BMIQ)算法(15]。在每个CpG网站,被报道的甲基化水平价值和范围从0 (unmethylated)到1(甲基化)。

2.4。DNA甲基化数据分析

原始数据处理了冠军(14]。差异甲基化区域(dmr)被Bumphunter计算,这将首先探讨小所有区域集群和应用随机突变的方法找到dmr [16]。在这项研究中,我们选择识别dmr包含超过5探针1 kb的差距。使用执行功能注释的分析dmr荷马(17),连接dmr到最近的基因。基因本体论分析是由大卫[18,19]。

2.5。核糖核酸测序和分析

在20天的分化,细胞在文化随后丰富商业厘米净化装备。厘米RNA提取了RNeasy工具包(试剂盒、德国)和DNase对待我(生活技术,美国)根据标准协议。RNA序列使用TruSeq滞留在Novagene mRNA图书馆准备(Novagene,中国)。短暂的、完整的RNA是支离破碎的,修理结束,适配器的结扎和PCR扩增后Illumina公司协议。库被Illumina公司HiSeq 2000测序。质量控制后,序列数据被处理明星(20.)生成与hg19读对齐。原始读计数获得了带注释的基因与featureCounts默认设置(21使用DEseq2[]和规范化和分析22]。实时PCR用于验证RNA-seq数据。

2.6。统计分析

TCS对心脏的影响分化的日期表示为均值的平均值±标准误差(SEM)。统计比较TCS-treated和对照组由学生决定t以及。所有使用SPSS统计分析软件,版本16.0(美国芝加哥SPSS Inc .)。差异 被视为具有统计学意义。DNA甲基化和RNA-seq所有统计测试进行了R(3.1.1版)。DNA甲基化与基因表达验证,所有数据都表示为平均值±标准偏差(SD)和学生的t以及采用估算的意义TCS-treated患者与对照组之间的差异。

3所示。结果

3.1。TCS接触抑制hESC分化CMs

在当前实验过程,H9为其成功地分化成承包CMs在体外。第一个击败集群之间观察到的细胞每天8和10。我们发现超过80%的CMs年底得到分化在对照组,而CMs在TCS-treated集团也获得了60%左右。期间为其分化的形态变化为在显微镜下检查、拍照。可以通过cTnT评估和心脏结构α辅肌动蛋白。在分化过程中,肌节结构可视化了α辅肌动蛋白和cTnT H9-derived CMs的疣状。结果表明,大多数细胞cTnT和文化是积极的α辅肌动蛋白。TCS-treated细胞之间没有显著差异,形态学观察和控制细胞。Immunolabeling这些肌丝蛋白质表明组织sarcomeric结构同样发达TCS和对照组(图1、补充材料图S1)。

评估TCS在心脏分化的影响,我们固定整个执行的细胞和免疫染色量化NKX2.5-positive地区的平均面积为每个在20天。与对照组相比,TCS暴露的表达水平显著地抑制NKX2.5(图2(一个)、补充材料图S2)。我们还利用免疫印迹识别NKX2.5蛋白的表达。结果证实,NKX2.5蛋白质水平降低TCS-treated组(补充材料,图S2)。这表明,持续暴露在TCS在1μ可以从为分化抑制厘米。自发收缩CMs最初观察到8天在整个时间进程,逐步扩大。健壮的打击发生在12天。TCS显著抑制了CMs的分化特点是CMs的打击率下降。每分钟48次控制细胞相比,每分钟心率降低到27倍后TCS曝光(图2 (b))。

3.2。TCS暴露改变CM转录组

为了理解TCS暴露如何影响CMs的转录组,我们开展RNA-seq TCS和控制组织和2163个差异表达基因(度),其中包括917调节和1246个表达下调与褶皱变化度> 2和罗斯福< 0.05,确定了使用DESeq2 TCS组与对照组比较(数字3(一个)和3 (b);补充材料,表S1)。代表UCSC基因组浏览器拍摄的标记表明厘米分化明显压抑TCS-treated组(数字3 (b)和3 (c))。探讨可能的生物功能重要度,我们进行基因本体分析。我们的结果证明了度明显富含基因异常的心脏发展途径,包括arrhythmogenic右心室心肌病、扩张型心肌病、肥厚性心肌病(图3 (d))。除此之外,其他信号通路参与厘米分化也丰富度包括鉴定及信号通路。这些结果表明,在分化为CMs,基因表达模式受到TCS暴露的影响。

3.3。在CMs TCS的DNA甲基化模式

DNA甲基化是一个过程,添加一个甲基胞嘧啶的C5位置DNA甲基转移酶(DNMTs),这是一种重要的表观遗传修饰在CM分化(23]。探讨微分DNA甲基化在TCS和对照组之间,我们执行Illumina公司史诗BeadChip,其中包含850000 CpG网站。TCS的全基因组甲基化水平和对照组被显示在图4(一)。CpG甲基化水平平均在1 Mbp windows和表示为直方图跟踪。没有全球转向不足或甲基化TCS治疗后(图4(一))。生物功能已报告与基因组区域而不是单个CpG一般(24]。为此,我们使用Bumphunter识别差异甲基化区域(dmr) TCS和对照组之间。TCS治疗后我们发现只有细微的差别。完全,我们生成一个强大的列表,1203与424年dmr hypomethylated地区和779个hypermethylated地区与罗斯福< 0.05(图4 (b)、辅料表S2)。

接下来,我们分析了保护TCS-related dmr和底层这些dmr守恒在胎盘类哺乳动物的DNA序列(图4 (c)),这表明这些dmr有重要作用。不足的总体布局模式和hyper-DMRs TCS和对照组之间(图相似4 (d))。发起人dmr的多数是丰富,建议他们的角色在调节基因表达(图4 (d))。DNA甲基化改变启动子附近地区将会改变DNA序列的转录因子,这可能会影响基因表达(25]。为了识别潜在的转录因子结合TCS-related dmr,我们使用霍恩预测假定的转录因子结合位点。我们发现一些在dmr包括GATA转录因子结合位点是丰富了家庭成员,据报道调节分化的CMs(图4 (e))。符合DMR分析、GATA3和GATA4也TCS治疗后表达下调。附近的基因功能注释dmr演示了信号通路的发展浓缩,包括发展过程、解剖结构的发展,和多细胞有机体的发展(图4 (f))。这些研究结果表明,TCS治疗受损DNA甲基化在CM开发的调优。

4所示。讨论

人类心脏CM-related基因的开发需要微调,以及其他关键基因,和环境因素敏感3]。作为广泛使用的抗菌剂,TCS导致了全球分销和检测在各种环境和人类体液(尿液、血清、血浆、母乳和脐血)。流行病学和动物研究表明,TCS暴露的风险增加发展疾病(8,26,27]。TCS可以跨胎盘运输和高潜力embryo-fetal发育毒性通过孕产妇曝光。我们之前的研究也表明,TCS暴露引起自然流产通过影响胎盘功能(8]。一些报道证实,TCS暴露与心脏病和心力衰竭。暴露于400年μ1.4 g / L (~μ米)TCS引起心率和减少导致更多的实质性影响舒张末期容积,中风容积和射血分数在斑马鱼28]。我们以前的研究也表明300的结果μg / L (~ 1μ米)TCS在斑马鱼和1引起心血管毒性μM TCS可以抑制cardiogenesis在老鼠胚胎干细胞。然而,TCS接触发展和心脏缺陷之间的关系还不清楚。通过集成的转录组分析和DNA methylome,我们发现TCS可以阻止CMs的形成为其通过影响CM-related基因表达和DNA甲基化。我们的发现强调了TCS对心脏发育关键基因的影响。

在我们之前的研究中,我们已经发现,TCS暴露影响的扩散制(29日]。在最近的研究中,探索背后的机制分化相关的环境中级别的毒性TCS-induced厘米,1μM TCS是用作测试浓度。这也是大多数使用的浓度实验,检查TCS对细胞的影响。TCS,心脏分化率有显著影响。此外,自发地击败CMs的利率也降低了TCS组。同意这些表型的mRNA水平ACTC1 TCS曝光后显著降低。ACTC1,心脏α肌动蛋白基因,据报道在零星的扮演角色先天性心脏病(CHD) [30.]。此外,这是一个转录因子GATA4 cardiomyogenesis的重要调节器,TCS曝光后也减少。GATA4能够调节目标基因的CM跳动(31日]。推倒在制Gata4 cardiomyogenesis导致Sox7表达降低,心肌细胞分化[31日]。

DNA甲基化是表观遗传机制,调节基因的表达(23]。我们试图确定与分化相关的DNA甲基化的CMs和识别潜在的生物标记物TCS曝光。在CMs全基因组DNA甲基化分析,我们有一个整体看DNA甲基化的基因调控。多数TCS-related dmr守恒和启动子附近,这表明基因法规的dmr的角色。此外,我们的研究发现,甲基化的dmr GATA4附近和TNNT2可能下调TCS暴露后的表情。

总的来说,我们已经表明,hESC-derived CM模式使定量筛选的潜在毒性化学物质环境的变化分析厘米可行性,收缩性,基因表达和表观遗传修饰。研究人员可以有效地检测心脏的形态学和遗传毒性毒物在短期实验。一个限制在我们的研究中,我们利用一个hESC线。细胞诱导条件的差异和表观遗传因素可能影响的分化能力为CMs,这可能会限制它们准确地预测毒性的能力。在未来的研究中,使用不同的hESC线和多个时间点化验需要提供更多的洞察化学品的毒性。

5。结论

总之,通过结合DNA methylome和转录组分析TCS曝光后,我们观察到转录组的动态变化和DNA methylome CMs。我们的研究开辟新的途径TCS暴露如何影响心脏开发和提供新的深入了解环境因素调节DNA甲基化和基因表达式。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Guizhen Du和明明Yu同样研究做出了贡献,他们应当被视为共同第一作者。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(81402706)、江苏省自然科学基金(14 kjb330002 BK20181366),实践和创新为江苏省大学生培训项目(201710312056 x)和优先级的学术项目发展的江苏高等教育机构(公共卫生和预防医学)。

补充材料

补充1。图S1:结构表征TCS-treated H9-derived CMs的对照组。

补充2。图S2:评估NKX2.5表达式在TCS-treated H9-derived CMs和对照组。

补充3。表S1:基因表达在TCS-treated H9-derived CMs和对照组。

补充4。表S2:差异甲基化区域在TCS-treated H9-derived CMs和对照组。

引用

1. j . h . van Weerd k . Koshiba-Takeuchi c . Kwon和j·k·竹内,“表观遗传因素和心脏发展。”心血管研究,卷91,不。2、203 - 211年,2011页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
2. m . s . Parmacek和j·a·爱泼斯坦“心肌细胞分化的表观遗传的路线图,”循环研究,卷112,不。6,881 - 883年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
3. n y顾,g . h . Liu Plongthongkum et al .,“全球人类ESC-derived心肌细胞的DNA甲基化和转录分析,“蛋白和细胞,5卷,不。1,59 - 68年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
4. s·r·马丁内斯,m . s .同性恋和l .张“表观遗传机制对心脏发育和疾病,”药物发现今天,20卷,不。7,799 - 811年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
5. k·r·Boheler j . Czyz d . Tweedie h·t·杨和a . m . Wobus的美国诉阿尼西莫夫”多能胚胎干细胞的分化成心肌细胞,”循环研究,卷91,不。3、189 - 201年,2002页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
6. c . f . Wang和y田”,三氯生生殖内分泌的影响:人口暴露来说,目前的证据和潜在的机制,”环境污染卷,206年,第201 - 195页,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
7. m . Allmyr m . Adolfsson-Erici m . s .克劳克兰,和g . Sandborgh-Englund“三氯生在等离子体和牛奶从瑞典哺乳期妇女通过个人护理产品和他们的接触,”科学的环境,卷372,不。1,第93 - 87页,2006。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
8. 陈x, x, x冯et al .,“三氯生引起自然流产伴随着雌激素下降sulfotransferase活动在人类和老鼠,”科学报告,5卷,不。1,2015。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
9. m·a·Adgent和w·j·罗根三氯生和处方抗生素暴露和enterolactone生产在成人中,“环境研究卷,142年,第71 - 66页,2015年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
10. k·b·保罗j . m .对冲,r·邦萨尔et al .,“早期发育三氯生暴露减少孕产妇、胎儿和新生儿甲状腺素:一个动态公认的作用方式和动态评估,”毒理学,卷300,不。1 - 2,页31 - 45岁,2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
11. l·韦斯·t·e·阿尔布克尔·m·费舍尔et al .,“颞可变性和三氯生的接触源在怀孕,”国际卫生和环境卫生杂志》上,卷218,不。6,507 - 513年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
12. b·f·g . Pycke l·a·吉尔·m·Dalloul o .阿布拉菲亚,a . m . Jenck和r·哈尔登,“人类胎儿接触三氯生和triclocarban城市人口来自布鲁克林,纽约,”环境科学与技术,48卷,不。15日,第8838 - 8831页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
13. x丽安,j·张,s m . Azarin et al .,“从人类多能干细胞向心肌细胞分化调节Wnt /β-catenin信号完全定义的条件下,“自然的协议,8卷,不。1,第175 - 162页,2013。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
14. y, t·j·莫里斯,a·p·韦伯斯特et al .,“冠军:甲基化分析管道Illumina公司BeadChips更新,“生物信息学,33卷,不。24日,第3984 - 3982页,2017年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
15. A . e . Teschendorff f . Marabita m·莱希et al .,“beta-mixture分位数规范化方法纠正探针设计偏差Illumina公司英飞纳姆450 k DNA甲基化数据,”生物信息学卷,29号2、189 - 196年,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
16. a·e·贾菲p .村上h·李et al .,“撞狩猎识别差异甲基化区域在表观遗传流行病学的研究中,“国际流行病学杂志第41卷。。1,第209 - 200页,2012。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
17. 美国亨氏,c·本纳n Spann et al .,“简单的组合lineage-determining转录因子主要基因元素巨噬细胞和B细胞所需的身份,“分子细胞,38卷,不。4、576 - 589年,2010页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
18. d . w .黄、b·t·谢尔曼和r . a . Lempicki”系统和综合分析大量基因列表使用大卫生物信息学资源”自然的协议,4卷,不。1,44-57,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
19. d . w .黄、b·t·谢尔曼和r . a . Lempicki“生物信息学浓缩工具:路径向大型的综合功能分析基因列表”核酸的研究,37卷,不。1,1-13,2009页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
20. 多布林,c·a·戴维斯f·施莱辛格et al .,“明星:超速普遍RNA-seq对准器,”生物信息学卷,29号1、15至21,2013页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
21. y辽、g·k·史密斯和w·史”featureCounts:一个有效的通用程序分配顺序读取基因特性,”生物信息学,30卷,不。7,923 - 930年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
22. 麻省理工学院爱、w·胡贝尔和s .安德斯”主持估计与DESeq2 RNA-seq褶皱变化和分散的数据,”基因组生物学,15卷,不。12,550页,2014年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
23. d . m . Messerschmidt比比诺尔斯,d .你“DNA甲基化动力学在生殖和胚胎植入前的胚胎,表观遗传重编程”基因与发展,28卷,不。8,812 - 828年,2014页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
24. a·j·斯文森主持k . Gervin r·莱尔et al .,“差异甲基化DNA地区同卵双胞胎不和谐的类风湿性关节炎:一个epigenome-wide研究,“免疫学前沿7卷,2016。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
25. r·e·瑟曼e . Rynes r·亨伯特et al .,“可访问的人类基因组染色质景观”,自然,卷489,不。7414年,第82 - 75页,2012年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
26. m . s . Jackson-Browne g . d . Papandonatos a . Chen等人“识别脆弱时期的神经毒性暴露于三氯生的孩子,”环境健康展望,卷126,不。5日,第057001条,2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
27. f·欧阳:唐,h . j . Zhang et al .,“产妇尿三氯生水平,妊娠糖尿病和出生体重在中国女性,”科学的环境卷,626年,第457 - 451页,2018年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
28. a . Saley m·赫斯k·米勒,d·霍华德和t . c . King-Heiden“发展中斑马鱼的心脏毒性的三氯生,”斑马鱼,13卷,不。5,399 - 404年,2016页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
29. x、b . Xu x汉et al .,“三氯生的影响在小鼠胚胎干细胞的多能性因素和发展斑马鱼,”档案的毒理学,卷89,不。4、635 - 646年,2015页。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
30. 江h·k·g·r·秋j .礼乐n .鑫和k . l .太阳”ACTC1表达减少可能在先天性心脏病的发病中发挥作用,诱导心肌细胞凋亡,”循环杂志,卷74,不。11日,第2418 - 2410页,2010年。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索
31. b . a . Afouda a·t·林奇e . de Paiva阿尔维斯和脚栓,“全基因组转录组分析确定sox7和sox18特别受gata4 cardiomyogenesis,”发育生物学,卷434,不。1,第120 - 108页,2018。视图:出版商的网站|谷歌学术搜索

版权

版权©2018 Guizhen Du et al。这是一个开放的分布式下文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,提供最初的工作是正确引用。