从脐带血Gammadelta T细胞的扩张:治疗的可能性

文摘

Gammadelta (γδ)T细胞在血液和组织和抗病毒和抗肿瘤特性。的频率γδ在脐血T细胞(UCB)很低,多数表达δ1,与此形成鲜明对比的是血,而主要是δ2子集γ9 T细胞。UCBγδT细胞在功能上是不成熟的,连同他们的短缺使药的发展γδT细胞疗法。我们旨在建立一个有效的扩张UCBγ的协议δ基于zoledronate和2 T细胞。我们发现,文化与5μM zoledronate 200国际单位/毫升- 2 14天提升媒介广泛扩散。大多数培养细胞γ9δ2 T细胞。最初的褶皱扩张,罕见,子集令人印象深刻(中值和最大褶皱变化253年和1085年,分别地)。培养后,细胞多克隆γδT细胞剧目和主存储器是中央内存(CD45RO子集⁺CD27⁺)。细胞产生的细胞因子如IL-1B, 2,引发并显示重要tumor-killing能力。这些结果表明,开发的在体外扩大联合银行γδT细胞疗法是可行的。它可能是一个有价值的治疗患者脐血移植后的形态。

1。介绍

γδT细胞构成一个独特的小族群的T细胞。他们的天然免疫与适应性免疫功能将它们之间的1),包括抗原识别独立的主要组织相容性复合体(MHC)的演讲中,细胞因子的生产,和细胞毒性2- - - - - -4]。

在人类中,有很多的子集γδT细胞,由特定的细胞受体的结合γ和δ链。主要的γδ在外周血T细胞群(PB)表达细胞包含δ2,γ9链(4]。这个子集,称为δ2γ9 T细胞,承认phosphoantigens,磷酸化nonpeptidic类异戊二烯生物合成的代谢中间体(5]在入侵的微生物和人体自身的细胞,以MHC-unrestricted的方式(4,6]。内生phosphoantigens在细胞失调,调节状态,可以造成感染或恶变,牵扯的关键因素γδT细胞肿瘤识别(4,7,8]。这表明一个角色δ2γ9 T细胞抗癌免疫力。

另一个重要γδT细胞表达了子集δ1链是主要在胸腺和外围组织。这些γδT细胞被认为是认识到各种与压力相关的抗原,其中大部分是无特征。已知特异性蛋白质包括CD1家庭(9)、云母和MICB [10,11]。

γδT细胞占大约5%的循环T细胞在成年PB (12),但舱可以大幅增加在某些情况下(13,14]。在脐血(UCB),γδT细胞存在低频(< 1%的淋巴细胞(15])和表达一个天真的表型。曲目是多克隆的,δ1 T细胞是主要的亚型(16,17]。的δ2γ9 T细胞很少在联合银行(18,19),有被描述为功能不成熟:他们表达低频率的高亲和性白介素2受体(IL-2R)β链和减少了干扰素(IFN)γ生产(20.]。然而,IL-2R的高表达α链已经报道的联合δ2γ9 T细胞(20.),以及一个表达式的常见IL-2R下降γ链一般UCB淋巴细胞(21]。

γδ正在探讨T细胞免疫疗法。发现在一个重要的里程碑,为骨质疏松症的药物,抑制类异戊二烯生物合成的下游酶,导致代谢产物积累,使暴露的细胞γ9δ2 T细胞的目标。因此,在体外的扩张γ9δ2 T细胞可以很容易地进行临床批准和现成的化合物。

的扩张γδT细胞从成人PB与巨大的成功探索22- - - - - -24),和几个扩展PB的早期临床试验δ2γ已经完成了9 T细胞免疫治疗恶性肿瘤患者(25]。其他试验探索治疗患者的磷酸盐和诱导- 2体内γ9δ2 T细胞扩张[25]。值得注意的结果包括I / II期研究在体外扩大γ9δ2 T细胞疗法在肾细胞癌患者26),减少损伤或显著降低肿瘤的生长速度在6/11可以看到病人。一个商业产品,在体外扩大Vδ2 vγ9 T细胞在一个阶段了,发现安全我研究在肾细胞癌患者27,28]。

在体外的扩张γδ从脐血T细胞(UCB)临床使用包括几个挑战,包括低很多γδT细胞,低的比例γ9δ2 T细胞能够应对phosphoantigens,他们不成熟的表型。还有很γδ发现了T细胞相对phosphoantigens对模型,但增殖,以应对磷酸盐(15,18]。

- 2和IL-15与磷酸盐结合使用,IL-15,与2和孤独,被描述为减少细胞凋亡和细胞因子和细胞毒性介质表达在引发刺激(18]。然而,在体外扩张的联合γδT细胞的二磷酸盐alendronate或zoledronate和低剂量的2被描述优先诱导分化成细胞因子的生产而非细胞毒性表型(15]。

的发展γδ后T细胞的产品用于造血干细胞移植(HSCT)是很有吸引力的前景。的临床意义γδT细胞在HSCT上下文显然是在更高频率的报告显示γδT细胞移植后与有利的结果(29日- - - - - -31日]。重要的是,重建γδHSCT后T细胞主要取决于移植物来源,差的调整γδT细胞观察脐血移植后(UCBT)。移植物的影响源γδT细胞重建最有可能可以归因于的数量和质量γδT细胞在移植(31日),强调的潜力γδ在UCBT受者T细胞免疫疗法,与graft-derived UCB优先γδT细胞。

本研究的目的是进一步探索UCB的离体培养γδT的一个潜在来源细胞过继细胞疗法(ACT),与特定的关注UCBT后治疗。第一步行动成功的发展策略是建立一个高效的生产协议容易符合良好生产规范(GMP)规定。我们这里有初始化的发展这样的一个协议,用别人的经验,我们将继续探索最佳生产条件。协议的选择试剂,zoledronate, 2是基于他们的可用性在配方符合GMP标准。我们也选择了关注的扩张δ2γ9 T细胞,容易和可靠地扩大一个子集在体外,有antitumoral anti-infectious属性,使其适合作为收养HSCT后治疗。我们发现,我们可以成功地扩大产品的比例很高γδT细胞存在,其中大多数是δ2γ9 T细胞尽管很小的数字这个子集的基线。我们还发现,他们显示细胞因子的生产和细胞毒性抗肿瘤能力。我们看到这个协议的巨大潜力,特别是UCBT的背景下,希望进一步发展这种文化对临床应用协议。

2。材料和方法

2.1。脐带血的单位

脐带血分娩(UCB)是来自健康的志愿者在Huddinge卡罗林斯卡大学医院的产科病房,斯德哥尔摩,瑞典,瑞典脐带血库,是用于研究由于细胞数量不足的临床使用。收集UCB单位收到没有任何标签,可以使跟踪供体,有独特的数字根据收集的订单。三个女性和五个男性UCB捐助者。外周血单核细胞(PBMC)收集从健康的志愿者,两个女人和一个男性。所有捐助者给了他们的知情同意捐赠之前按照指导方针和法规规定的卡罗林斯卡研究所和《赫尔辛基宣言》。批准的项目地区伦理委员会(2007/4:10)。

2.2。样品制备和细胞培养

单核的联合和铅密度梯度分离得到的细胞(Lymphoprep,费森尤斯公司Kabi挪威作为)和清洗和低温贮藏在完全培养基(如下定义)补充10% di-methyl亚砜(施泰因巴赫DMSO, Wak-Chemie医疗GmbH,德国)在液态氮。冷冻样本解冻,洗前文化,和所有,但初步实验,CD56的损耗⁺细胞进行所有UCB文化使用两步积极的选择方法,首次与CD56-APC染色细胞抗体(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西,美国),然后添加mac anti-APC珠子(Miltenyi Bergisch格拉德巴赫,德国)根据制造商的指示。细胞被播种在1×10的浓度⁶可行的单核细胞在完全培养基/毫升,定义为RPMI 1640(生命技术(Gibco))补充10%汇集人类AB-serum卡罗林斯卡大学医院的输血医学Huddinge(部门),100国际单位/毫升青霉素G, 100毫克/毫升链霉素,0.25毫克/毫升两性霉素B(生命技术(Gibco)),和2毫米谷酰胺(西格玛奥德里奇公司、圣路易斯、钼)。重组和二磷酸盐- 2 zoledronate被添加在不同浓度(0 - 500国际单位/毫升和清廉μ根据表M、职责)1。细胞培养是在37°C公司5%₂。可行的细胞数每隔一天用台盼蓝排斥和山肩维持细胞浓度。细胞被山肩使用介质包含2根据协议,但zoledronate只是添加0天。7天,细胞被离心旋转下来,浮在表面的被为了完全取代培养基。14天,细胞数、收获和低温贮藏在完全培养基补充10% DMSO溶液。

2.3。流式细胞术

如前所述(执行细胞表面染色32]。简单地说,在4°C细胞孵化20分钟在PBS补充抗体稀释1% FCS(染色缓冲区),洗之前,流式细胞仪分析。收购进行FACSCANTO流式细胞仪仪器(BD)使用FACSDiva软件(BD)。获得的数据进行了分析与FlowJo(树明星Inc .,亚什兰或),随后使用CYT bh-SNE算法的软件(Dana Pe怎样实验室ref)运行在MatLab (MathWorks公司,纳蒂克,妈,美国)。控制彩色样本用于根据荧光- 1控制技术。中使用的抗体流式细胞仪面板中所描述的表1。

2.4。Spectratyping

的γδTCR曲目主要δ家庭(Vδ1、Vδ2,Vδ3)和γ家庭(Vγ9 Vγ10 Vγ11)评估使用spectratyping方法改编自Radestad et al。33]。简单地说,从扩大联合细胞DNA提取,放大的12δ链亚科和9γ链亚科是由多重PCR反应像之前描述的那样使用引物(34)(表S1-3)。PCR进行混合使用AmpliTaq黄金360的主人(应用生物系统公司),特定的引物在最后一集中的200年或400年nanoMoles如表示S1和S2,100 ng的DNA,热循环PCR机(ptc - 200,乔丹研究、水城、MA)。过程包括以下步骤:初始变性在95°C 10分钟,其次是35周期每30秒的94°C, 60°C 45秒,72°C,持续60秒,最后延伸步骤在72°C 10分钟;和毛细管电泳,每个PCR产品是混合着formamid (FA,海蒂甲酰胺)和尺寸标准(检测400 hd火箭大小性病,应用生物系统公司)在96 -微安板块(应用生物系统公司)。样品进行了分析使用3130×1基因分析仪(应用生物系统公司)。结果分析了使用PeakScanner软件(应用生物系统公司)。

2.5。细胞因子的生产试验

细胞因子基因的相对表达决心扩大UCB和铅γδ和5 T细胞培养μ米zoledronate和200国际单位/毫升- 2中。短暂,冻存细胞解冻和RNA提取排序γδT细胞(细胞γ/δT细胞隔离设备,Miltenyi)使用PureLink™RNA迷你包(表达载体,ThermoFisher)和转换为互补使用上标™IV很™大师混合(ThermoFisher)根据制造商的指示。7500实时(Rt) PCR进行快速实时PCR仪(应用生物系统公司),使用TaqMan基因表达分析IL-1B,- 2,il - 6,IL-7,引发,IL-12B,IL-15,IL-17基因和人类ACTB基因作为参考。

2.6。细胞毒性试验

γδ杀戮是由cytometry-based化验如前所述[35]。简单地说,低温贮藏扩大UCB和铅γδ和5 T细胞培养μM zoledronate和200国际单位/毫升- 2中解冻和cocultured目标肿瘤细胞从人类Hucct-1胆管癌癌细胞。Hucct-1细胞被标记的CellTrace™紫细胞增殖标记(CTV,热Fisher)容易识别和培养孵化γδ细胞在37°C,公司为5%₂24小时在一个效应:目标比10:1。细胞生存能力评估通过流式细胞术在CTV阳性细胞使用的靶细胞被膜联蛋白v %γδT细胞是由以下公式计算:%γδT细胞杀死= 100−(%的CTV + Hucct-1细胞与γδcocultures细胞)/(%可行的CTV + Hucct-1细胞控制文化没有γδ细胞)×100。

2.7。统计数据

数据分析和显示使用棱镜6 (GraphPad,圣地亚哥,CA)。T细胞培养在不同条件下是配对- 2水平和zoledronate文化媒体的存在与否。由于样本量有限,非参数进行成对比较使用Wilcoxon rank-sum测试,并在5个或更少的实例测量两组,Mann-WhitneyU测试。

标记表达模式的细胞培养在不同的培养条件也使用bh-SNE算法相比,,简单地说,将多维数据转换成二维的,映射相似之处,首先计算两两距离矩阵的高维空间,并将其转变为一个使用不同的高斯核相似矩阵。随机二维的地图然后呈现,成对相似性计算低维空间的创建。地图然后优化迭代步骤中任意两个单元之间的相似性计算是那天最优分配他们在地图上。分析使用从达纳CYT软件Pe在Matlab平台上一代实验室(36]。这里,流式细胞仪数据只包括CD3是封闭的⁺使用FlowJo单细胞事件和导出为单独的文件。荧光数据是150年的代数余子式正弦CYT可比性,和5000年的次级样本事件是随机获得的示例文件之前bh-SNE分析。

可行性分析和细胞凋亡进行了使用SPICE软件(37),生成的图形说明死亡,凋亡细胞的比例的差异之间的组织,使用内置的测试执行和统计分析软件,运用1000000排列,如前所述[37]。

3所示。结果

3.1。UCB的扩散γδT细胞是受到- 2的浓度和Zoleronate培养基

联合单位被分成五个部分,在完全培养基培养包含50个国际单位/毫升单独或- 2,50岁,100年,200年,或者500国际单位/毫升结合5 - 2μM zoledronate。实验条件的选择是基于最初的实验,联合单元分为13个部分单独培养与不同浓度的2(100,200,400,或600国际单位/毫升培养基)和zoledronate (5μ米或十μ米),或者在完全培养基。评估+ 14天为活细胞计数用台盼蓝排斥和表型与流式细胞术zoledronate表明,低剂量(5μ米)导致最好的结果在可行性方面,扩散和百分比γδT细胞。Zoledronate缺乏有限- 2对扩散的影响γδT细胞。2加强zoledronate-induced扩散γδT细胞已经从低浓度(数据没有显示)。相当多的CD56⁺CD3⁻NK细胞被认为在扩张,导致我们介绍bead-based CD56的损耗⁺细胞的协议。在第一次实验表明,500国际单位/毫升- 2有限,如果有的话,额外的影响γδT细胞增殖与200国际单位/毫升- 2相比,最后进行了细胞培养与50岁的100年,或者200国际单位/毫升和5 - 2μM zoledronate。最后,作为比较,外周血单核细胞(PBMC)健康志愿者在培养基培养200国际单位/毫升- 2和5μM zoledronate。

评估可行的细胞计数,用台盼蓝排斥,培养细胞的表型进行后14天的文化。结果,显示在图1指出,最多的可行的联合细胞获得了使用介质含有zoledronate和200国际单位/毫升(图- 21(一))。然而,细胞计数在PBMC培养UCB细胞相对低于扩张,可能会基于小数量的γ9δ2 T细胞在基线的联合。细胞的百分比γδUCB T细胞是高在文化中包含zoledronate - 2浓度在50到200国际单位/毫升,倾向更高的百分比γδ与更高的浓度- 2 T细胞(数字1 (b)和1 (c))。的百分比γδT细胞在PBMC文化往往是稍高(图1 (b))。T细胞的改变人口的一小部分γδT细胞在基线UCB单位样本postculture T细胞包含大部分的人口γδT细胞是如图1 (c),图形“地图”显示使用bh-SNE算法来生成的。分析了封闭的CD3 UCB文化⁺T细胞。的总比例γδ每组T细胞(包括所有样品一起评估)表明,在一组基础上,所占比例最高γδT细胞是通过使用100 - 200国际单位/毫升- 2中(图1 (c)右下面板)。

的褶皱扩张γδT细胞是健壮的,中隆改变14,33岁,47 UCB扩张与培养基培养包含zoledronate和50,100,和200国际单位/毫升- 2(图1 (d))。PB文化的褶皱变化是较高,平均为1099。

似乎没有明显的区别的百分比γδT细胞在基线(补充图1)或文化后,或对褶皱扩张的文化(数据未显示)之间的联合文化源自男性相比,新生儿的女性新生儿。

3.2。优越的联合培养的可行性γδT细胞是通过使用中等浓度的2

我们评估细胞死亡和凋亡UCB细胞之前和结束时的文化通过流式细胞术使用的组合标记7-AAD (7-Aminoactinomycin D)和膜联蛋白V细胞阳性这两个标记被定义为死亡或死亡,和细胞阳性膜联蛋白V被定义为凋亡,之前被描述(38]。这些标记细胞为阴性都被定义为可行。我们发现可行的比例、凋亡和死亡γδ文化与5后T细胞明显不同μzoledronate和100 - 200国际单位/毫升- 2与5μM zoledronate和50个国际单位/毫升- 2,一个更高比例的可行的细胞和更少的死亡,凋亡细胞与前(图2)。

3.3。大多数的联合培养γδT细胞表达细胞Vδ2和TCR Vγ9和内存表型

我们进一步想建立的亚型γδT细胞是我们扩张所产生的协议,在此基础上识别γ链和δ链组成的细胞培养γδT细胞。由于技术因素对流式细胞仪面板设置,pan-TCR分析γδ和Vγ9 Vδ1和Vδ2,分别在同一面板是不可能的。然而,使用已知的百分比γδT细胞/ CD3⁺T细胞和比较它与V的百分比γ9⁺,Vδ1⁺Vδ2⁺/ CD3⁺T细胞的比例γ9日,δ1,δ2γδT细胞可以估计。

正如预期的那样,多数表示Vγ9和Vδ2,分别联合和PBMC扩张,而V的百分比δ1⁺细胞减少从基线(图3(一个))。有趣的是,我们注意到细胞的比例略高一直发现阳性Vγ9 V的比δ2在UCB-derived文化而不是PBMC-derived文化。在基线,无意义的倾向更高比例的Vδ1⁺T细胞联合单位从男性的新生儿比单位从女性(补充图1 b)。没有明显的差异对于其他子集在基线(补充图1 b后)或文化(数据未显示)。

的褶皱扩张γ9 T细胞在PB和UCB文化中令人印象深刻。少量的细胞中发现的联合在基线急剧扩大,中隆变化50,110年和253年的扩张培养medium-containing zoledronate 50, 100,和200国际单位/毫升- 2,分别与最大褶皱变化1085年文化与200国际单位/毫升- 2和5μM zoledronate(图3 (b))。的铅γ9 T细胞中隆变化的1109年。相比之下,中隆V的扩张δ1⁺T细胞是温和的(图3 (c))。无明显差异在褶皱扩张可以看到男性和女性之间的联合部队。

我们还研究了内存表型,使用标准定义基于coexpression CD45RO和CCR7最初定义传统的铅αβT细胞。CD45RO幼稚T细胞⁻CCR7⁺CD45RO、中央内存⁺CCR7⁺,CD45RO记忆效应⁺CCR7⁻,被定义为CD45RO终末分化细胞⁻CCR7⁻。文化与后我们发现主要表型效应内存表型(CD45RO⁺CCR7)的联合和PBMC扩张。然而,基线的联合和铅γδT细胞的人口有很高比例的终末分化细胞根据这个定义(图3 (d))。符合几个以前发表的文章中,我们分析了内存表型CCR7与CD27代替(使用一个定义,15,18,39,40]。根据这个定义,大多数的基线的联合γδT细胞是天真(CD45RO⁻CD27⁺),一些中央内存(CD45RO的代表⁺CD27⁺)和内存(CD45RO效应⁺CD27⁻)细胞,几乎没有(CD45RO终末分化细胞⁻CD27⁻,图3 (e))。有趣的是,铅γδT细胞分裂几乎均匀的记忆子集之间的基线,以轻微优势的天真和中央内存表型。UCB的培养细胞,所以最大的子集是CD45RO阳性,但都维持着CD27表达式,分类与中央记忆antigen-experienced细胞表型,而最大的子集PBMC扩张调节CD45RO但失去CD27表达式,表明这个定义的效应记忆表型。

3.4。Spectratyping显示多克隆模式,表明Postexpansion细胞产品含有多种细胞γδ特异性

Spectratyping分析以评估的单克隆扩大UCB的曲目γδT细胞。亚科的γ和δ链条可分为多克隆(这里定义为> 6峰),寡克隆(定义为3 - 6峰),或单克隆(定义为< 3峰)。

结果表明,扩展协议导致相似的细胞γδ文化体验在所有测试条件(5μzoledronate加上50、100、200国际单位/毫升- 2培养基)。培养细胞种群的主要多克隆体验在Vδ1-Jδ1、Vδ2 jδ1,Vδ3 jδ1亚科,Vδ1-Jδ2和Vδ2 jδ2亚科,Vδ1-Jδ3和Vδ2 jδ2亚科,对于大多数的Vγ9 Vγ10 Vγ11日和Vγfl亚科(图4(一))。这表明文化过程引起的独立的多重性不同的克隆扩张,导致最后一个细胞群与广泛的TCR曲目。

几个亚科主要有寡克隆单克隆曲目或失踪的山峰在几个样本,分析。其中包括Vδ3 jδ2亚科和Vδ1-Jδ4、Vδ2 jδ4,Vδ3 jδ2亚科。样品与失踪的山峰Vδ1-Jδ4和Vδ3 jδ4亚科是更常见的文化接触到50个国际单位/毫升- 2培养基比扩张(4/5,在两个)培养与100或200国际单位/毫升- 2(分别为2/5和1/5,1/5,4/5,分别4)。

3.5。细胞因子的生产养殖脐带血和外周血之间的不同γδT细胞

细胞因子基因表达在扩大UCB用rt - pcr和PBMCγδ和5 T细胞培养μ米zoledronate和200国际单位/毫升- 2中选择(基于优越的褶皱UCB的扩张γδT细胞,特别是γ9 T细胞)。il - 1β2、il - 6、il - 12β、IL-15 IL-17检查,有趣的是,il - 1的表达β2,引发在UCB更高γδT细胞(图5(一个))。这在il - 1的情况下尤为引人注目β随着铅γδT细胞表达il - 1β在一个非常小的程度。的基因表达IL-17 UCB和铅很低γδT细胞(图5(一个))。

3.6。的联合培养γδ显示细胞毒性T细胞的能力

一个使用coculture的细胞毒性试验γδ从Hucct-1 T细胞和CTV-labeled细胞肿瘤细胞系进行测试的杀戮能力培养γδT细胞。我们选择扩张的培养与5μ米zoledronate和200国际单位/毫升- 2试验介质。靶细胞杀死,测量肿瘤细胞百分比膜联蛋白V积极性,从-72%至33.9不等,平均为49.8%(图5测试UCB文化产品5 (b))。两个PBMC文化进行对比检测显示造成的(图38.8和40.95 (b))。

3.7。表型T细胞标记物的表达是受文化影响的过程

我们想进一步阐明激活动力学标记和cosignaling培养细胞上的受体,从而分析聚集有关标记CD28、激活标记CD69,激活/ proapoptosis标记CD95 CTLA-4 coinhibitory受体,PD-1 LAG-3, TIM-3。由于技术因素在流式细胞仪的设置面板,这些受体总CD3进行评估⁺T细胞。CD28和差别我们可以看到明显的对这些upregulation CD95和CD69诱导培养过程中相对于基线值UCB——和PBMC-derived文化产品(数字6(一)和6 (b))。有一个显著CD69的比例更高⁺联合商业银行在扩张T细胞培养介质在200国际单位/毫升- 2以50个国际单位/毫升- 2相比,与一个无意义的趋势相同的CD95(图6 (b))。co-inhibitory受体的表达也受到了影响:PD-1显示一般表达增加UCB但不是PBγδT细胞后的文化。TIM-3,有一个无意义的趋势相同的(只有在UCB扩张)进行研究。CTLA-4的百分比⁺在联合银行和PB文化,LAG-3⁺(只有研究UCB文化),T细胞明显增加优先UCB 50 T细胞培养与国际单位/毫升- 2相对于基线和UCB T细胞培养介质包含200国际单位/毫升(图- 26 (c))。

3.8。其他淋巴细胞的表达在最后的文化是由CD56子集⁺NK⁻和NKT细胞

甚至还有和PB文化主导γδT细胞的人口有剩余的其他淋巴细胞比例,其中包含的混合物αβT细胞和NK细胞(图6 (d)(左)和中间面板)。我们也注意到CD56的百分比⁺CD3⁺细胞(图6 (d)中间面板)。其余TCRα百分比β⁺T细胞在文化接触zoledronate显著降低,对应的方式- 2细胞的百分比增加γδ⁺T细胞(图6 (d)左面板)。在基线,一个更高比例的NK细胞被认为无足轻重的趋势UCB单位从男性新生儿相比,女性捐赠者(补充图1)。

没有b细胞能被探测到的文化+ 14天(图6 (d)右面板,只有检测UCB文化)。

4所示。讨论

在体外扩张的联合γδT细胞是一个挑战。这是由于几个因素,如缺乏γδT细胞在联合银行(15和非常低的频率γδT细胞子集很容易扩展在体外:γ9δ2⁺T细胞(18,19]。同时,UCB的功能不成熟γδT细胞(15),包括能力降低响应[- 220.,21),和以前的观测表明倾向发展生产期间而非细胞毒性细胞因子在体外文化(15造成的困难。特别是文化的开发协议健壮且可再生的足够生产过继细胞治疗的临床使用,这里的目标是生产电池的产品是一致的在质量和包含所需的细胞表型与antitumoral anti-infectious属性。本研究进行,目的是探索翻译的可能性的协议用于扩张外周血γδT细胞联合设置,长期目标探索收养的可能性γδUCBT后T细胞疗法。γδT细胞重构被认为是重要的HSCT的结果(29日- - - - - -31日),或许是由于他们MHC-unrestricted抗原识别和antitumoral和anti-infectious属性。一大批的γδT细胞后UCBT尤其差,因此需要创新的策略,如扩大γδT细胞从一个整除的贪污。我们看到这里给出的结果是对这种疗法的发展。

基于我们的选择zoledronate和文化协议- 2在GMP-compliant准备容易获得批准临床药物和丰富的出版经验表明,他们可以用来可靠地扩大γ9δ2 T细胞。zoledronate的选择是基于结果显示更好的增殖反应的联合γδT细胞相比zoledronate磷酸盐(15]。我们确实考虑IL-15,因为这带来更少的凋亡细胞因子被描述γδT细胞后,文化,和更高的细胞因子和细胞毒性介质表达引发刺激(18]。然而,最后的选择是基于这种细胞因子- 2,除了在GMP-preparations唾手可得,最大的记录的经验在体外以及在活的有机体内使用。

我们发现这里的协议,结合zoledronate和2在不同浓度,导致大量扩散的联合γδT细胞。由此产生的文化包含大多数CD3⁺T细胞的比例不同的表示γδ细胞受体。的比例γδT细胞联合文化似乎与2的浓度增加培养基200国际单位/毫升和5的结合μM zoledronate, 100 - 200国际单位/毫升- 2导致UCB的最高百分比γδT细胞(图1 (b))。无显著差异可能是在折叠的扩张γδT细胞的比例γδ细胞受体⁺UCB文化中对待100国际单位或200国际单位/毫升- 2。唯一的区别是,最高浓度- 2与更CD56倾向有关⁺NK细胞的文化(图6 (d))。另一个重要方面是,100 - 200 - 2的浓度授予一个更高比例的可行的联合细胞的文化比50个国际单位/毫升(图- 2的浓度2)。

大多数的讲究的γδV T细胞表达γ9,稍微较小程度上的Vδ2。,这在意料之中γδT细胞的细胞组成的γ9链和一个δ2已知链被激活在体外磷酸盐的存在,如zoledronate,培养基(4,6,22,23,28]。这一发现的两个有趣的方面是值得注意的,然而。第一个是非常重大的折叠的扩张γ9 T细胞。中隆扩张和最大褶皱子集的扩张与膨胀条件收益率最高,处理5μM zoledronate 200国际单位/毫升- 2培养基,分别为253年和1085年(图3 (b))。PB文化相比,处理5μM zoledronate 200国际单位/毫升- 2,折叠总量的扩张γδT细胞在UCB文化低很多,但是关于的区别γ9 T细胞扩张明显少(数字1 (d)和3 (b))。这表明癫痫药γ9 T细胞有增殖潜力令人印象深刻13,14]。这是一个先决条件使用磷酸盐治疗潜在的细胞疗法的发展计划,这个子集很小的百分比在基线的联合。

UCB文化的另一个有趣的特性,但不是PBMC-derived扩张,之间的差异的阳性细胞百分比是Vγ9和Vδ2,有些小比例的培养γδV T细胞染色阳性δ2。这可能表明,培养的细胞群包含一个小的子集Vγ9⁺细胞与细胞由另一个Vδ链,如δ1。V的识别δ1⁺T细胞,包括各种Vγ链(41- - - - - -43),因此V的比例较低δ1⁺T细胞发现后坚持文化可以表明人口γ9δ1 T细胞是通过文化保持的过程。(UCB包含更高水平的这个细胞子集18,44]。高频率的γ9δ1描述了T细胞在患者回归热综合症(45),这表明这个子集可以诱导在特定情况下广泛扩散。识别的配体Vδ1 T细胞(不同Vγ链)在很大程度上仍无特征但包括CD1家庭的蛋白质(9,43通过激活),云母/ B通过细胞和NK细胞受体NKG2D [10,11]。云母和MICB表达被描述在各种肿瘤和增加肿瘤浸润了Vδ1⁺T细胞(11]。在艾滋病毒感染,Vδ1⁺T细胞数量增加,因此建议的潜在参与Vδ1⁺T细胞在抗病毒免疫中(43]。的dual antiviral and antitumor potential of this subset, analogous with the recognition of phopshoantigens in both cellular stress and in infection byγ9δ2 T细胞(4,8),表明在体外扩大一个平行的小V人口δ1 T细胞可能带来附加价值的产品。

发表的研究在活的有机体内和在体外的扩张γδT细胞,本文的作者的知识,几乎全部集中在γ9δ2 T细胞的子集,但有一个例外。在这项研究中,在体外的扩张γδT细胞与反诱导γδ细胞受体抗体,以及由此产生的细胞产品含有两个Vδ2⁺和Vδ1⁺T细胞(46]。大多数的联合γδT细胞在基线Vδ1⁺(16,17),这种方法可能是有趣的探索也在联合商业银行在未来设置。

spectratyping分析表明扩大细胞群培养zoledronate和不同浓度的2(50 - 200国际单位/毫升)主要是多克隆(图4)。这表明扩大γδT细胞,其中大部分表示Vγ9⁺和Vδ2⁺,nonclonal激增,non-TCR specificity-dependent方式。这是按照已知的数据关于V的激活δ2⁺T细胞通过phosphoantigens:一个复杂的过程独立于MHC分子,包括CD277受体的结合,从而导致nonclonal扩散(47]。广泛扩大TCR特异性的细胞可以增加效率的机会过继治疗方案基于当前协议。

内存UCB的表型γδT细胞是我们感兴趣的,因为它被描述某些T细胞更有效子集使用时比别人收养疗法(48]。我们最初使用最常见的定义基于CCR7和CD45RO T细胞记忆。然而,基线的联合和铅γδT细胞终末分化细胞比例较高的人口根据这个定义(图3 (d))。人类和动物模型研究的皮肤γδT细胞表明这个子集CCR7,他们表达低水平的循环淋巴结和皮肤之间较少依赖CCR7表达的再循环αβT细胞(49,50]。Vδ2⁺描述了T细胞表达CCR7[相对较高的51]。这可能表明,内存的标准定义不太适合UCB子集γδT细胞。然后我们选择进一步研究基于CD27和CD45RO内存表型定义。这个决定是基于之前发表的一些文章中使用这个定义(39,40]。结果关于内存表型的联合γδT细胞之前和之后的文化被更符合预期:大多数的联合γδT细胞在基线(CD45RO很天真⁻CD27⁺)和最大的子集后文化表达了中央内存表型(CD45RO⁺CD27⁺,图3 (e))。后者发现是可靠的,因为这个子集被描述体内有最高的效率与α过继细胞疗法的研究βT细胞在灵长类动物48]。相比之下,铅γδT细胞表达CD27的比例几乎相等⁻和CD45RO-based内存表型,稍微天真和中央记忆细胞在基线,而占主导地位的文化是一个CD27后表型⁻CD45RO⁺记忆效应表型(48]。

探索的细胞因子基因表达的文化表示,有趣的是,有表达模式的差异的联合和PBγδT细胞。il - 1的表达有显著提高的β2、引发UCB-derived细胞(图5(一个)。这可能表明cytokine-producing表现型的优先发展,之前已经报道过(15]。il - 1β促炎细胞因子,激活后释放inflammosomes应对病毒感染(52),这表明联合γδT细胞可能有优越的属性增加抗病毒反应。众所周知,引发导致中性粒细胞趋化性和脱粒粒细胞(53),表示一般的促炎的能力。cytokine-producing表型,然而,不排除细胞毒性的能力。我们执行的细胞毒性试验表明,肿瘤细胞的能力杀死在联合银行和PB可比γδT细胞(图5 (b)和5 (c))。这是可靠的,因为它表明抗肿瘤药的潜能γδT细胞产品以这种方式培养。

CD28和差别我们看到对这些upregulation CD95、CD69培养UCB和PB T细胞和PD-1 upregulation UCB T细胞,与基线值(数据6(一)和6 (b))。这可能反映了激活(54,55),这表明接触zoledronate和导致成功- 2抗原同时考虑刺激。这一事实CTLA-4的百分比⁺和LAG-3⁺T细胞明显增加优先UCB细胞培养与基线相比50个国际单位/毫升- 2和UCB T细胞培养与更高的浓度(图- 26 (c))可能是由于表达式动力学的百分比或事实γδ50 T细胞在文化扩张与国际单位/毫升- 2联合单位使用,之间的差异很大,因此结果可能部分反映了标记表达αβT细胞。

包含非培养的细胞数量γδT细胞组成的αβT细胞和NK细胞(图6 (d)(左)和中间面板)。这可能表明,最终选择步骤可以引入协议,以确保一个纯粹γδT细胞的产品。

有趣的是,还有CD56的一小部分⁺T细胞出现在在大多数文化扩张。作为γδ众所周知,T细胞表达CD56和NK细胞相关标记CD16 NKG2D,这些细胞可以扩展的一部分γδT细胞数量。CD56一直与细胞毒性相关的先前的研究体外γδT细胞扩张(18]。

总之,协议在体外PBγδT细胞扩张在这里适应联合诱导大量扩散的联合γδT细胞。14天的首选文化条件,200国际单位/毫升结合5 - 2μM zoledronate培养基,导致细胞产品的比例很高γδT细胞,主要是表达γ9链和δ2链,UCB PBMC-derived文化,和与一个较小的剩余人口δ也可能1 T细胞表达γ9,UCB-derived文化。的联合培养γδT细胞表达了中央内存表型。我们可以证明培养的联合γδT细胞是基于细胞因子基因表达和高效的生产者,特别是对il - 1β2、引发和IL-15,有能力杀死肿瘤细胞与培养PBγδT细胞。在一起,这些结果表明,发展在体外扩大联合银行γδT细胞疗法与这个协议是可行的和具有非常巨大的潜力,特别是对于UCBT后行动。

的利益冲突

作者声明没有与这项工作有关的利益冲突。

确认

作者想表达自己的感激之情的助产士工作的瑞典脐带血库的援助与获得的联合单位用于这项研究。

补充材料

补充材料包括3表、表S1-3一图,补充图1。补充表详细的设置spectratyping分析方面进行了分析δ链表S1亚科,对评估γ亚科在表S2和S3中使用的引物表。补充图1显示基线的比例γδT细胞,γδT细胞阳性Vγ9 Vδ2,Vδ1,根据联合捐赠性NK细胞的分裂。细胞在基线子集UCB从男性和女性的新生儿。关键细胞的比例在基线子集分别显示联合单位从男性和女性获得捐助者。在,的比例γδT细胞和NK细胞显示,B的比例γδT细胞阳性Vγ9 Vδ2,Vδ1所示。(补充材料)

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