阿奇霉素促进人类牙周韧带的成骨分化干细胞与肿瘤坏死因子-刺激后α

文摘

背景和目的。本研究调查的影响和潜在机制阿奇霉素(AZM)治疗人类牙周韧带的成骨分化干细胞(PDLSCs)刺激后与TNF -在体外α。方法。PDLSCs分离从提取牙齿牙周韧带和MTS试验被用来评估是否AZM和TNF -α有毒性影响PDLSCs生存和增殖。后刺激PDLSCs TNF -αAZM,我们分析了碱性磷酸酶染色,碱性磷酸酶活性,茜素红染色法检测成骨分化。实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)分析检测osteogenic-related基因的mRNA表达,包括RUNX2,OCN,BSP。西方墨点法用于测量NF -κB p65信号通路蛋白磷酸化p65,我κB -α磷酸化,我κB -α,β连环蛋白以及apoptosis-related caspase-8和caspase-3的蛋白质。膜联蛋白V试验用于检测PDLSCs细胞凋亡。结果。肿瘤坏死因子-α刺激PDLSCs降低碱性磷酸酶和茜素红染色,碱性磷酸酶活性,mRNA的表达RUNX2,OCN,BSP在osteogenic-conditioned媒介。AZM增强成骨分化的PDLSCs刺激与TNF -α。免疫印迹分析显示β连环蛋白,加磷p65,磷酸化κB -α蛋白表达减少PDLSCs AZM对待。此外,预处理PDLSCs AZM (10μ20 g / ml,μ肿瘤坏死因子- g / ml)预防α全身的细胞凋亡减少caspase-8和caspase-3表达式。结论。我们的研究结果表明,AZM促进PDLSCs成骨分化在炎症微环境通过抑制WNT和NF -κB信号通路,通过抑制肿瘤坏死因子-α全身的细胞凋亡。这表明AZM有潜力作为牙周炎的临床疗效。

1。介绍

牙周炎是一种慢性传染病的牙周支持组织,而且它是成年人牙齿脱落的主要原因。其病理表现包括牙龈和牙周韧带炎性浸润、牙周袋形成、进步附件丢失,和牙槽骨的破坏1]。越来越多的证据表明之间的相关性牙周炎和系统性疾病如糖尿病,心血管疾病,早产和低出生体重2,3]。最近的一份报告发现牙周病作为非霍奇金淋巴瘤和结肠直肠癌的风险因素(4]。病因证据显示牙周病原体的牙齿牙龈上皮下生物膜是必要的但为牙周炎发展不足。越来越多的证据表明,宿主易感性而不是细菌斑块导致牙周破坏。事实上,宿主炎性反应在牙周炎的发病机制中扮演着重要的角色5,6]。

间充质干细胞(msc)首先从骨髓中分离,具有自我更新、克隆形成单位,和免疫调节特性。值得注意的是,msc可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞(7]。msc扮演了一个重要的角色在组织止血和维持有效的平衡和调节免疫细胞8],msc在骨髓或局部组织受损可能会导致疾病。我们之前证明msc源自牙周炎患者的牙周韧带组织显示分化和免疫调节受损导致牙周组织破坏的发展(9- - - - - -11]。最近的报告表明之间的密切关系受损msc和自身免疫或炎症性疾病12]。事实上,MSC移植是一个成功的治疗自身免疫性疾病,如系统性红斑狼疮的治疗策略(13];干燥综合症,自身免疫性糖尿病,和气道炎症14];系统性硬化病(15];和牙周炎16- - - - - -18]。然而,机制MSC缺乏牙周炎保持定义糟糕的,目前尚不清楚如何恢复MSC功能和炎症微环境中实现牙周组织再生。

阿奇霉素(AZM)是一种临床可用红霉素等大环内脂类抗菌素和克拉霉素(19]。除了他们的抗菌活性,大环内酯类可以调节免疫反应和炎症没有影响自我平衡的免疫(20.]。在上皮细胞和免疫细胞,低剂量的大环内酯类抑制促炎细胞因子和趋化因子的分泌,包括il - 6,引发和TNF -α(21,22]。他们也抑制干扰素γ生产记忆T细胞(23]。CSY0073, AZM导数,缺乏抗生素活性,改善葡聚糖硫酸酯钠的临床评分——(DSS)诱导实验性结肠炎和胶原诱导关节炎(24]。据报道,AZM被运送到牙周组织发炎组织。经过3天的日常管理的单剂量AZM(500毫克),AZM可以检测到6.5天在等离子体,人体的唾液,牙周组织发炎25]。虽然没有明确,控制临床研究的影响AZM牙周炎,AZM抒发如果结合非手术临床和微生物改善牙周治疗(26- - - - - -30.]。此外,一项研究报告说,人类AZM抑制破骨细胞分化和骨吸收31日]。然而,目前尚不清楚是否AZM影响成骨细胞的骨msc在炎症微环境。

本研究分离人类牙周韧带干细胞(PDLSCs)和刺激的促炎细胞因子TNF -体外α。成骨分化和细胞生存能力测定为了研究的影响和潜在机制的成骨分化AZM PDLSCs炎性微环境。我们的研究结果表明,AZM提升PDLSCs TNF -后成骨分化α刺激通过抑制WNT和NF -κB信号通路和衰减TNF -α全身的细胞凋亡。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

所有涉及人类干细胞的研究不遵守“人类胚胎干细胞研究的行为指南。“PDLSCs隔绝健康志愿者没有牙周疾病史和相对健康的牙周组织。所有的实验后天津医科大学口腔学院的指导方针。我们获得的书面知情同意所有的志愿者之前,收集他们的细胞。PDLSCs分离、培养和鉴定如前所述[32]。一般来说,中间三分之一的牙周韧带是提取牙根的表面,然后进行梯度洗。接下来,剁碎组织在解决消化3毫克/毫升胶原酶I型+ 4毫克/毫升dispase (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)1 h在37°C。

从所有的志愿者汇集PDLSCs。一个单细胞悬液制备通过细胞通过一个70年μ过滤器(猎鹰,BD实验室的器具,富兰克林湖,新泽西,美国),和PDLCSs镀完成αmem(美国UT HyClone, Logan)加上20%的边后卫(美国Gibco,卡尔斯巴德,CA), 100 U /毫升青霉素,100μg / ml链霉素(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。细胞培养在37°C 5%二氧化碳,培养基是改变每3天。通道3 - 6是用于实验。共有15名志愿者,年龄在18岁到23岁,提供明智的书面同意。PDLSCs被确定通过流式细胞术使用抗体STRO-1, CD90、CD45、CD146。描述的细节补充材料和方法(可用在这里)。

2.2。MTS试验

细胞生存能力是衡量使用MTS试验(WI Promega,麦迪逊,美国)。PDLSCs被播种在96 -孔板的密度3×10³细胞/好,培养大约80%融合。肿瘤坏死因子-α(20 ng / ml, 100 ng / ml)和AZM (1μ10 g / ml,μ克/毫升,20μg / ml)补充道。在成骨细胞培养介质为48小时37°C和培养3 h与MTS。OD_490年使用标仪测量。有7个复制实验,至少重复3次。

2.3。茜素红染色法和定量分析钙

PDLSCs固定在70%乙醇1 h,用去离子水清洗。我们添加了40毫米茜素红染色溶液pH值(4.2)到6-well盘子,孵化的细胞在室温下10分钟,洗细胞与去离子水5倍,认为他们在显微镜下,捕获的图像。定量分析钙,细胞治疗10%氯化十六烷吡啶溶液在室温下(Sigma-Aldrich) 30分钟。的OD_562年被用来量化的矿化程度和钙对茜素红染色定量分析规范化之前总蛋白质含量的计算。实验至少重复3次。

2.4。碱性磷酸酶染色

PDLSCs被播种在6-well盘子。除了控制条件,有三个实验条件:100 ng / ml TNF -α100 ng / ml TNF -α+ 10μg / ml AZM, 100 ng / ml TNF -α+ 20μ克/毫升AZM。我们在7天检查骨生成,获得图像。碱性磷酸酶(ALP)活性测定是描述的补充材料和方法。

2.5。定量实时聚合酶链反应

总RNA隔绝PDLSCs使用试剂盒试剂(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)。我们使用益生元(dT)引物和逆转录酶放大cDNA根据制造商的协议(表达载体)。RT-qPCR都使用了SYBR绿色PCR试剂盒(试剂盒,杜塞尔多夫,德国)。每个反应至少重复三次。补充表1显示了特定基因的引物。

2.6。免疫印迹分析

从PDLSCs总蛋白提取赖氨酸的细胞里帕缓冲区(10毫米Tris-HCl, 1毫米EDTA, 1%十二烷基硫酸钠(SDS), 1% NP-40, 1: 100蛋白酶抑制剂的鸡尾酒,50毫米β氟化钠甘油磷酸盐和50毫米)和PMSF 1%。蛋白质分离在10%和12% SDS聚丙烯酰胺凝胶,然后electrotransferred聚偏二氟乙烯(PVDF)膜2 h 300 mA。一夜之间,膜被孵化的主要抗体在4°C。主要单克隆抗体针对以下被用于这项研究:磷酸化p65 p65,磷酸化κB -α,我κB -α管家蛋白磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH Abcam,剑桥,妈,美国),caspase-3, caspase-8(细胞信号技术Inc .)的屁股然后孵化与二级抗体(peroxidase-conjugated山羊anti-rabbit;1:1000年,Abcam)在室温下2 h。GAPDH是用作内部控制。每个实验有三个复制,至少重复三次。

2.7。细胞凋亡检测

细胞被播种密度的2×10³/厘米²。治疗后100 ng / ml TNF -α或10μg / ml AZM + 20μg / ml AZM 24 h, PDLSCs沾膜联蛋白V-fluorescein异硫氰酸酯(FITC)和复染色propidium碘(π)。生活的eBioscience™膜联蛋白V-FITC凋亡检测设备(技术)是使用。简单,细胞被洗两次磷酸盐(PBS),然后沾着200人μl绑定缓冲(1 x)和5μl膜联蛋白V-FITC 10分钟在黑暗中在室温下。最后,10μπ的l 1 x绑定缓冲被加入到细胞5分钟。使用荧光显微镜的细胞进行了分析。

2.8。膜联蛋白V细胞凋亡检测

我们洗1×10⁵细胞与PBS随后离心两次在4°C 2000 rpm 5分钟收集细胞球。细胞球团矿在200年resuspendedμl绑定缓冲(1 x)和彩色5μl的膜联蛋白V-FITC在黑暗中在室温下10分钟,然后10μlπ在1 x绑定缓冲被加入到细胞悬液。细胞分析fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)。每个实验进行了一式三份。

2.9。统计分析

数据报告为±SD方法。我们用单向方差分析的统计分析,值< 0.05被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。肿瘤坏死因子-α和AZM实验水平没有毒性PDLSC可行性或扩散

PDLSCs细长轴形态(图S1)。生物标记流式细胞术结果如图所示S2。调查是否不同浓度TNF -αAZM影响细胞增殖和生存能力,我们使用MTS试验比较的可行性PDLSCs培养成骨的条件与PDLSCs对待TNF -α和AZM(图S3)。肿瘤坏死因子-α使用两个浓度(20 ng / ml, 100 ng / ml),在三个浓度(AZM 1μ10 g / ml,μ克/毫升,20μg / ml)。肿瘤坏死因子-α治疗仅倾向于减少可行的细胞的数量,虽然这并没有显著下降。基于这些结果,我们选择使用20 ng / ml, 100 ng / ml TNF -α和10μ克/毫升,20μg / ml AZM作为后续实验的工作浓度。

3.2。PDLSCs AZM对成骨分化的影响

调查的影响AZM PDLSCs的成骨分化,细胞培养的成骨的介质为7天。实验PDLSCs治疗与肿瘤坏死因子-α(100 ng / ml)和AZM (10μ20 g / ml,μg / ml)。高山染色结果(图1(图)和茜素红染色结果2)表明,AZM可以恢复的能力PDLSCs后进行成骨分化细胞肿瘤坏死因子-受损α(100 ng / ml)。控制细胞进行成骨诱导相比,肿瘤坏死因子-α治疗减少染色和钙结节形成(图2)。值得注意的是,肿瘤坏死因子-α促炎细胞因子,在许多不同的疾病导致骨质流失。直到现在,TNF -机制α抑制成骨分化已经不清楚,认为是复杂的。按照以前的结果,TNF -α降低成骨分化,我们的数据表明,减少钙结节的数量形成(图2 (e))。Cotreatment PDLSCs与TNF -α(100 ng / ml)和AZM (20μg / ml)救了细胞进行成骨的能力与TNF -α组,尽管骨低于控制细胞。AZM浓度越高,越深的蓝色或红色染色。这表明AZM人类PDLSC成骨分化有积极作用,因为细胞培养时接受了骨缺失或TNF -的存在α和AZM 0 3或7天。

类似于高山染色和茜素红染色结果,分析引起的高山活动证明AZM PDLSCs重获成骨的能力(图1 (g))。值得注意的是,细胞治疗与肿瘤坏死因子-α独自一人显然有更少的细胞(数字1 (b)和2 (b))。随着AZM浓度的增加,细胞的数量增加。

我们推测AZM可以促进骨生成,可以部分恢复PDLSC成骨的炎症微环境的能力。要验证这一点,我们评估的mRNA表达成骨分化标记OCN,BSP,RUNX2通过实时PCR(图3)。我们发现AZM治疗促进PDLSCs成骨分化,这些基因的mRNA表达方式存在剂量依赖的相关性(图3(一个)- - - - - -3 (f))。当细胞受到炎症微环境(即。,对待TNF -α)的mRNA水平OCN,BSP,RUNX2在控制(低于 )。然而,cotreatment AZM恢复mRNA表达水平(图3(一个)- - - - - -3 (f))。信使rna表达水平KDM2A,KDM2B,EZH2更高的TNF -α治疗细胞相比,控制细胞,AZM减轻这种影响(图3 (g)- - - - - -3(我))。

3.3。AZM获救的成骨潜能PDLSCs通过WNT和NF -κB信号通路

在炎症环境中,NF -κB PDLSCs成骨分化的过程中起到了至关重要的作用[33]。我们下一个被问及TNF -α全身的成骨的抑制可以部分逆转的存在通过抑制NF - AZMκB信号。因此,我们用免疫印迹分析p65的表达,磷酸化p65,我κB -α,磷酸化κB -α(图4)。经过7天的成骨分化,肿瘤坏死因子-α促进磷酸化p65和磷酸化的表达κB -α在PDLSCs与控制。然而,当PDLSCs服用100 ng / ml TNF -α和20μg / ml AZM,磷酸化p65和磷酸化的水平κB -α低于在细胞治疗肿瘤坏死因子-α一个人。我们还发现p65和我的水平κBα。如图的蛋白质水平4。

与高山和茜素染色结果一致,TNF -α抑制PDLSC成骨分化,而AZM部分逆转这种效应,促进了PDLSC成骨分化。磷酸化p65反映了NF -的激活κB信号通路。因此,结果表明,通过抑制NF - AZM促进成骨分化κB信号通路。然后,我们调查是否WNT信号在这一过程中发挥作用。我们发现β连环蛋白表达与肿瘤坏死因子-细胞治疗后增加α。这些结果表明AZM提升PDLSCs成骨分化的炎症微环境通过抑制WNT和NF -的激活κB信号通路。

3.4。抑制肿瘤坏死因子- AZM促进PDLSC成骨分化α全身的细胞凋亡

肿瘤坏死因子-α是一个强apoptosis-promoting因素。有一些迹象表明,可能抑制TNF - AZMα全身的细胞凋亡PDLSCs,因为高山染色显示肿瘤坏死因子-α单独治疗可行的细胞的数量减少,与TNF - cotreatmentα加上AZM减轻这种影响(数据1和2)。调查机制这一现象,我们测试了是否AZM获救PDLSC骨通过抑制肿瘤坏死因子-α全身的细胞凋亡。PDLSCs被播种密度的2×10³/厘米²在6-well板块有或没有TNF -α(100 ng / ml)和AZM (10μ20 g / ml,μg / ml)为24小时。值得注意的是,100 ng / ml TNF -α促进PDLSCs凋亡和AZM减轻这一过程。此外,AZM没有促进PDLSCs细胞凋亡。PI染色和FITC染色按照PDLSCs经历成骨分化细胞凋亡,表明10μ20 g / ml或μg / ml AZM没有影响细胞凋亡(图5(一个))。

半胱天冬酶的活化过程中,半胱天冬酶prodomain和半胱天冬酶蛋白裂解形成heterotetrameric响应蛋白水解酶激活。接下来,蛋白的下游半胱天冬酶被激活,导致细胞凋亡(34,35]。Caspase-8发起者半胱天冬酶,caspase-3效应半胱天冬酶。进一步调查机制AZM的影响,我们确定caspase-3的蛋白质含量,caspase-8, caspase-3裂解,裂解caspase-8。结果表明PDLSCs后接受了7天,成骨分化caspase-8的蛋白质含量和裂解半胱天冬酶在细胞治疗肿瘤坏死因子- 3高α单独和低AZM添加时(数据5 (b)和5 (c))。PDLSCs处理10μ20 g / ml或μg / ml AZM(图5 (d))没有显示出蛋白质含量的差异caspase-3 caspase-8。

而在细胞水平处理10μg / ml AZM,裂解的水平caspase-3和裂解caspase-8更高在细胞治疗20μ克/毫升AZM。可能AZM促进PDLSC分化。一个更有利的细胞可以增加细胞增殖状态,尽管MTS结果显示细胞的增殖没有明显的统计学差异处理AZM(图S3)。与细胞治疗10μ20 g / ml AZM,细胞治疗μg / ml AZM显示略有增加细胞数量。细胞的凋亡水平对AZM低于细胞治疗肿瘤坏死因子-α和控制细胞(数字5 (b)和5 (d))。AZM抑制细胞凋亡在剂量依赖性的方式(数字5 (b)和5 (d))。确认如果AZM促进人类PDLSC成骨分化的抑制肿瘤坏死因子-α全身的细胞凋亡,PDLSCs在基础培养基培养,然后培养有或没有TNF -α(100 ng / ml)和AZM (10μ20 g / ml,μg / ml)为24小时。膜联蛋白V-positive细胞被发现通过流式细胞术分析。中等水平的TNF -α在PDLSCs能促进细胞凋亡,但AZM减轻这种影响。相比之下,PDLSCs TNF -对待α单(图6),细胞凋亡水平减少AZM的存在。我们的数据表明AZM可以阻断TNF -α全身的细胞凋亡。

综上所述,这些数据表明AZM促进成骨分化PDLSCs通过抑制肿瘤坏死因子-α全身的细胞凋亡。

4所示。讨论

牙周炎是一个复杂渐进的炎性疾病,在成人也更为普遍发生在儿童和青少年。值得注意的是,牙周炎会导致牙槽骨丢失和系统性炎症。失调的牙菌斑,与宿主的免疫防御,提升者牙周炎。因为底层机制是复杂的,它是具有挑战性的修复骨质流失,提高深牙周袋达到一个令人满意的结果(9]。Bartold等人表明,牙菌斑是必要的但对牙周炎不足(4,5,36,37]。AZM消炎物质,据报道了几组(38,39]。在这里,我们发现AZM可以逆转骨质流失,抑制PDLSC细胞凋亡。PDLSCs可以分化成成骨细胞治疗牙周炎患者方面显示了很大的潜力。

肿瘤坏死因子-α是一个强有力的凋亡诱导物和促炎细胞因子,导致骨质流失在地方和系统性炎症骨骼疾病(40]。肿瘤坏死因子-α抑制osteogenic-related基因的表达Runx2在两个方面。首先,它抑制Runx2基因的表达。其次,它促进了Runx2退化(41]。我们的数据提供了证据表明AZM炎症微环境促进PDLSCs成骨分化。

本研究有四个主要的发现。首先,PDLSCs骨被明显抑制TNF -α并通过AZM明显增强。第二,免疫印迹分析表明TNF -α磷酸化p65的表达增加,磷酸化κB -α,β连环蛋白。相比之下,这些蛋白质的水平被AZM抑制浓度的方式。第三,与TNF -刺激α激活了裂解caspase-3蛋白质和TNF - AZM逆转αPDLSCs全身的细胞凋亡。第四,流式细胞仪分析表明,中等浓度的TNF -α提升PDLSC凋亡,AZM减轻这一过程。我们发现AZM可以抑制细胞凋亡的PDLSCs符合Mizunoe等的工作。42)和Stamatiou et al。43]。

我们的数据阐明AZM促进骨生成的机制。当三聚物的肿瘤坏死因子-α结合TNFR1, TNFR1-associated死域蛋白质(TRADD)招募TNFR1。TRADD然后充当桥招募其他apoptosis-related蛋白质,如receptor-interacting蛋白质(RIP)、肿瘤坏死因子receptor-associated因子2 (TRAF2)和Fas-associated死域蛋白质(FADD)。接下来,TRAF2的集成和撕裂导致IKK复杂的招聘。有趣的是,phosphorylated-IκBα然后退化,这激活了NF -κB信号通路,介导细胞凋亡。肿瘤坏死因子-α会引发细胞凋亡以另一种方式,也就是说,通过半胱天冬酶通路。这个途径包括FADD、caspase-8 caspase-3。Caspase-3激活允许其分裂相关蛋白和导致细胞死亡34]。骨质疏松引起的肿瘤坏死因子- AZM块α在两个方面。首先,它会抑制NF -的激活κB信号,第二,它能抑制半胱天冬酶家族的乳沟蛋白质。

越来越多的证据表明,WNT通路在骨代谢中发挥着重要作用。WNT信号途径有两种:规范化通路,称为WNT /β连环蛋白通路,经典之中WNT / Ca^{2 +}途径。的激活状态β连环蛋白在WNT /至关重要β连环蛋白通路。当WNT蛋白质绑定到卷曲的受体,β连环蛋白被激活,在细胞质中积累。稳定的β连环蛋白转入细胞核和介导下游基因的转录([44),黄,45- - - - - -47])。值得注意的是,高表达β连环蛋白mRNA的表达下降Runx2,COL1,OCN在PDLSCs从炎症微环境中提取。一些研究人员声称高β连环蛋白表达减少骨通过不在经典里的通路,而另一些人则认为这发生通过规范化路径(47,48]。因为我们检查的蛋白表达β连环蛋白,我们不知道需要哪些途径AZM抑制和额外的实验来确定精确的机制。

表观遗传调控基因表达的遗传和可逆的。表观遗传学的DNA序列没有改变;相反,有甲基化组蛋白赖氨酸或精氨酸残基的尾巴。甲基化赖氨酸残基被认为是表观遗传信号可能与基因激活,在H3K4甲基化和H3K36或基因镇压,至于在H3K9甲基化和H3K27 [49,50]。组蛋白赖氨酸demethylases(主要决策者)KDM2A KDM2B H3K4me3脱甲基和H3K36me1/2 [50]。KDM2B扮演着一个重要的角色在BCOR mutation-associated疾病(51]。此外,KDM2A之间的交互和BCOR可以抑制骨通过抑制epiregulin (EREG)基因转录,这是所需的表达osterix (OSX)和distal-less同源框5 (DLX5) [52]。我们的结果与这些报告一致。

KDM2B是一个组件的经典之中PRC1 (polycomb专制复杂1),这新兵Ring1B Nspc1促进H2AK119 monoubiquitylation [53]。招募Ring1B可能与RNA聚合酶II (RNAPII),导致二价状态(54]。KDM2B本地化H3K36me2水平较低的地区。肿瘤坏死因子-α刺激促进的二甲基标记H3K36和抑制osteogenic-related基因转录。成员EZH2 PRC2 (polycomb专制复杂2),是一种组蛋白赖氨酸甲基转移酶(国民党)。EZH2主要催化H3K27三甲基标记。规范化PRC1复杂被PRC2招募到合适的位置,它可以识别H3K27me3 [55]。EZH2已经知道了几十年的负面中介MSC骨,这是符合我们的发现。AZM可以通过三种方式促进骨生成。首先,它可以阻止PRC1绑定到H2AK119ub启动子,然后减少H2AK119ub水平。第二,它可以增加H3K36me2然后促进基因转录水平。第三,它可以减少H3K27me3水平和减少PRC2的招聘,可以抑制转录抑制,促进下游基因的表达。

牙周疾病导致复杂的炎症微环境的形成。这项研究表明AZM有潜力作为一种新的药物治疗牙周疾病。虽然AZM不能完全逆转骨质疏松,它可能是有用的一些见解,假定的AZM对牙周疾病的影响。可能会有额外的机制,我们没有探索。肿瘤坏死因子-α全身炎症微环境,我们发现osteoblast-specific基因的表达和细胞凋亡在体外,我们得出的结论是,AZM促进成骨分化的PDLSCs炎性微环境通过抑制WNT和NF -κB信号通路和抑制肿瘤坏死因子-关联的过程α全身的细胞凋亡。这项研究有一些局限性。特别是,这是一个在体外研究;动物研究没有进行。需要进一步的实验关注组织再生人类更好的建模环境。

总之,我们的研究表明,AZM有潜力作为一种新的药物治疗牙周炎疾病和提供了一些见解AZM和表观遗传学。还需要进一步的实验来调查AZM作为牙周炎的治疗药物和骨组织的再生。

5。结论

我们的研究结果表明,AZM促进PDLSCs成骨分化,以应对TNF -α刺激通过抑制WNT和NF -κB信号通路和衰减TNF -α全身的细胞凋亡。

缩写

BSP:	骨涎蛋白
EZH2:	增强剂的zeste同族体2
的边后卫:	胎牛血清
FITC:	异硫氰酸荧光素
KDM2A:	Lysine-specific demethylase 2
KDM2B:	Lysine-specific demethylase 2 b
OCN:	骨钙素
PI:	Propidium碘化
Runx2:	Runt-related转录因子2。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Xiaomeng婷婷孟,应周Jingkun Li Li和Pingting王岐山进行数据的收集和/或装配;婷婷孟和梅林胡写的手稿;贾,李Liyu Dayong刘执行数据分析和解释;智佳,Liyu李和刘Dayong提供金融支持;Dayong刘执行的概念和设计和最终批准的手稿。婷婷孟和周应同样这项工作作为第一作者。Dayong刘贡献如铅接触。

确认

作者感谢吴教授Xudong天津医科大学的专家帮助数据解释和讨论部分的手稿。这项工作是支持由中国国家自然科学基金委Dayong刘(81371109和81371109),由格兰特从北京牙齿再生和功能重建的重点实验室开放项目(2014 qyzs02 Dayong Liu),由天津市自然科学基金的资助(15 jcybjc50200智佳),和天津医科大学的科学基金会(2015 kyzm11 Pingting Wang)。

补充材料

实验部分的碱性磷酸酶(ALP)活性测定和流量仪分析的补充材料,和为特定的基因引物序列和补充数据也包括在内。补充表1:基因序列的引物。图S1 PDLSCs 10倍显微镜下的图像。PDLSCs细长纺锤体形态。图S2: PDLSCs在正常培养基培养。流动仪分析PDLSCs显示阳性表达的细胞标记STRO-1 CD90、CD146 CD45和消极的结果。图S3:适当的TNF -α和阿奇霉素对细胞生存能力没有明显的毒性作用和PDLSCs扩散。细胞生存能力是衡量使用MTS试验;有12组之间无显著差异。(补充材料)

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