文摘

间充质干细胞(msc)再生医学治疗领域的重要性和免疫疾病。因此,研究评估临床应用的msc正在增加。在这项研究中,我们从牙周韧带为msc,脐带(UC-MSCs)和脂肪组织,这是相对容易获得有限的道德问题对他们的收购,并比较其免疫学特性。在msc从三个不同的组织分离,UC-MSCs增长最快的在体外。所示的三种类型的msc是抑制扩散激活外周血单核细胞(PBMCs)类似的程度,通过吲哚胺2、3-dioxygenase和cyclooxygenase-2通路。他们也显示出抑制使用HLA-G PBMCs扩散,在UC-MSCs最突出的。与其他两种类型的msc、UC-MSCs显示最小的表达HLA-DR激活后,建议他们带来的风险很小的启动一个同种异体免疫反应在活的有机体内。这些特征,易于收集和最低限度的道德问题对他们的使用建议UC-MSCs合适MSC治疗候选人。

1。介绍

间充质干细胞(msc)人口的成体干细胞在组织具有multipotency和自我更新能力。msc可以分化成各种各样的特殊细胞,如心肌细胞(1),神经元(2),肝细胞(3),除了脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞(4]。因此,msc在再生医学(可能有各种各样的应用5,6]。

msc的一个重要特征是其免疫抑制功能。msc抑制激活T细胞的增殖分泌物质,如吲哚胺2,3-dioxygenase (IDO)和前列腺素E2 (PGE2)(综述(7),以及抑制编程death-ligand 1 (PD-L1) [8]。他们也抑制促炎症的发展Th17细胞和刺激分泌调节性T细胞的免疫抑制细胞因子白细胞介素- 6 (il - 6)、il - 10,肝细胞生长因子(HGF) [7]。由于他们的免疫调节作用,msc一直探索慢性炎症和免疫疾病的潜在治疗药物(9]。

事实上,严重的移植物抗宿主病(GVHD)被使用骨骨髓来源msc (BM-MSCs)从病人的母亲,这是第一个临床应用msc (10]。此后,MSC的一些研究已经和正在应用于临床前和临床设置(11]。BM-MSCs已经使用在大多数这些研究的“黄金标准”,因此已经研究的很透彻了。

然而,也有几个缺点BM-MSCs的治疗用途。首先,收集入侵和效率低与其他来源的msc(相比12]。此外,与衰老BM-MSCs减少的数量和分化潜能(13]。

基于这些特点,先前的研究探索了其他潜在的组织获得msc为临床使用,其中一个是脂肪tissue-derived msc (AD-MSCs)。在2000年代早期,许多调查人员隔离和多功能干细胞特征从脂肪组织,分享相似特征的BM-MSCs [14,15]。AD-MSC集合的方法是微创,收益率大约是100 - 500倍以上,BM-MSCs [16]。

msc的另一个潜在来源是脐带(UC-MSCs)。收集UC-MSCs非侵入性,因为它们是在分娩后获得医疗废物丢弃。隔离过程是很容易的,大量的msc可以收集之前在体外扩张(12]。UC-MSCs的另一个优点是,它们的增长速度比BM-MSCs(倍增时间短),在较高的通道数量是可行的。此外,UC-MSCs分泌更高浓度的免疫调节物质,如il - 10,引发,TGF -β2,HGF [17]。

牙周韧带干细胞(PDLSCs)在2004年被发现18),可以隔绝丢弃的牙科手术后组织。他们缓解隔离是有利的可访问性,还有关于他们使用最低限度的道德问题。

先前的研究从不同的组织起源BM-MSCs msc相比,黄金标准,确定一个更好的为临床使用msc。这些研究表明,广告,和/或取代BM-MSCs UC-MSCs是很好的候选人。

然而,有限的PDLSCs之间作比较和其他msc。一项研究UC-MSCs相比,AD-MSCs, PDLSCs [19),但没有调查他们的免疫特性。自从MSC很容易从这三个组织,获得直接比较的MSC人口的重要性。

在这项研究中,我们比较这三种不同来源的msc基于多能性,immunophenotype和其他免疫属性。我们发现PDLSCs与加州大学——和AD-MSCs基于免疫学特征。然而,从实际来看,UC-MSCs被认为是优于其他两个msc的来源。

2。材料和方法

2.1。隔离和msc的准备

在这项研究中使用的msc收集从三个不同的组织,包括脐带、脂肪组织和牙周韧带。AD-MSCs和UC-MSCs准备如前所述[20.,21]。PDLSCs隔绝人类前磨牙,提取健康的成年人提供同意矫正的目的。牙齿与I型胶原酶消化(Wako、东京、日本)和dispase(美国纽约Gibco,大岛)alpha-minimum重要介质(αmem;Gibco) 2毫克/毫升的浓度为1小时37°C。消化样品经过70人μ过滤器(猎鹰®,康宁,纽约,美国)来获取单个细胞,这在37°C和5%孵化有限公司₂在αmem补充10%胎牛血清(的边后卫;Gibco), 2毫米l谷氨酰胺(Gibco), 100 U /毫升青霉素(Gibco)和100毫克/毫升链霉素(Gibco)。一旦confluency文化达到90%,细胞亚文化或存储在液氮中。通过p4 ~ 8细胞被用于这项研究。我们的研究协议的机构审查委员会批准首尔国立大学(snu - e - 1107 - 017 - 368和snu j - 1511 - 005 - 715)。

2.2。Immunophenotyping

1×10的整除⁵msc被清洗和悬浮在PBS补充0.1%的边后卫。细胞被孵化与anti-CD34-PE anti-CD45-PE、anti-CD73-PE anti-CD90-FITC, anti-CD105-FITC, anti-CD80-FITC, anti-CD86-PE, anti-CD154-PE, anti-CD40-PE, anti-HLA-ABC-FITC或anti-HLA-DR-FITC抗体(美国圣地亚哥从BD CA) 30分钟在4°C,然后在PBS含有0.1%的边后卫洗两次。细胞被resuspended在200年μL PBS含有0.1%的边后卫和分析在10000事件/测试使用FACSCalibur (BD生物科学)或NovoCyte(究其生物科学公司,圣地亚哥,美国)。数据分析使用NovoExpress 1.2.1软件。

2.3。MSC分化

msc诱导分化成脂肪细胞,成骨细胞、软骨细胞使用StemPro分化工具包(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。媒介改变了每周两次。分化的脂肪细胞,成骨细胞和软骨细胞固定在4%多聚甲醛溶液在天14日28日和21的文化和沾红O (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),茜素红S (Sigma-Aldrich),或阿尔新蓝(Sigma-Aldrich),分别。

2.4。增殖率的估计

MSC增殖率评估使用细胞计数Kit-8 (CCK-8;Dojindo、日本)根据制造商的协议与小修改。简单地说,5×10³细胞/暂停在96孔板一式三份和维持在37°C和5%的公司₂。每个孵化了10μL CCK-8解决方案2小时,之后450海里的吸光度测量使用VICTOR3™Multilabel板读者(美国PerkinElmer沃尔瑟姆,MA)。此外,细胞数直接使用TC10™自动细胞计数(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)为进一步支持CCK-8化验的结果。

2.5。外周血单核细胞(PBMC)准备和激活

人类PBMCs隔绝健康捐献者血液样本(提供知情同意)使用Ficoll-Paque +密度梯度。收集PBMCs被播种在96孔板2×10⁵/包含100μL RPMI 1640介质(Gibco)补充与青霉素、链霉素和10%的边后卫。细胞被刺激anti-CD3 / CD28 antibody-coated珠(1:2 bead-to-cell比率,Dynabeads®人类T-Activator CD3 / CD28;生活技术,挪威奥斯陆)。

2.6。MSC激活

msc被激活使用两种不同的方法:使用条件培养液(厘米)或干扰素-γ。CM是来自PBMC文化的上层清液,这是收获后3天的激活细胞,如上所述。干扰素-γ(PeproTech落基山,新泽西,美国)添加到培养基的最终浓度1或10 ng / mL,。随后,文化是孵化24小时为平移激活转录激活和48小时。

2.7。抑制PBMC msc增殖

二乙酸PBMCs装满5,6-carboxyfluorescein succinimidyl酯(CFSE)孵化的文化中包含1μM CFSE 30分钟。在4×10 CFSE-labeled PBMCs被播种⁵/在包含500 24-well板μL R10介质(RPMI, 10%的边后卫,青霉素、链霉素和100 U /毫升)。天真的MSC被添加到板获得理学硕士学位:PBMC的比例1:25日,1:100年,或1:400。必要时,0.1毫米ns - 398 (cox - 2抑制剂;Sigma-Aldrich), 1 - 0.1毫米l色氨酸(1-MT)(一个被罩抑制剂;Sigma-Aldrich),或对HLA-G中和抗体(克隆87克;EXBIO、行星齿轮、捷克共和国)添加到coculture。使用的抑制剂的浓度测定的最大浓度维持细胞生存能力90%以上为MSC和PBMC文化,作为由CCK-8分析(数据没有显示)。中和抗体的浓度是基于先前的报道。一个IgG2a抗体(Diaclone,克隆B-Z2)作为控制同形像。t细胞增殖测定后3.5天coculture CFSE流仪分析的荧光强度。

2.8。RNA分离和聚合酶链反应(PCR)

总RNA从msc纯化使用RNeasy迷你包(试剂盒)根据制造商的协议。RNA样本resuspended pyrocarbonate-treated二乙酯水,量化,并存储在−80°C到使用。使用Transcriptor互补脱氧核糖核酸合成第一链cDNA合成装备(罗氏应用科学、巴塞尔、瑞士),并使用PCR PCR进行主组合工具包(Bioneer、大田、韩国)。35个循环后,PCR产品受到2%琼脂糖凝胶电泳。乐队是可视化的紫外线照射下,使用多映像和图像捕获光内阁。乐队的密度进行了分析和归一化参考RPS18使用数量一个软件(Bio-Rad实验室)。表中提供的用于rt - pcr引物1。

2.9。酶联免疫吸附试验(ELISA)

TGF -的浓度β1、HGF和可溶性HLA-G文化上层清液由ELISA测定使用人类TGF beta 1白金酶联免疫试剂盒,HGF人类酶联免疫试剂盒(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)和sHLA-G酶联免疫试剂盒(BioVendor,布尔诺,捷克共和国),分别遵循制造商的指示。光密度测量在450 nm使用VICTOR3 Multilabel板读者(美国PerkinElmer沃尔瑟姆,MA)。从三个独立的实验,重复的样本。

2.10。统计分析

统计分析使用GraphPad棱镜6软件(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)或SPSS 11.5对Windows。这些数据意味着±SD。进行了对比实验小组用单向方差分析(方差分析)或学生的t以及。图基的事后分析被用来确定统计学意义差异实验团体 认为指示意义。

3所示。结果

3.1。表征PDLSCs

最初,我们证实了细胞分离牙齿干细胞,会见了特征概述了国际社会的细胞治疗(ISCT) [4]。细胞坚持培养板和增长(数据未显示)阳性CD73, CD90、CD105、CD34呈阴性,CD45和HLA-DR(图1(一))。这些研究结果类似AD-MSCs [20.]和UC-MSCs [21),尽管平均荧光强度的细微差异(MFI)值一些标记。例如,CD90表示最强烈地从牙齿干细胞,而CD105 AD-MSCs中高度表达。随后,我们评估的能力向脂肪细胞分化PDLSCs,成骨细胞和软骨细胞。在这个实验中,通过5细胞(p5)使用,成功地分化成三个类型的细胞,这是符合UC-MSC和AD-MSC分化能力(图1 (b))。

总的来说,我们的研究表明,细胞从牙齿标本分离msc(即。PDLSCs),因为他们遇到了干细胞ISCT定义的标准。

3.2。UC-MSCs增长快于AD-MSCs PDLSCs

考虑到1000万年msc /公斤需要在临床应用22)、快速和广泛的在体外扩张的msc是很重要的。因此,PDLSC增长率与加州大学——AD-MSCs相比,使用p5细胞。细胞的数量估计使用CCK-8试验(图2(一个))或直接使用一个自动计算细胞计数器(TC10;Bio-Rad实验室(图)2 (b))。计算PDLSCs翻倍时间,UC-MSCs AD-MSCs是42.7,32.1,和56.4小时。的倍增时间PDLSCs AD-MSCs短得多,但比UC-MSCs更长。换句话说,UC-MSCs增长1.33 - 1.75倍的速度比PDLSCs AD-MSCs,分别。

3.3。PDLSCs、UC-MSCs AD-MSCs PBMCs抑制扩散激活

msc免疫抑制正在考虑他们抑制t细胞增殖在体外(23]。比较之间的免疫抑制行为的三个来源MSC、CFSE-loaded PBMCs被激活与anti-CD3 / CD28 antibody-coated珠子的每种类型的MSC在不同MSC: t细胞比率,之后通过流式细胞术CFSE强度进行了分析。我们的结果表明,更多的MSC (MSC: PBMC比率从1:400 - 1:25),分裂细胞的比例分数显著下降(图是PBMCs之一3(一个)和补充图1一),无论组织来源。抑制在特定细胞比率相似的程度在所有三个msc的来源。

抑制t细胞是由MSC-secreted物质,如被罩和PGE2 [24,25]。MSC人群中比较免疫抑制的机制,我们研究了相关酶的表达通过rt - PCR分析和观察PCR乐队的所有三个来源或干扰素- MSC在厘米γ治疗(补充图2)。接下来,我们cocultured msc和PBMCs 1: 10比ns - 398的存在(cox - 2抑制剂)或1-MT(被罩抑制剂)(图3.5天3 (b)和补充图1B)。每个抑制剂恢复PBMC增殖,分化细胞的比例分数被改变从12%上升到60%。复苏的大小没有明显不同的msc(图的不同来源之一3 (b))。有趣的是,扩散复苏通过使用ns - 398或1-MT没有显著差异在特定MSC实验。此外,当两种抑制剂,与此同时又增加了效果不是添加剂或协同,回收率(图中没有大幅增加3 (b))。

除了我和cox - 2, msc分泌免疫抑制细胞因子如TGF -β1和HGF [17,23]。因此,我们比较这些细胞因子的分泌在msc。所有三种类型的msc持续分泌的细胞因子,和UC-MSCs显示增加分泌的细胞因子激活干扰素-γ治疗(图4)。

3.4。HLA-G表达,导致抑制t细胞增殖msc

除了我和cox - 2, HLA-G模HLA分子,表达在BM-MSCs [26]和UC-MSCs [27),抑制t细胞增殖。然而,在PDLSCs HLA-G的作用还有待探索。探索其作用,观察HLA-G表达式使用rt - pcr和ELISA(图5)PDLSCs UC -和AD-MSCs,天真和激活状态。msc的激活是通过添加10 ng / mL IFN -γ为24小时。在幼稚的状态,所有msc表示HLA-G1和七国集团(g7)(图5(一个))。然而,当激活,PDLSCs HLA-G1表示,g5,七国集团(g7), UC-MSCs表示g5, g6,和七国集团(g7), AD-MSCs表示g5和七国集团(g7)。HLA-Gs的表达,其分泌的形式,由ELISA(图确定5 (b))。

确定表达HLA-G导致T细胞增殖的抑制作用,CSFE-loaded T细胞激活和培养在培养基中的每个MSC类型包含一个中和抗体对HLA-G(克隆87 g)或鼠标IgG2a抗体。抑制t细胞增殖是适度恢复了87 g的所有三个MSC类型;然而,复苏的t细胞抑制增长最大的UC-MSCs(图5 (c)和补充图3)。

3.5。干扰素-γ治疗HLA-ABC增加,以及HLA-DR表达AD-MSCs PDLSCs,但不是在UC-MSCs

炎性环境已被证明呈现msc被移植HLA和其他costimulatory分子免疫原性(28]。因为许多临床试验使用同种异体msc (22如果],它可能是一个问题在活的有机体内管理msc刺激同种免疫的反应。因此,我们研究了MSC免疫刺激性的变化表面分子激活干扰素- 2天后γ1 ng / mL的浓度(低剂量),报告最大的病人血清浓度(29日),或10 ng / mL(高剂量,这是经常使用的在体外研究)。

CD154表达costimulatory分子如CD40, CD80和CD86干扰素-后并没有改变γ治疗的MSC类型(数据未显示)。每个MSC类型反应不同HLA-ABC和HLA-DR表达式。在PDLSCs,小额信贷机构(数字6(一)和6 (b)HLA-ABC-positive细胞)和频率(数字6(一)和6 (c)大剂量的干扰素-之后)增加γ治疗,但没有重大变化后观察低剂量干扰素-γ治疗。此外,没有任何可见的HLA-DR表达式观察(数据的变化6 (d)- - - - - -6 (f))。在UC-MSCs,该表达式的HLA-ABC HLA-DR并没有受到大剂量干扰素-γ。相比之下,AD-MSCs回应低剂量干扰素-γ,增加了HLA-ABC MFI和大剂量干扰素-γ,显示积极HLA-ABC MFI和频率的增加和HLA-DR细胞。

4所示。讨论

在这项研究中,我们比较msc的特点从三个不同组织分离(牙周韧带、脐带和脂肪组织),很容易获得有限的临床使用的伦理问题。MSC来源比较的分化潜能,增殖率,免疫调节特性和机制,TGF -等其他免疫抑制细胞因子的分泌β1和HGF,和潜在的免疫原性。其中,UC-MSCs倍增时间最短在体外。每个msc本研究显示中使用类似的抑制性影响通过被罩和cox - 2通路激活t细胞增殖。此外,HLA-G-induced抑制效果更突出UC-MSCs比其他msc。没有观察到的表面表达增加后激活干扰素- HLA分子γUC-MSCs,对面msc的效果观察到另外两个来源(即。,增加HLA-ABC和HLA-DR表达式)。

msc的临床使用要求在体外可扩展性。UC-MSCs显示增殖率最高,3至4倍大于AD-MSCs。这些结果与之前的研究相一致的Amable et al。174倍),报告相比AD-MSCs UC-MSCs的可扩展性。的增长率PDLSCs UC-MSCs和AD-MSCs中间。这个序列的可扩展性(即。,UC-MSCs > PDLSCs > AD-MSCs) was observed previously by Trivanović et al. [19]。与此同时,Vangsness et al。30.回顾了1075篇文章,29日文章包含在最后的分析中,得出的结论是,沃顿商学院的果冻组织提供了最有前途的收益率msc。考虑到与老化,干细胞发生各种变化,如降低自我更新和响应性和基因组不稳定性31日),预计从围产期UC-MSCs胚胎组织干细胞增殖率较高而孤立于其他组织。在msc孤立的从不同的围产期组织,包括羊膜、绒毛膜,脐带,UC-MSCs表现出最快的倍增时间(32]。总的来说,这些发现表明UC-MSCs比AD-MSCs更有前途的临床使用和PDLSCs在体外可扩展性。

丁等。33]表明cox - 2表达和PGE2 PDLSC细胞分泌物中发挥关键作用的抑制激活t细胞增殖,抑制由吲哚美辛几乎完全恢复,PGE2抑制剂。作者还观察到没有重大贡献的il - 10, TGF -β或HGF这种机制。然而,他们没有讨论我的角色,这是一个主要因素参与t细胞增殖的抑制msc (25]。这些结果与我们的不同,因为我们只观察到60 - 70%恢复与cox - 2抑制剂ns - 398。另外,我们观察到的相同级别的复苏与IDO抑制剂,1-MT。一项研究探讨了被罩在PDLSCs中的作用,发现语言表达式是刺激干扰素-γ和参与t细胞增殖的抑制作用34]。rt - pcr结果(补充图2)也显示,PDLSCs upregulation IDO的表达与条件孵化后媒体,以及干扰素-γ。我们的研究表明,被罩在PDLSCs重要功能。

有趣的是,1-MT的影响和ns - 398协同和添加剂。被罩发挥它对t细胞增殖的影响通过细胞毒性代谢产物积累的色氨酸,如犬尿氨酸、3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic酸(35,36],cox - 2产生PGE2,直接抑制t细胞增殖增加细胞内营水平(37]。这两个在MSC免疫调节机制似乎是互补的。此外,我们表明,这些影响发生在一个类似的水平在所有msc评估研究(图3)。

在我们的研究中,我们发现HLA-G导致了三种MSC对t细胞增殖的抑制活动。HLA-G分子模HLA类我分子由七个亚型:四个膜结合(HLA-G1 g4)和三个可溶性(HLA-G5 g7) (38]。他们第一次描述了在母胎宽容,他们对各种免疫细胞发挥免疫抑制的影响。HLA-G分子抑制细胞毒性T lymphocyte-mediated细胞溶解(39和t细胞增殖40]。这些分子也提高CD4细胞的发展⁺D25^高FOXP3监管t细胞发育(26),诱导耐受性树突状细胞的发展(41,抑制自然杀伤细胞在细胞分泌HLA-G和邻近细胞溶细胞的功能(26]。因为同种异体msc可能免疫原性(42],HLA-G表达式将有利于allogeneically管理msc移植和生存。HLA-G被证明能增加贪污接受和减少心脏移植排斥的风险(43,44]。

事实上,msc分泌HLA-Gs的几种类型,包括BM-MSCs [45],AD-MSCs [46),胎儿liver-derived msc (46],UC-MSCs [47]。在这项研究中,我们还发现PDLSCs分泌HLA-Gs (G1, G5和G7),类似于UC-MSCs AD-MSCs。我们进一步表明HLA-G导致t细胞抑制msc的性质,如中和抗体实验(图所示5)。务必注意,复苏的t细胞抑制anti-HLA-G中和抗体对UC-MSCs显著高于其他MSC类型。考虑到UC-MSCs来自胎儿组织,这些细胞将使用HLA-G更有效率。先前的研究表明,UC-MSCs分泌HLA-G6,但不是HLA-G5 [47),在我们的研究中观测到的。丁等。27]报道变量表达HLA-G亚型根据UC-MSC克隆。因此,看来HLA-G取决于细胞的分泌对碘氧基苯甲醚msc的克隆和组织来源。

msc被认为是immune-privileged因为他们表达免疫刺激性分子,如CD40、CD156, CD80、CD86,和HLA分子,在低水平48]。然而,几项研究已经提供了相互矛盾的结果。当管理在活的有机体内msc本地化,受伤和发炎的地区(28),是由细胞因子激活,表达表面分子如HLA-ABC /博士,对allorecognition目标分子,从而启动同种异体免疫反应(42]。动物研究表明,同种免疫的反应是由MHC分子(49,50]。在人类临床试验,缺乏数据表明对allo-MSCs免疫反应发生,因为程序主要侧重于安全性和功效只是部分,没有调查潜在的同种免疫的反应(42,51]。因此,它是可能的,同种免疫的反应发生后捐赠allo-MSC治疗。

在这种背景下,upregulation costimulatory和HLA分子的激活msc时关注的管理同种异体msc。因此,我们研究了免疫刺激性表面分子的表达在激活后在msc。我们发现HLA-ABC和HLA-DR表达增加PDLSCs AD-MSCs,但不是UC-MSCs,应对高剂量的干扰素-γ。这些结果与以前的PDLSC和UC-MSC发现协议(27,52]。总的来说,这些结果表明,UC-MSCs更适合同种异体使用比AD-MSCs或PDLSCs。一个重要的发现是,人类UC-MSCs PBMCs相比,仅略有增加血清alloresponsive免疫球蛋白浓度测定,促炎细胞因子,如干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α,当注入人性化的小鼠脾t细胞激活(53),支持UC-MSCs alloimmunogenicity低。

在这项研究中,我们观察到PDLSCs AD-MSCs和UC-MSCs共享类似的特征。然而,我们没有比较分泌分子的角色,如细胞因子、趋化因子、生长因子、各种MSC生物活性介质,在MSC类型。还需要进一步的研究来探索这方面的活动。

5。结论

MSC同种异体临床使用、UC-MSCs PDLSCs和AD-MSCs相比,提供了许多有利的特点包括大在体外可扩展性,使用HLA-G,最小的表达HLA-DR激活。这些特征,除了无害sample-acquisition过程和最低限度的道德问题,表明UC-MSCs是同种异体的最有前途的候选人使用。

信息披露

这项研究的结果提出了作为海报举行第67届会议的韩国解剖学家协会2017年10月18日~ 19日在釜山,韩国。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

Jin-Hee金正日进行概念和设计,收集和/或装配的数据,数据分析和解释;克里斯·h·乔和Hang-Rae金参与数据分析和解释;扶手黄执行概念和设计,数据分析和解释,手稿写作。

确认

这项研究受到了生物和医学技术发展计划的国家研究基金会(NRF)由科技部资助,ICT和未来规划(NRF - 2015 m3a9e6028677)和鼓励教育和研究基金的首尔国立大学医院(2017)。

补充材料

补充1。图1:仪的数据流图2。面板显示了PBMC的剂量依赖性抑制增殖的msc、和面板B显示了复苏的PBMC增殖抑制剂的存在的油或cox - 2抑制剂。独立实验进行了三次,代表概要文件所示。W / o:没有。

补充2。图2:cox - 2的表达和语言在msc。(A) cox - 2的表达和被罩在msc治疗后的媒体(CM) 1天。RPS18被用作控制基因。获得厘米,PBMCs不同t细胞刺激兴奋剂了3天,包括十四烷酸佛波醇酯(10 ng / mL)和ionomycin (50 ng / mL) (PMA / I)、脂多糖(LPS);100 ng / mL),伴刀豆球蛋白A (ConA;1μg / mL),或者anti-CD3 anti-CD28 antibody-coated珠(αCD3 /αCD28 Abs)。表中列出使用的引物1。(B) cox - 2的表达在msc与干扰素治疗后——我γ1天。(C) t细胞刺激自己没有酶的诱导表达。RPS18: S18核糖体蛋白美国。

补充3。图3:HLA-G激活的t细胞增殖抑制作用。流图在图仪配置文件5 (c)。t细胞增殖试验进行了使用CFSE-loaded PBMCs中和anti-HLA-G抗体的存在(αHLA-G Ab)或同形像控制抗体(IgG2a)。所有的实验都独立进行至少三次。