文摘

与他们的自我更新和分化的性质,胚胎干细胞(ES)细胞再生疗法的良好的承诺。然而,畸胎瘤形成和胚胎干细胞的伦理问题可能限制其潜在的临床应用。目前,孤雌生殖的胚胎干细胞(pES)细胞吸引了研究人员的兴趣为其自我更新和多潜能分化而引发伦理问题。在这项研究中,我们建立了一个模型与ES和pES细胞稳定转染的double fusion包含renilla荧光素酶报告基因(Rluc)和红色荧光蛋白(RFP)分析畸胎瘤形成的机制。转基因Vegfr2-luc鼠标,它表达了萤火虫荧光素酶(美国人)启动子的血管内皮生长因子受体2 (Vegfr2-luc),被用来跟踪新血管的生长被移植的细胞。生物荧光成像(BLI) Rluc /美国人提供了一个有效的工具在估算畸胎瘤的生长和血管生成体内。我们发现胚胎干细胞的肿瘤发生和血管生成能力高于栓塞形成后症状(pES)的细胞中VEGF / VEGFR2信号通路起着重要的作用。总之,pES细胞的减少潜在的畸胎瘤的形成,但与此同时也有类似的区分能力与胚胎干细胞相比。这些数据表明,pES细胞提供一个替代胚胎干细胞来源的风险减少畸胎瘤形成和没有道德争议。

1。介绍

胚胎干细胞是唯一的在所有干细胞种群由于其高多能性和分化能力,这使他们的一个最有前途的细胞再生医学(1,2]。目前,成功的胚胎干细胞分化方法已经发展成多种组织类型,包括膀胱(3),胰腺(4),肝脏(5),和女性生殖6]。然而,细胞移植后形成畸胎瘤的可能性已经限制他们的应用程序在临床(7]。更重要的是,伦理问题限制了隔离和人类ES细胞在临床中的应用翻译。最近,孤雌生殖的胚胎干细胞(pES)细胞吸引了研究人员的兴趣为他们多能分化没有伦理问题(8]。这些细胞可以从胚胎造成人工激活卵母细胞的受精(9,10]。pES细胞系类似于胚胎干细胞的增殖,多能性标记物的表达,能力分化成几种细胞系包括tenocyte-like细胞(11),成骨细胞(12),和神经细胞12]。

尽管pES细胞的生物学特性良好的文档记录,可用分析pES细胞的生物学行为和畸胎瘤形成机制是有限的。因此,详细观察和功能分析pES间细胞和胚胎干细胞将洞察畸胎瘤的形成来自不同来源的细胞。到目前为止,尽管一些企图阻止畸胎瘤的形成,包括引入自杀基因(13),抑制细胞循环调节蛋白(14],immunodepletion [15),选择所需的细胞类型(16),或引入细胞毒素抗体(17),一个临床可行的策略来消除畸胎瘤的形成需要开发(18]。在以前的研究中,建立之后在活的有机体内畸胎瘤的典型行为是重构微环境尤其是血管的形成营养来支持他们的增长(19),血管生成起着至关重要的作用。因此,监测畸胎瘤血管生成的过程可能为抑制畸胎瘤的形成提供新方法和直接未来临床转化应用栓塞形成后症状(pES)的细胞。

在这项研究中,我们建立了一个畸胎瘤模型监控pES的行为和转基因小鼠胚胎干细胞的分子成像。慢病毒载体携带EF1α启动子,驱动器double fusion构造包含renilla荧光素酶(Rluc)和红色荧光蛋白(RFP)报告基因,用于实现本地化移植细胞(20.,21]。分子成像提供了视觉上的可能性监测移植后的细胞过程,包括细胞增殖和血管生成。此外,转基因Vegfr2-luc老鼠表达启动子下的美国人Vegfr2-luc使我们能够捕捉和量化畸胎瘤血管生成体内。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

从受精胚胎小鼠ES细胞系获得了pES细胞系隔绝时激活卵母细胞(22]。这两个细胞系是维护DMEM (Gibco,宏伟的岛,纽约)在小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)给料机层,初步处理10μES-qualified g / ml丝裂霉素c中包含15%胎牛血清(的边后卫;澳大利亚HyClone), 0.1毫米β巯基乙醇,1%不重要的氨基酸(NEAA;Gibco), 1%青霉素和链霉素(Gibco),和1000单位/毫升白血病抑制因子(生活;微孔)。检测移植细胞的跟踪在活的有机体内pES细胞和胚胎干细胞与慢病毒载体转导,带有一个EF1α启动子、驾驶renilla荧光素酶(Rluc)和红色荧光蛋白(RFP) double fusion报告基因(RR),分别被命名为pES-RR和ES-RR。每组的明亮的显微照片被送往观察细胞的形态。培养基是每日更换,pES-RR或ES-RR通过每隔两天。

2.2。记者Gene-Labeled细胞的特征

在记者gene-labeled RFP的表达与倒置荧光显微镜观察细胞;同时,Rluc在这些细胞的活动是通过生物荧光成像(BLI)来衡量的。BLI都使用新腔II系统(公司,创建Xenogen数据MA)作为描述(23]。在连续的非侵入性成像,pES-RR或ES-RR在24-well培养板然后暴露于1μ克/毫升coelenterazine (NanoLight、技术、Pinetop AZ)。成像是立即进行冷却的电荷耦合器件(CCD)生物荧光相机为3分钟。随后,生物发光是量化单位的最大光子每秒每平方厘米每球面度(p / s /厘米²/ sr)。信号强度之间的线性关系和细胞数量进行了分析使用Graphpad Prism 6.0软件(Graphpad软件公司,圣地亚哥,CA)。

2.3。细胞增殖实验

细胞增殖测定用台盼蓝(Gibco)排除化验一式三份,和人口倍增。pES细胞、胚胎干细胞和记者gene-labeled细胞被播种在24-well板2×10的密度⁴每口井。每口井的五个字段选择随机,仔细标记。细胞选择字段数在24日,48和72小时时间点。

2.4。碱性磷酸酶染色

确定转导细胞的未分化状态,碱性磷酸酶(ALP)活性测定使用碱性磷酸酶工具包(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)。ES细胞,pES细胞,记者gene-labeled细胞首次在10%福尔马林固定,然后用去离子水细胞被洗了30年代和孵化与茜素红预混合的解决方案在一个黑暗的环境中在室温下15分钟。简单冲洗后,样本复染色30年代,然后洗了三次,除去游离的染料。干燥后,使用光学显微镜观察染色细胞(24]。

2.5。胚状体体形成

检测分化能力pES-RR ES-RR,细胞使胰蛋白酶化进行单细胞悬液,取得了1×10的密度⁵每毫升LIF-deficient ES细胞中。然后,20μl细胞悬液被播种在裸露的培养皿中使用悬滴培养[25]。主要胚状体的身体(EB)成立后48小时,然后重新进入6-well plate-coated明胶之前2毫升ES细胞培养基培养,没有生活。EBs的每组收获后的6天12基因表达分析。

2.6。实时聚合酶链反应

从分析了28天畸胎瘤定量实时聚合酶链反应(qPCR)。从样本中提取总RNA与试剂盒试剂(表达载体,宏伟的岛,纽约)根据制造商提供的说明。然后,2μ克总RNA用于合成第一链cDNA模板,和上面的操作是一样的。后来,qPCR Opticon®系统上进行了一式三份(Bio-Rad大力神,CA)和血管内皮生长因子的相对基因表达水平(VEGFA), VEGFR2, CD34,而(Ang-1) angiopoietin-2 (Ang-2),并与immunoglobulin-like循环和表皮生长因子酪氨酸激酶同源域2 (Tie-2)量化使用TransStart顶级绿色qPCR SuperMix工具包(TransGen生物技术,中国)。相对信使rna折叠变化由2^−ΔΔCT方法。

2.7。畸胎瘤模型

南开大学批准的实验动物保健和使用委员会。所有协议进行严格按照实验动物保健和使用指南发布的美国国立卫生研究院(第八版,2011)。8-10-week-old雌性转基因小鼠(创建Xenogen Corp .)、Hopkinto, MA),表达萤火虫荧光素酶(美国人)启动子的小鼠血管内皮生长因子受体2 (vegfr2),被安置在标准实验室条件下(26]。老鼠注射3×10⁶pES-RR成正确的第四副乳腺脂肪垫,3×10⁶100年ES-RR成相反的网站μ磷酸盐的l(0)。畸胎瘤开发跟踪BLI Rluc,和肿瘤血管生成同时被BLI评估的美国人。所有小鼠安乐死和畸胎瘤是收获posttransplantation进一步分析4周(28天)。

2.8。半定量rt - pcr

互补DNA(互补)模板合成了2μg总RNA的隔绝EBs提前收集利用TIANScript RT工具包(TIANGEN生物技术,中国)和稀释至50μl。1μl的第一链cDNA混合添加到逆转录酶聚合酶链反应(rt - pcr)系统。外胚层、中胚层、内胚层的——和pluripotent-specific标记(巢蛋白、Brachyury Gata6, Oct4和Nanog)比较在所有组。

2.9。光学生物荧光成像

成像Rluc和美国人表达旨在监测畸胎瘤发展和肿瘤血管生成,分别。肿瘤BLI都使用新腔II系统(公司,创建Xenogen数据MA) (27]。简而言之,2.5毫克/公斤coelenterazine静脉注入转基因老鼠,和老鼠在1 - 2分钟,以评估Rluc立即表达。此外,同样的小鼠腹腔内注射的150毫克/公斤的记者调查D-Luciferin (Biosynth国际,内伯威尔市,IL),在1 - 10分钟来评估美国的表达式。所有的动物都扫描从第0天、28天。感兴趣的区域(ROI)是信号在两个乳房脂肪垫,和成像信号分析(如前所述28]。

2.10。组织学分析

孤立的畸胎瘤在4%多聚甲醛固定,脱水一夜之间在30%蔗糖。随后,这些样本嵌入最佳切削温度(10月)复合(日本樱花Finetek)或石蜡,分别。冷冻样品或石蜡标本均切成5μ米厚的部分下染色。免疫荧光染色,老鼠anti-mouse CD31抗体(BD,圣何塞,CA)和Alexa萤石488荧光二次抗体被用于确定血管生成在畸胎瘤。核与4,可视化6-diamidino-2-phenylindole (DAPI;南方生物技术、伯明翰、AL)和四个代表性领域测量来检测荧光显微镜下微血管密度(MVD)。此外,调查分化状态的畸胎瘤,连续五个部分每个石蜡样品与苏木精和伊红染色(他)。

2.11。统计分析

统计分析是通过使用Graphpad Prism 6.0软件(Graphpad软件Inc .)。双向重复测量方差分析和双尾学生的t以及使用。差异被认为是重要的值< 0.05。除非指定数据作为均值±SEM。

3所示。结果

3.1。栓塞形成后症状(pES)的标记细胞和胚胎干细胞与DF报告基因

监控畸胎瘤发展的动态过程,我们创建了两个细胞系,pES-RR ES-RR,贴上double fusion报告基因(数字1(一)和1 (b))。积极RFP细胞筛选Bsd(杀稻瘟菌素)和免疫荧光分析显示RFP的强劲表现。很强的相关性之间Rluc活动和细胞数量观察pES-RR和ES-RR使用新创建Xenogen系统(图1 (c)),这证明了可能性评估细胞的数量在体外和畸胎瘤增长在活的有机体内通过分析Rluc信号强度。细胞的标记pES-RR和ES-RR相关线性Rluc活动(R²= 0.99)。

3.2。pES-RR和ES-RR的特征

建立这两个细胞系后,我们检查的扩散能力ES-RR(图2(一个))和pES-RR(图2 (b))在标准ES细胞培养条件。之间没有显著差异pES细胞,胚胎干细胞,其野生型在活细胞图像和集落形成。这些结果证明,报告基因的转染不影响pES细胞和胚胎干细胞的增殖能力。同时,根据高山对转染细胞染色(图2 (c)),没有显著差异与野生型相比,转染细胞的多潜能细胞。这些数据表明,报告基因的转染并没有改变pES细胞和胚胎干细胞的特点,这就意味着我们可以监测移植细胞的行为与报告基因的表达。

3.3。可视化的畸胎瘤增长和VEGFR2表达式的动态过程在活的有机体内

胚胎干细胞的潜在临床应用的限制主要归因于畸胎瘤的形成。因此,深入研究畸胎瘤细胞注射后的行为是必要的和分子成像技术被用来监控这个过程。移植后4周内,我们执行BLI Rluc的选择时间点与生活成像和分析软件。结果表明,pES-RR ES-RR相似。他们两人可以形成肿瘤在活的有机体内在移植后第14天(图3(一个)),肿瘤的生长速率是随着时间的增加。然而,肿瘤形成的pES-RR明显小于ES-RR。这种差异是不断地观察整个实验周期28天。同时,肿瘤的形成与发展需要招聘新的血管,起着重要的作用在肿瘤微环境的形成来支持增长。ES-RR和pES-RR被移植到VEGFR2-luc转基因小鼠。VEGFR2诱导的血管生成的表达可以作为一个指标对血管形成BLI实时监控。增加BLI信号ES-RR组中被发现,这表明VEGF / VEGFR2通路被激活而ES细胞为宿主的增强能力招聘血管(图3 (b))。

3.4。组织学分析

分子成像显示,畸胎瘤形成的pES细胞显著弱于胚胎干细胞;我们推测这种差异的两个主要原因,血管生成和multipotential分化。确定程度的血管生成细胞移植后,部分沾anti-CD31抗体。的表达CD31可能反映了畸胎瘤的血管生成。结果表明,pES-RR集团的新血管的密度明显低于ES-RR集团(数据4(一)和4 (b))。

这个区别pES-RR ES-RR提醒我们洞察血管形成的机制;我们进行了一项比较这两组的基因表达。我们发现angiogenesis-related基因包括CD34的表达,VEGFA, VEGFR2, Ang-1, Ang-2及其受体(Tie-2)实时PCR。结果表明,CD34、VEGF的表达/ VEGFR2 pES-RR显著低于ES-RR ( 和 )。与此同时,没有显著差异的表达Ang-1, Ang-2, Tie-2 pES-RR组和ES-RR组之间(图4 (c))。这些结果表明,pES-RR弱比ES-RR proangiogenic效应,和VEGF / VEGFR2信号通路起着至关重要的作用。

3.5。分化的潜力pES-RR ES-RR

确认畸胎瘤形成血管生成的作用之后,我们想要测试pES的分化潜能的细胞,以确保他们保持一个广泛的分化能力在体外。ES和pES细胞分化是由EB的形成。EBs收集在分化培养基培养48小时后然后自发分化。三个胚芽层包括gata6的标记,短轴,巢蛋白,具备干细胞标记Oct4 6天,一天12检测ES-RR组和pES-RR组(图5(一个))。结果表明,没有明显的变化pES-RR和ES-RR之间的分化潜能在体外。

进一步研究ES之间的多向分化的潜力和pES细胞,染色是申请检测的三个畸胎瘤胚芽层组织的分化。通过染色结果,我们可以发现三个畸胎瘤胚芽层组织的标记由pES-RR和ES-RR:外胚层(神经组织),中胚层(血管系统)和内胚层(腺组织(图)5 (b))。基因表达显示没有明显的区别这两种细胞分化的能力在体外和在活的有机体内。

4所示。讨论

最近,干细胞再生医学的迅速发展是一个有前途的工具维修和更换损坏的细胞,组织和器官。在这项研究中,两种类型的干细胞,pES细胞和胚胎干细胞,从混合获得小鼠进行比较的teratoma-forming潜力。与转基因vegfr2-luc老鼠(29日),我们观察到移植干细胞的行为以及血管生成过程动态活体动物(21]。结果表明,pES能够分化成三个胚芽层表明没有显著差异在pES细胞和胚胎干细胞分化潜能。VEGF / VEGFR2 pathway-related血管生成过程是平行的畸胎瘤增长证明血管生成反映畸胎瘤的生长和作为一个重要的诊断和治疗的目标。

领域的干细胞疗法,三种类型的细胞,胚胎干细胞、成体干细胞,诱导多能干细胞(iPS细胞),主要是关注。胚胎干细胞拥有巨大的潜力在干细胞再生医学经历无限的自我更新和分化能力。与msc来源于中胚层的相比,胚胎干细胞可以分化成每一个细胞类型(30.),而“诱导多能性”细胞的免疫原性和安全性产生遗传方法被认为是再生医学的主要障碍。胚胎干细胞能够分化成特定的目标组织可以消除一些未经治疗的疾病。例如,人类ES细胞来源少突细胞祖细胞被用于治疗损耗少突细胞的祖细胞和髓鞘脱失辐射(31日]。

然而,许多问题阻碍ES细胞替代疗法的进展,特别是道德问题,所无法解决的研究或立法。因此,一些其他细胞资源正试图取代胚胎干细胞作为细胞组织再生的代理。作为一个有前途的替代方法,pES细胞进一步调查。他们的分化能力被认为是与胚胎干细胞相似,而这些细胞中存在的道德问题不是。最近的研究表明pES的治疗效应细胞缺血性心脏病、神经退行性疾病,肌腱损伤表明pES的积极作用细胞(11,22,32]。尽管一些研究人员发现,pES细胞可以形成畸胎瘤细胞移植后,其发生和规模更小比胚胎干细胞(22]。因此,消除畸胎瘤形成风险将大大促进干细胞的发展使用pES细胞替代疗法。

总之,畸胎瘤模型在我们目前的研究中使用转基因小鼠VEGFR2启动子特征ES细胞和pES细胞移植后的行为。BLI透露这些标记细胞移植后的存活和血管生成过程。总的来说,血管生成是平行的畸胎瘤增长开始,发展,和回归,它提供了直接证据畸胎瘤形成血管生成的作用。我们的研究证实了这种效应,进一步表明,VEGF / VEGFR2信号通路在畸胎瘤的形成与血管生成密切相关。我们相信,一个广泛的了解畸胎瘤的形成机制和血管生成刺激pES细胞可以帮助改善干细胞治疗的安全性和有效性。

5。结论

移植小鼠pES cell-formed畸胎瘤明显小于由胚胎干细胞。这些数据表明,VEGF / VEGFR2信号通路的抑制可能减少残余细胞形成畸胎瘤的ES的概率和pES细胞。因此,我们认为pES细胞可能为临床转化应用程序提供更安全的来源。然而,详细说明ES的畸胎瘤的形成机制和pES细胞的血管生成刺激等待进一步调查。

的利益冲突

本文作者确认内容没有利益冲突。

作者的贡献

支道和Xiaoniao陈同样对本文亦有贡献。

确认

这项研究部分由中国国家重点研发项目(2017 yfa0103200)和中国国家自然科学基金(81671734,81671734)。