生产成人滑膜Fluid-Derived间充质干细胞在Stirred-Suspension文化

文摘

滑膜fluid-derived chondrogenic潜能的间充质干细胞(SF-MSCs)支持使用在软骨再生策略。然而,他们缺乏在滑液需要扩散的文化生成临床相关的数量。这是确定125毫升搅拌悬浮生物反应器利用Cytodex-3微载体珠代表一个可行的平台,这些细胞的增殖。在接种阶段,珠装载2 g / L, 4.5细胞的接种比例/珠和连续搅拌在40 rpm中有5%血清导致高细胞附件整体效率和随后的细胞折5.7除以8天的扩张。在随后的增长阶段,定期添加新的微载体和新鲜媒介文化寿命增加,导致21.3细胞成倍增加18天在同一容器在不影响细胞的特征。相比静态组织培养瓶,bioreactor-based生物过程需要更少的处理步骤,更容易扩展,和同样的细胞生产水平,降低运营成本,因为它使用媒介的大约一半。因此,搅拌悬浮生物反应器结合微载体技术代表了一个可行的和更高效的平台比组织培养瓶的代SF-MSCs文化。

1。介绍

关节软骨是一种结缔组织,涵盖了骨骼的末端,提供负载吸收和耗散,几乎无摩擦表面,使骨骼关节内表达。软骨的无血管的性质和分散的软骨细胞的低密度(cartilage-producing细胞)极大地阻碍了内生再生能力的组织(1]。这样,甚至轻微损伤软骨可以启动骨关节炎(OA)的发展中软骨退化具有重要意义和结果在关节肿胀,慢性疼痛,减少流动(2]。

OA历来被注射药物减轻症状,如疼痛(3]。然而,药品可以失去效果随着时间的推移,导致重大的不良副作用,和尚未被证明能够维持或再生软骨(4- - - - - -7]。因此,许多患者最终别无选择,只能接受手术(8]。在极端的情况下,全关节置换(TJR)受损的关节假体关节所取代,是必要的。尽管TJR可以改善病人的生活质量,患者不完全恢复正常功能,随着时间的推移与感染有关的问题和关节放松建议替代治疗是必需的(7]。

测试过的新治疗方案包括周围的软骨移植隔绝non-weight-bearing地区缺陷网站(mosaicplasty) [1,5]。然而,这种方法会导致施主能级发病率,和方法来解决新软骨缺陷,例如缝合线和别针,实际上可能发起进一步损害(9]。第二种方法一直在扩大,文化,人口从软骨分离软骨细胞活检的后续注入到一个缺陷的网站,有时与生物材料(自体软骨细胞移植)5,6]。这种方法也可以导致施主能级的发病率,以及生物材料的使用是不可取的10]。此外,软骨细胞去分化的文化和扩张能力往往有限,失去能力软骨(11]。第三种方法是通过软骨下骨钻,导致骨髓元素的释放和随后形成血凝块的缺陷网站,通过自然愈合机制,通常由一种纤维取代了随着时间的推移,软骨(1,6]。该纤维软骨没有本机关节软骨的力学性能或耐用性(6,12,13]。

间充质干细胞(msc)最近为他们潜在的修复软骨引起了极大的兴趣。这些细胞可以从几个不同的孤立的来源,包括骨髓、脂肪组织、滑液。成年人MSC种群是由其表面(CD34标记概要文件⁻、CD45⁻,CD73⁺,CD90⁺和CD105⁺附着在细胞文化品位塑料),他们的能力,他们的能力来生成殖民地,和他们trilineage潜力成为脂肪、骨或软骨细胞(14]。尽管这些共同的特征,MSC受到他们居住的组织微环境的影响,因此,MSC人口来自不同组织表现出特定的特质有助于区分(15,16]。

msc隔绝在关节连接显示优越的能力有助于软骨修复。例如,巨大的努力已经检查的可能性使用滑膜membrane-derived间充质干细胞对软骨组织工程9,10,17- - - - - -23]。滑膜fluid-derived msc (SF-MSCs)被认为起源于滑膜中存在但润滑液中包含关节腔(24- - - - - -26]。然而,据推测是由于当地的环境影响,SF-MSCs显示生成软骨的能力大于其他MSC评估类型,包括滑膜,骨髓和脂肪组织16,27,28]。有趣的是,在开发过程中,关节软骨和滑膜关节组件来自祖地带间的细胞(29日),因此,成人msc在滑膜和滑液也会保留一些细胞的偏见。这种细胞也被报道拥有强劲的增长潜力(30.]。SF-MSCs微创的方式很容易收获通过关节穿刺术,从而避免施主能级发病率(30.]。鉴于SF-MSCs可以来自一个非常访问来源,他们显然代表了潜在的有价值的细胞类型对某些组织工程应用,包括关节软骨的修复(30.,31日]。

尽管他们的可访问性,低浓度的SF-MSCs滑液意味着他们不能孤立的足够多数量的直接发展临床修复和再生策略。此外,如果批准用于治疗用途,广泛临床SF-MSC-based疗法的实施将需要大量的有质量保证的细胞。由于这些原因,有必要发展迅速,这些细胞的比例增大的发展可再生的方法。绝大多数的干细胞研究是进行细胞数量已扩大在静态组织培养瓶。然而,扩大组织培养瓶的使用是不可取的。由于文化小卷,可以容纳在一个烧瓶,很多水瓶需要生成临床相关数量的细胞细胞扩张使这种方法效率低下和手动密集。相比之下,生物反应器可伸缩的船只,已被证明是能够支持大量的干细胞类型的扩张(32- - - - - -35),因此代表了一个可行的替代静态培养瓶。一个悬浮培养生物反应器可以设计用来保存相同的文化卷数以百计的烧瓶,轻松地由一个训练有素的人,和计算机控制,不断保持一个最佳的和同质文化环境对细胞的生长。扩大附着细胞生物反应器过程中的重要考虑因素是,他们需要一个表面上他们可以连接到生存,成长,和增殖,不伴随的分化。微载体是小珠子,可以引入悬架通过搅拌搅拌生物反应器和维护,从而为细胞提供一个表面附件,使粘附细胞的扩张在这个动态的环境36,37]。微载体的使用并非没有挑战,然而,研究需要开发定制的协议来支持一个特定细胞类型的附件到一个特定的微载体类型和特定细胞类型的扩散在微载体。

在这份报告中,进行研究来确定培养的可行性成年人SF-MSC悬浮生物反应器。所示,微载体技术可以用来支持这些细胞的扩张的前提下他们的定义属性。

2。材料和方法

2.1。静态的文化

msc来源于两个尸体男性捐赠者的滑液(捐赠1年71岁和捐助2 34岁)没有显示OA的迹象是在四个小时内死亡的阿尔伯塔省南部通过组织移植项目与伦理批准和同意协议。msc被孤立的标准方法(38]。低温贮藏SF-MSCs通道2被解冻,接种到75厘米²Nunc组织培养瓶(t - 75)的密度5000细胞/厘米²与杜尔贝科的修改鹰的介质(DMEM) (Lonza猫编号12 - 707 f)。DMEM补充了间充质干细胞生长培养基(MSCGM) SingleQuot工具包(Lonza猫号码pt - 4105),含胎牛血清的边后卫。这称为10%的边后卫DMEM完全培养基。完全培养基被储存在4°C最多2周。文化在37°C和5%孵化有限公司₂后,50%的媒介改变了3天。文化是通过每一个5天的收获细胞用0.05%胰蛋白酶EDTA(表达载体猫数量25300 - 120)和reinoculating成新的t - 75的玻璃瓶5000细胞/厘米²。细胞密度和可行性评估与血球计采用台盼蓝排斥法。

2.2。悬浮培养

2.2.1。旋转瓶准备

悬浮培养扩张进行了125毫升(最大工作容积)转轮烧瓶(美国新泽西州NDS技术)配备了悬浮磁叶轮。每个转轮瓶和叶轮的内表面与Sigmacote硅化(σ猫SL-2)减少细胞微载体附件。转轮的玻璃瓶都完全组装和热压处理过的前使用。在操作期间,每个转轮瓶放置在一个湿润孵化器(37°C, 5%有限公司₂)的Thermolyne磁搅拌板是用于控制搅拌叶轮的速度。

2.2.2。微载体的制备

Cytodex 3微载体(σ猫C3275数量,批号030 m1182v),这是右旋糖酐珠子涂有变性porcine-skin胶原蛋白表面,选择基于初步我们实验室进行小规模实验表明人类滑膜fluid-derived msc可以附加到这些珠子(数据未显示)。微载体是准备使用根据制造商的规格。简单地说,一个已知数量的珠子在Ca水分干燥^{2 +}- - - Mg^{2 +}无磷酸盐(PBS)在一个锥形烧瓶,然后清洗新鲜Ca^{2 +}- - - Mg^{2 +}无PBS被高压蒸汽消毒。微载体准备立即使用。

2.2.3。旋转瓶接种

消毒微载体与DMEM和引入转轮的玻璃瓶清洗60毫升细胞培养基进行筛选。微调控制项的玻璃瓶被37°C和5%孵化有限公司₂在接种细胞之前大约18个小时。用于接种的细胞是从静态组织培养瓶,用于生成一个细胞悬液添加到转轮烧瓶的工作总量80毫升。24小时后,所有的转轮的玻璃瓶都超过了一个额外的40毫升细胞培养基的最后工作容积120毫升。在接种时十分谨慎,确保一致性复制烧瓶。

2.2.4。旋转瓶取样

在指定的时间点在每个实验中,四个代表1000人μ从每个转轮L采集标本瓶校准1000μL吸管。每个样本被之前,瓶内容很好地混合和样本体积从文化的中心。这个辅助维护样本之间的一致性,确保获得的样本瓶的代表内容。每个样本被放置在一个无菌15毫升锥形管和左原状为了允许微载体来解决。一旦定居下来,浮在表面的丢弃,微载体是冲洗两次1.0毫升的PBS(每个冲洗的PBS微载体,其次是去除微载体落定后)。接下来,1.0毫升的0.1% (w/v)结晶紫在0.1 M柠檬酸添加到每个锥形管和微载体培养1小时在37°C。1小时后,微载体悬浮1000搅拌10到15倍μL吸管。一个20μL整除的染色细胞悬液被移除,和发布的核数与血球计作为测量文化的细胞密度。

可视化微载体上的细胞,一个500μL样本的转轮瓶放置在一个好6-well板3.0毫升的PBS和15μL 0.5%的(w/v)在甲醇结晶紫和样本是200年蔡司Axiovert显微镜下检查。

2.2.5。收获细胞微载体

收获细胞Cytodex 3微载体,从转轮10毫升样品瓶锥形管被放置在一个15毫升、和微载体与4.0毫升的PBS冲洗两次。体积为1.0毫升的0.05% trypsin-EDTA随后添加到锥形管,和内容轻轻地搅拌5 * 1000μL吸管。后允许微载体来解决(2分钟),包含分离细胞收集的上清液吸管和通过BD猎鹰100μm细胞过滤器(VWR猫数量ca21008 - 950)到50毫升锥形管。添加1.0毫升的trypsin-EDTA微载体其次是温和搅拌和过滤的上层清液到相同的锥形管重复两次。过滤器是1.0毫升的培养基冲洗三次,和积累滤液在600×g离心5分钟颗粒细胞和隔离。

2.3。细胞表面标记的分析

的患病率MSC-specific表面抗原是由流式细胞术。简单,细胞被冲洗两次PBS和孵化屏蔽解决方案(3%的边后卫在PBS)冰在黑暗中30分钟。细胞被离心机和resuspended屏蔽解决方案5×10的密度⁵细胞/ 100μL和分发到100年μL在15毫升锥形管整除。每100μL整除沾5.0μL的人类抗体CD34、CD45、CD73 (BD生物科学猫数量550822、555483和550257年,分别地),CD90、CD105 (Serotec猫MCA90F数量和MCA1157F、职责)。30分钟后孵化的冰在黑暗中,细胞与PBS冲洗三次,resuspended在屏蔽解决方案中,并转移到BD猎鹰圆底管(VWR猫ca60819 - 138)。相对荧光测量使用FACSCalibur流式细胞分析仪(BD生物科学),与CellQuest软件和数据进行了分析。

2.4。分化

向成骨细胞诱导,脂肪形成的,chondrogenic命运与商用分化诱导和维护媒体从Lonza工具包。差异化协议进行了根据制造商的指示和简要描述。

2.4.1。成骨分化

骨诱导在6-well板使用成骨分化工具包(Lonza猫数量pt - 3002)包括成骨诱导介质(OIM)。镀细胞密度为3.0×10⁴细胞/ (3.1×10³细胞/厘米²的边后卫DMEM)与3.0毫升的10%。24小时后,10%的边后卫DMEM丢弃,取而代之的是OIM分化期的持续时间。细胞被维护在文化28天,完成介质变化进行每3天。茜素红染色用于钙沉积在成骨的文化如前所述37,39]。

2.4.2。脂肪形成的分化

脂肪生成在6-well板使用脂肪形成的诱导分化工具包(Lonza猫数量pt - 3004)包括脂肪形成的诱导培养基(AIM)和脂肪形成的维护中(AMM)。镀细胞密度为2.0×10⁵细胞/ (2.1×10⁴细胞/厘米²的边后卫DMEM)与3.0毫升的10%。完全培养基变化进行每2 - 3天就有10%的边后卫DMEM直到细胞汇合的100%,一般在5天。一旦汇合的,10%的边后卫DMEM换成3.0毫升的目标为3天前被替换为2.0毫升的一个mm 2天。这5天周期的目标和一个mm重复两次。在第三周期结束时,细胞被维护在一个mm为28天的其余部分分化期和完全培养基改变每3天。

油红O(奥罗)解决方案用于染色脂滴形成脂肪形成的文化。奥罗的原液是准备通过添加0.175克奥罗(σ猫O0625)到50毫升的100%异丙醇。奥罗当时准备的工作解决方案通过增加60% (v/v40%()奥罗股票解决方案v/v)重蒸馏的水。染色过程进行了如前所述[37,39]。

2.4.3。Chondrogenic分化

使用颗粒文化方法诱导软骨形成时chondrogenic分化工具包(Lonza猫pt - 3003)数量和转化生长因子β3 (TGF -β3)数量(Lonza猫pt - 4124)。chondrogenic感应介质(CIM)设备被称为不完整的CIM (iCIM)直到TGF -β3增加了此时完整的CIM (cCIM)。每个颗粒生成使用2.5×10⁵细胞15毫升锥形管。细胞被离心机和冲洗iCIM (300 g×5分钟)。iCIM丢弃,颗粒在cCIM resuspended。颗粒保持在文化使用cCIM 28天每3天完成介质的变化。

量化的程度软骨形成,粘多糖(GAG)测量的内容。中被丢弃,小球被转移到0.7毫升埃普多夫管和消化在65°C水浴4小时50μL木瓜蛋白酶溶液(12.5毫克的木瓜蛋白酶(σ猫P4762)和16.32毫克的n -乙酰- 2003 - L -半胱氨酸(σ猫A9165)在50毫升的50 mM磷酸盐缓冲剂)。丸是涡然后在1000转离心1分钟每30分钟。以确保完整的消化,与1000年剧烈搅动μL吸管完全分手前的颗粒是必要的最后一个在3000转离心5分钟。插科打诨的上层清液被隔离和评价内容。

标准曲线是由连续稀释10毫克的硫酸软骨素(σ猫C9819)溶解在1.0毫升的50 mM磷酸盐缓冲剂。笑料的数量在一个给定的样品或标准的解决方案是基于颜色反应与dimethylmethylene蓝色(DMB)解决方案(8毫克1,9-dimethylmethylene蓝色(σ猫数量341088)与500毫升2.5毫升乙醇混合重蒸馏的水含有甲酸钠1.0克和1.0毫升甲酸)。10μL标准溶液或样本放置在井与200年的96孔板μL DMB解决方案和板在37°C和5%孵化有限公司₂30分钟前被分析。所有标准和样品测定板阅读器510海里的一式三份。

2.5。统计分析

用单向方差分析数据进行统计分析。一个值小于5% ( )被认为是显著的。

3所示。结果与讨论

悬浮生物反应器代表一个可扩展的平台,产生大量的细胞在文化在一个高效和可再生的方式(35,37,40]。然而,当处理贴壁细胞和微载体技术,有两种截然不同的操作阶段,需要考虑。第一个是接种阶段期间,是创造条件鼓励接种细胞附着在微载体。第二个是增长阶段,鼓励在微载体细胞增殖。条件是理想的细胞附件未必是最优的支持细胞增殖(41]。因此,细胞产量最大化,需要更好地理解和优化生物过程的每个阶段。这里,研究有关这两个阶段的结果进行了讨论。从供体细胞1被用来开发一个悬浮生物反应器协议,然后从捐赠者都是用来评估细胞最终的协议,以确保方法没有特定的细胞从一个捐助者。

3.1。接种阶段

粘附细胞的接种阶段类型,尤其是在微载体悬浮培养,会极大地影响最终的细胞群收益率(41- - - - - -43]。接种阶段文化参数如搅拌方案,血清水平在中,微载体加载(g / L),和细胞珠比都依恋影响电池效率。

Forestell et al。41)表明,附件后,细胞仍然是圆形的微载体表面扩散之前和承担一个概要文件。这些圆形的细胞更容易分离比细胞暴露在传播所产生的剪切不断搅拌介质。Yuan和她的同事(37)报道,一段8小时是足够的附件骨骨髓来源间充质干细胞对大孔CultiSpher-S微载体。然而,休伊特et al。44)报道,接种后,24小时内是相同的细胞类型所需的附加,然后在微孔扩散Cytodex 3微载体。因此,我们最初接种阶段定义为第一个24小时后的人类SF-MSCs生物反应器。

作为起点,接种微载体制造商推荐的协议结合媒体和细胞密度中使用传统的静态培养瓶。基线参数如下:(i)连续搅拌40 rpm是所需的最小搅拌保持微载体悬浮介质的体积,(ii)血清水平10%接种类似静态文化,(iii) 4.5细胞/珠类似静态文化在5000细胞/厘米²,(iv) Cytodex 3微载体加载1 g / L。接种阶段进行文化体积减少的80毫升。24小时后,文化超过120毫升的最后一个工作容积为增长阶段做准备。使用文化参数包括连续搅拌后第一个24小时40 rpm和10%血清的培养基。

我们显微镜下进行细胞依附和传播行为,以应对不同文化的操作参数(搅拌方案,最初的血清内容、微载体加载和细胞珠比)在24小时接种阶段。然而,精确的量化附件效率在此期间挑战由于低生物反应器中细胞数量。因此,我们评估操纵的影响而不是特定的接种阶段参数通过测量细胞数量,导致文化后10天(24小时接种阶段+随后为期九天的增长阶段)。在经济增长时期,文化条件保持一致的所有船只隔离与接种阶段相关的任何影响。这种技术被认为是适合作为高细胞依附在接种阶段效率有提高后续细胞产量直接相关41- - - - - -43]。因此,测量细胞产量为我们提供了一种手段评估细胞附件接种效率在一个特定的参数。

3.1.1。搅拌效果方案

文学风潮的报告率在间充质干细胞成悬浮培养的接种范围从0 rpm(即。24小时,没有搅拌)第一(43,44)连续搅拌30 rpm第一18个小时(36]。其他人已经报道的交替使用间歇搅拌方案组成的搅拌和休息(45- - - - - -47]。Forestell和他的同事们(41]发现细胞附件较少发生在更高的搅拌速率。因此,他们用最低搅拌速度要求暂停微载体。在间歇搅拌报道的这些研究,文化是激动5秒到30分钟紧随其后10到30分钟的休息。

在目前的研究中,文化被激起了40 rpm连续或间歇周期3分钟的风潮之后,27分钟的休息。以往的经验显示,这个方案促进了骨髓间充质微载体(骨骨髓来源的附件37]。由此产生的增长曲线如图1。指数增长率为0.0126 h⁻¹连续和间歇的文化。最大的细胞密度达到6.1×10⁴和6.0×10⁴细胞/毫升连续和间歇搅拌方案,分别。

从这项研究中,似乎没有显著差异SF-MSC附件效率Cytodex 3微载体在使用连续和间歇搅拌。这不是一个不寻常的结果成功的人类胎盘msc Cytodex附件3微载体(44)和骨骨髓来源msc在Cytodex 1微载体(36]报道了连续搅拌30到50的rpm在第一次18到24小时。我们注意到,MSC从滑液往往附加更容易比其他MSC类型细胞培养塑料在血清的存在,和这种趋势可能翻译SF-MSCs之间的交互和微载体悬浮培养。基于这个结果,未来所有的实验研究中包含连续搅拌40 rpm在第一个24小时。

3.1.2。血清水平的影响

培养基的影响血清水平(0%、5%或10%对卷)在接种阶段进行了研究,因为它已被证明影响附件骨骨髓来源间充质干细胞的效率(BM-MSCs)微载体(36]。应该注意的是,在这项研究中使用的所有微载体已经暴露于培养基包含相应的血清内容一段18 h之前被放置在转轮瓶(即。的场景已经预镀5%和10%血清)。此外,24小时后接种阶段,转轮的玻璃瓶都超过120毫升的最后一个工作容积中,这样的边后卫的最终浓度为10%在所有情况下都在增长阶段。图2(一个)说明了相似的细胞附着,不管血清水平在接种后的第一个小时,用表面的细胞出现在所有情况下圆形珠子。然而,24小时后,大部分细胞5%和10%血清条件已经扩散,而许多细胞0%血清仍圆表面上。

结果呈现在图2 (b)表明,0%血清条件在接种没有随后支持细胞生长的5%和10%条件一样有效。不仅0%血清接种导致长时间的停滞阶段,但在10天之后,7.75×10的指数增长率⁻³h⁻¹相比大大降低了0.0159 h⁻¹和0.0160 h⁻¹血清,分别为5%和10%。获得的最大细胞密度在0%血清的10天接种条件也显著低于5%和10%的病例。最大的细胞密度在5%血清高于最大的细胞密度达到10%的血清。最大密度在5%血清为9.66×10⁴细胞/毫升相比8.62×10⁴细胞/毫升10%血清。

Schop et al。36)和Forestell et al。41)公布高附件效率在0%到5% (v/v附件)血清水平的哺乳动物细胞在Cytodex 1微载体相比,10%血清水平。他们推测血清降低表面疏水性,从而产生负面影响细胞附件。相反,据报道,预涂Cytodex 2微载体(交联葡聚糖矩阵)和胎牛血清的比例减少空置的珠子7小时后接种,从而提高连接效率(48]。的边后卫是包含许多不同的蛋白质,如纤连蛋白和白蛋白。有人建议,珠子是暴露的边后卫时,白蛋白容易吸附首先,这可能会干扰细胞附件,但随着时间的推移,白蛋白被替换为纤连蛋白,促进细胞附件(48]。预涂的微载体与血清也已被证明能够加强其他细胞类型的附件,包括人类骨骨髓来源msc CultiSpher-S珠(49]。当前的结果清楚地表明,在接种阶段只改变一个条件可以在随后的细胞产量产生重大影响。根据获得的结果,后续实验用培养基含有5%血清预涂层的微载体18个小时期间,也孕育阶段。

3.1.3。细胞微载体加载和珠比的影响

细胞珠比另一个重要因素影响最终生物反应器细胞产量直接影响cell-bead互动的频率,一个必要的细胞附着的前奏。在理想的情况下,初始细胞珠比应该团结,如果它可以确保每个珠只允许单个细胞的附件。然而,在接种阶段,每个微载体的细胞数量已被证明遵循泊松分布(41,42,45]。因此,一些微载体将有多个细胞附着在其表面,虽然微载体的一部分可能不会被任何细胞。因此,为了确保占领大部分珠子在接种的最后阶段,需要有一个细胞珠比大于团结。根据泊松分布,空微载体是理论化的比例小于2%时,细胞珠比等于或超过一个值为4。

调查的影响细胞珠比和微载体加载在附件的SF-MSCs Cytodex 3微载体,一个二级因子设计进行了实验。微载体载荷1 g / L或2 g / L Cytodex 3被使用,这对应于可用的表面积的2.7厘米²/毫升和5.4厘米²/毫升,分别。细胞珠比选为基线值4.5细胞/珠,相当于5000个细胞/厘米²通常用于接种静态组织培养瓶。较低的细胞珠比2.25细胞/珠也被评估。而这可能导致更大比例的空置的珠子的孕育阶段,低密度接种可能导致更大的整体细胞成倍增加。细胞珠比率高于4.5没有评估,因为这需要大量的细胞接种,可能会导致较低的细胞成倍增加的很大一部分细胞附着和随后可能会失败灭亡,从而浪费培养液。

如图3,发现1 g / L和2 g / L微载体加载、播种密度2.25细胞/珠没有达到最终的细胞密度与那些通过使用播种密度4.5细胞/珠。此外,在播种密度2.25细胞/珠和一个微载体加载1 g / L,为期3天的观察停滞阶段。这些趋势类似研究中报道了胡锦涛et al。(42),据报道,关键需要每个微载体的细胞数正常的增长模式。2.25的增长率在对数生长期细胞/珠1 g / L和2 g / L类似0.0103 h⁻¹和0.0102 h⁻¹,分别。指数增长使用4.5细胞/珠0.0159 h⁻¹和0.0118 h⁻¹1 g / L和2 g / L,分别。降低增长率较高的微载体载荷曾被观察到其他细胞类型和在这种情况下被归因于增加bead-to-bead碰撞导致细胞损伤和死亡50]。保持相对较高的细胞的异常在文化,和大量的细胞碎片没有观察到在增长阶段,表明碰撞在高频率的增加珠载荷可能会降低增长和扩散而不一定杀死细胞。然而,这种碰撞的积极作用,是细胞的转移从一个珠到另一个地方。正如预期的那样,大多数的细胞微载体至少有一个连接后,显微镜下分析了24小时。然而,在成长阶段,空的微载体观察表明减少细胞的数量已经从细胞空珠珠,珠粒碰撞期间或通过一个超然的过程到周围介质然后回贴。

基于获得的迟滞期缩短和增加增长率使用4.5细胞/珠时,这一比率被选为所有未来的实验。尽管增长率越高在1 g / L, 2 g / L的初始微载体加载被选为未来的研究(我)支持细胞增殖,(2)提供了一个两倍的表面积与体积比1 g / L的珠子,类似于用于静态文化容器(一般在4.2和6.1厘米之间²/毫升)和(iii)支持理论最大体积细胞密度的两倍(细胞/毫升)加载1 g / L的珠,这是一个重要的考虑因素,因为它意味着两倍的细胞有可能产生在一个给定的船。

3.2。增长阶段

有利的参数一旦确定接种阶段,假设的变量影响细胞在生长阶段人口膨胀。具体来说,搅拌速率和周期性介质补给的影响进行调查,以确定它们对细胞生长动力学的影响。在这些实验中,接种参数选择(连续搅拌在40 rpm, 5%血清培养基,4.5细胞/珠,和一个2 g / L的微载体加载)被应用于所有文化第一24小时。末尾的孕育阶段,不同搅拌速率和喂养模式进行了测试在整个生长阶段。

3.2.1之上。搅拌速度的影响

搅拌在microcarrier-based悬浮培养有几个作用:(i)创建一个更同质的文化环境,(2)介绍了剪切应力到文化环境中,(3)它提供微载体之间的碰撞能量,和(iv)增加传质(41]。而更均匀的环境和增加营养运输可能有利于细胞的文化,高剪切应力可以破坏细胞附着在表面,促进细胞的分离微载体的表面,并导致强烈的微载体之间的碰撞导致细胞死亡(50]。它已经表明,剪切应力低至6.25达因/厘米²可能足以消除细胞表面,与10 - 30达因/厘米吗²导致细胞损伤(51,52]。由于剪应力和碰撞能量相关生物反应器搅拌速率、搅拌速度是操纵评估SF-MSC上剪切扩散的影响。初步实验表明,较低的搅拌速度40 rpm的转轮烧瓶足以维持Cytodex 3微载体悬浮并提供同质,混合环境中(数据未显示)。

据报道从聚合研究婴儿仓鼠肾(博鸿泰)细胞经历的最大剪应力细胞表面的一个聚合范围从0.8达因/厘米²5.6达因/厘米²搅拌的25 rpm 100 rpm (52]。先前的研究在我们实验室涉及神经干细胞聚集在同一旋转瓶生物反应器用于在当前的研究中发现,剪切应力所经历过的一个细胞的表面聚合范围从4.9达因/厘米²9.86达因/厘米²搅拌速率的100 rpm rpm ([53];其中,et al ., 2006)。因为这些剪切应力值都小于那些已报告破坏细胞固定化骨料表面或静态表面,搅拌的40 rpm, 60 rpm, 80 rpm在本研究评估。

虽然没有证据表明之间的显著差异扩散的搅拌速率测试,稍长的滞后阶段观察到80 rpm(图4(一))。很可能突然从40 rpm接种期间增加到80 rpm的增长阶段导致了一些珠子的细胞分离。40岁rpm, 60 rpm, 80 rpm,对数生长期增长0.0128 h⁻¹,0.0123小时⁻¹和0.0126 h⁻¹和最大细胞密度分别获得三个搅拌速率之间的非常相似。然而,最大的细胞密度在80 rpm发生迟于较低的搅拌速度,大概是因为的迟滞期延长。相似的细胞扩张以不同的搅拌速度表明,剪切并不是一个重要因素影响增殖率范围内测试。此外,水平没有明显不同培养基的细胞碎片的实验,表明细胞不被摧毁的搅拌速度进行测试。既然没有发现显著差异,40 rpm的风潮是所有后续研究中使用,因为这可以促进从接种阶段过渡到增长阶段。

3.2.2。喂养效果方案

细胞在文化的快速扩张会导致损耗的关键营养物质如葡萄糖和谷氨酰胺培养基,同时增加废物代谢产物的水平包括乳酸和铵离子。缺乏营养物质和废物的存在可能最终细胞产量产生负面影响。在文献中有许多例子表明,普通介质的变化,部分花了培养基的拆除,代之以同等体积的新鲜培养基,可以扩展的生产生活文化和增加细胞产量,其中包括骨骨髓来源MSC文化(46]。

来确定介质组件限制SF-MSC悬浮培养的增长,中等补给的影响评估通过细胞培养一批文化,没有介质补货,或者循环馈料式文化,在执行中补充50%天3、6和9。增长超过10天的周期曲线生成批处理和循环馈料式条件如图4 (b)。由于最初的类似的增长模式,批处理和循环的指数增长率馈料式文化(从2天6)都是0.0136 h⁻¹。然而,喂养扩展的生活文化,从而允许更大的整体的细胞产生。最大的细胞密度达到循环馈料式文化是1.89×10⁵细胞/毫升(第十天)显著高于实现批处理文化,1.19×10⁵细胞/毫升(第七天)。这个翻译成一个可行的细胞增长7.0折10天在循环馈料式条件下,相比只有4.4批处理条件下在同一时间内。重要的是要注意,这些结果也表明,微载体表面积不是限制在批处理文化和缺乏细胞生长超过6天可能是因为营养消耗或浪费而不是在中积累。

营养和代谢废物浓度监控整个为期10天的生长期为批处理和循环馈料式文化。SF-MSC葡萄糖和谷氨酰胺消费率在增长阶段批文化中被计算为3.88×10⁻¹⁰更易与细胞·h和2.41×10⁻¹⁰分别更易与细胞·h。这些利率相媲美的一项研究中获得的值,发现人类骨髓msc的葡萄糖消耗平均3.83±0.69×10⁻¹⁰更易与细胞·h (54]。此外,乳酸和铵的生产速度在增长阶段批文化是1.95×10⁻⁹更易与细胞·h和1.74×10⁻¹⁰分别更易与细胞·h。乳酸的产量超过葡萄糖(Y_{Lac /相关})在生长阶段批文化为2.94摩尔/摩尔。值高于理论最大值2摩尔/摩尔,表明乳酸产生从其他来源(即。谷氨酰胺)(49]。Y_{Lac /相关}值从1.4到6.5摩尔/摩尔已报告之前对间充质干细胞(36]。从葡萄糖氨的产量是0.689摩尔/摩尔。仅为2.0毫米的氨气报道抑制人类msc的增殖,而乳酸浓度超过24毫米抑制效果变得明显之前可能需要(54]。基于浓度配置文件,批文化中氨的浓度接近2.0毫米6天后在文化、氨的浓度在所有循环馈料式文化没有超过1.5毫米(数据未显示)。自营养资料表明,葡萄糖和谷氨酰胺没有耗尽,可能抑制氨水平可能发挥了作用降低扩散批文化观察,作为最大的细胞密度也取得了6天。另一个可能性是,加入新鲜培养基补充其他媒介组件,如氨基酸(55),耗尽而不是测量在这项研究中,从而导致较高的细胞密度循环馈料式文化。

基于这项研究的结果,50%的培养基补充大约每3天就被纳入标准的协议维护人类SF-MSCs悬浮培养。

3.3。串行亚文化在微载体

而喂养研究清楚地表明,文化的寿命可以延长取代了媒介与新鲜培养基,细胞最终的产量是有限的微载体提供的有限面积的单层生长。增加细胞产量超过这一水平,研究了两种策略:(i)系列使微载体的文化和(2)bead-to-bead转移。在串行使方法,通过细胞是从微载体使用胰蛋白酶然后reinoculated新文化船只与新鲜微载体和文化媒介。在这种方法中,产生的细胞总数将增加随着时间的细胞接种到越来越多的船只或大血管能够支持更大的文化卷。bead-to-bead传输方法,新的微载体被添加到现有的培养容器和条件操作从支流珠子鼓励细胞迁移到新的空置的珠子在同一个容器中。成功bead-to-bead转移曾报道了猪msc (45],山羊msc [46),和人类msc (36,47生长在不同的微载体。假设这两种方法的成功,一个主要的优势bead-to-bead转移在串行使微载体的文化是文化可以保持在一个容器在较长一段时间以最小的细胞处理。这不仅会降低细胞接触的次数蛋白酶胰蛋白酶,但它也会降低污染的概率。此外,如果一个容器变得太小,不足以支持靶细胞数量,整个文化体积可以被转移到一个更大的生物反应器以及新鲜的珠子不需要首先使胰蛋白酶化细胞从现有的珠子。

3.3.1。连续使

SF-MSCs扩展到通过5在静态组织培养瓶被接种到微载体文化和前面描述的接种和增长的协议。六天之后,从微载体细胞收获胰蛋白酶化和接种到新船连续三段落包含新鲜微载体(6天)在相同的条件下。数据5(一个)- - - - - -5 (c)显微照片显示了文化的第六天连续三个段落。每个后续的通道,减少总细胞和一个更大比例的空置的珠被观察到。细胞密度是绘制在图的三个段落5 (d)。虽然数据显示,收获细胞微载体能够重新接上,他们无法增殖细胞一样的程度,从静态收获组织培养瓶。

胡锦涛et al。(56]系列报道传播人包皮成纤维细胞在交联葡聚糖微载体(右旋糖酐珠)。尽管在当前的研究中使用的细胞能够重新接上新微载体和继续增长,扩散的程度被发现与每个后续接种略有减少。类似的结果是被Forestell和他的同事们(57)对人类胚胎肺成纤维细胞的串行亚文化Cytodex 1微载体。他们发现显著降低细胞生长与每个转移从船到船。Forestell et al。57)能够克服减少扩散通过减少内容和开发一个定制的血清培养基补充。在未来这将是审慎的检查使用定义增长媒体检查血清水平如何影响SF-MSC行为在串行亚文化。分析了培养基在三个连续的段落表明,葡萄糖和谷氨酰胺没有枯竭,和废物代谢物浓度也维持在低水平(数据没有显示)。因此,减少增长很可能不是营养相关。

3.3.2。Bead-to-Bead转移

bead-to-bead转让的有效性SF-MSCs Cytodex 3微载体悬浮培养过程评估。虽然前面几节中所开发的协议使用微载体加载2 g / L,文化开始只有1 g / L为这个研究微载体会定期添加到文化,因此,高表面积与体积比的好处最终将实现无论初始珠加载。此外,1 g / L的微载体加载被证明是有效的,和一个较小的初始加载也意味着需要更少的细胞培养液。4.5转轮烧瓶最初接种细胞/珠和一个微载体加载1 g / L在80毫升5%的边后卫DMEM和搅拌连续40 rpm第一24小时。24小时后,转轮的玻璃瓶被超过了额外的40毫升的媒介和血清水平的边后卫DMEM调整到10%。每6天,1 g / L的新鲜微载体添加到文化和文化量减少到80毫升,在40 rpm间歇性搅拌3小时(3分钟,27分钟)。间歇搅拌被选中,是因为工作由王欧阳(58涉及维洛细胞(即)。,一个frican green monkey kidney cells) on Cytodex 3 showed that this operational mode enabled microcarriers to be in close proximity long enough for cells to effectively migrate from one bead to another. Whereas bead-to-bead transfer is also possible through collisions while in suspension, this latter approach can be traumatic and lead to cell damage and cell death. After 3 hours of intermittent agitation, cultures were stirred continuously at 40 rpm. The spinner flasks were topped up with an additional 40 mL of culture medium 24 hours after the microcarrier addition. 50% medium replenishments were performed on days 6, 9, 12, 14, and 16.

间歇搅拌3小时后停止是因为显微照片显示,许多新珠子已经获得细胞后时间(数据6(一)- - - - - -6 (d))。24小时后的新鲜微载体,剩下的空的珠子的比例进一步下降相比,3小时postmicrocarrier加法。类似于前面提到的在接种阶段观察研究,这再次表明,细胞微载体之间还可以转移期间连续搅拌。转移人类BM-MSCs Cytodex 3珠子在风潮也观察到休伊特et al。44]。细胞粘附在细胞分裂削弱,可能正是在有丝分裂,细胞能够脱离原来的微载体和再植新珠59]。

由两个捐赠者的细胞增长曲线如图所示6 (e)。活细胞密度的稳定增长表明,bead-to-bead转移方法一起喂养是一个可行的方法,使长时间细胞生长在一个容器里。此外,固定相是没有达到表明细胞产量可能会进一步增加了实验被允许继续下去。在文化18天之后,最大的细胞密度为2.87×10⁵细胞/毫升实现捐赠1,这相当于增加了21.3倍数量的细胞。此外,每个新细胞生成所需的介质体积只有1.28×10⁻⁵毫升是将近一半的每个新细胞生成所需的静态文化(2.40×10⁻⁵毫升)在18天。这些值代表总介质的要求,包括介质的变化。因此,这不仅是更具成本效益的方法,但它也克服了需要定期公开细胞酶和显著减少劳动力需求频繁使并不是必要的。基于研究迄今为止,很明显,微载体技术可以用来有效地扩大人类SF-MSCs悬浮生物反应器。然而,一系列的表征的研究需要,以确保这种扩张模式的细胞没有不利影响这些细胞的定义的品质。

3.4。在悬浮培养细胞特征后扩张

SF-MSCs扩张18天在悬浮培养使用bead-to-bead传输方法的特征被提取,然后表面标记和分化潜力确定他们保留特征。Uninduced文化,以及细胞生长在静态条件下,被用作控制。

3.4.1。细胞表面标记的概要文件

表面标记面板分析是CD34、CD45 CD73, CD90、CD105。这个选择是基于标准的Dominici et al。14哪个州,人口获得理学硕士学位必须表达CD73, CD90、CD105和必须表达CD34、CD45的缺乏。捐赠者的表面标记资料呈现在图1和图27和表明,捐赠者有高表达水平正制造商和低表达水平负标记后培养使用我们的协议进行了优化。

3.4.2。分化潜能

Multipotency化验进行验证细胞群扩大在微载体在搅拌条件下使用新开发的协议保留他们接受trilineage分化能力。其他研究人员先前表明,来源于msc的骨生长在CultiSpher-S Cytodex 1和3微载体保留其成骨和脂肪形成的分化潜能36,37,47,49]。

骨生成和脂肪形成定性验证了staining-induced文化与茜素红和油红O,分别如图8(一个)和8 (b)。两个不同的分析来验证软骨形成。首先是进行细胞颗粒大小分析曾暴露于chondrogenic因素通常用来区分msc向chondrogenic血统。诱导后,细胞不会扩散,所以诱导颗粒大小的增加而uninduced颗粒的细胞将显示一个upregulation细胞外基质的生产。细胞生长的微载体悬浮培养,发现诱导颗粒明显大于uninduced控制半径估计为700μ相对于490μm,分别为( ;参见图8 (c))。这个结果表明,细胞保持接受chondrogenic分化的能力即使被放置在悬浮培养。chondrogenic容量的确定悬浮培养的细胞生长改变相对于细胞培养在传统的静态组织培养瓶,msc扩张18天在静态文化与悬挂文化也是颗粒状,然后chondrogenically诱导或uninduced离开了。对于这些静态培养细胞,发现诱导颗粒明显大于uninduced控制半径值估计有690μ相对于400μ米,这类似于细胞悬浮培养的结果。这些结果强调chondrogenic能力的细胞没有负面影响被放置在微载体悬浮培养。

第二个分析软骨形成相关执行咽颗粒分析。悬浮培养的细胞生长,平均GAG内容uninduced SF-MSC控制从捐赠者1和2分别为0.47±0.31μg和0.51±0.05μ分别g,而在诱导丸,捐赠者的GAG水平显著高于1和2为10.24±0.39μg和6.74±1.26μ分别为g(见图8 (d))。静态文化中细胞生长,诱导呕吐水平控制分别为9.94±0.04μg和8.89±2.63μ分别为1和2 g捐赠者。观察到的差异区别两者之间的潜在捐助者可能归因于内在donor-to-donor可变性,或者由于供体年龄的差异。Donor-to-donor可变性MSC人群通常发表在文献[25,54,60]。此外,人们普遍认为,MSC功能随年龄增长而下降(61年,62年),从而导致任何观察到的细胞之间的行为差异来自不同年龄捐助者,尽管chondrogenic潜在synovium-derived msc年龄已被证明是独立的(De巴里et al ., 2001)。

4所示。结论

间充质干细胞分离咬合关节滑液的有可能被用于软骨修复策略。然而,临床应用的发展需要大量的细胞。这项工作显然说明微载体技术在可伸缩的悬浮培养生物反应器可以提供所需的受控环境扩大滑膜fluid-derived间充质干细胞在不影响他们的特征,从而提供一个可行的选择使用组织培养瓶。此外,这种方法被发现有效的从多个供体细胞。人工繁殖的能力支持扩张不同捐赠者的干细胞数量是一个重要的考虑在开发生物处理的临床用途。

的利益冲突

作者指出任何潜在的利益冲突。

作者的贡献

克里斯汀·d·乔根森进行研究和参与设计实验,分析数据,写论文。大卫·a·哈特参与设计实验,分析数据,写论文。罗马Krawetz参与收购和隔离T-flasks本研究中使用的细胞群在回顾手稿。Arindom森参与设计实验,分析数据,撰写论文。

确认

这个项目的资金是通过一个艾伯塔创新——健康解决方案(AIHS) CRIO项目格兰特(Arindom Sen,大卫·a·哈特),加拿大自然科学和工程研究理事会(NSERC) (Arindom Sen),加拿大卫生研究院的研究(CIHR) (Arindom Sen,大卫·a·哈特)和AIHS OA团队格兰特(Arindom Sen,大卫·a·哈特和罗马Krawetz)。

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