文摘

背景。癌症干细胞(CSC)促进血管生成在肿瘤发生中起着重要的作用,经济增长,和转移。准确、量化肿瘤脉管系统可以帮助理解CSC特点和改善癌症诊断、治疗计划和评估。本研究的目的是提出一个方法来提高血管生成评估。方法。我们提出了一个三维的微脉管密度(3 d MVD)评估肿瘤血管生成和测试它在动物模型。6雄性Balb / c裸小鼠分为正常组和肿瘤组。老鼠肿瘤组orthotopically植入人类胃癌细胞株bgc - 823。相衬显微镜的图像收集上海同步辐射装置BL13W beamline,有软组织对比度和空间分辨率远高于传统的x射线。体积重建和血管提取后,建立了血管生成的3 d模型计算MVD。结果。结果表明,提出的3 d MVD与微血管的病变呈正相关。用高分辨率的优势的相衬成像和三维信息添加到现有的MVD措施。结论。我们的研究提供了一个可行的方法更好的理解肿瘤血管生成。它可能提供医生和科学家更好的癌症调查和改善医疗结果的工具。

1。背景

胃癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。一半的病例发生在亚洲东部,尤其是在中国。直到现在,全球胃癌的死亡率仍很高(癌症死亡总数的8.8%)1),5年生存率只有29%左右(2]。早期诊断和有效的干预是至关重要的因素来改善医疗结果(3]。

在最近的研究中,癌症干细胞(CSC)在胃癌中被确定。相信CSC与滋养肿瘤生长和血管新生药物抗性成为主要因素,肿瘤复发和转移4,5]。定量测量的血管生成可以提供洞察CSC的特点以及在癌症诊断中发挥关键性的作用,治疗计划和评估。然而,如何准确地量化肿瘤脉管系统仍然是一个具有挑战性的任务。

相位对比计算机断层扫描(PC-CT)可以产生三维(3 d)与高对比度和分辨率微血管信息。它检测到的折射信息时x射线穿过不同的材料。的信息远比传统attenuation-based成像并提供优越的软组织对比(6]。在过去的十年里,一些研究报道相衬成像的应用(PCI)微血管成像,如缺血性损伤后大脑微脉管系统的描述,从温和的一个分化的乳腺癌,血管显示肝纤维化的7- - - - - -9]。唐等人报告说,他们发现了一些微血管和胃粘膜癌溃疡明显使用PCI [10]。虽然微血管成像对某些癌,胃癌血管的空间形态没有详细调查。

另一方面,为定量评估肿瘤血管生成,微血管密度(MVD)被认为是一个有价值的参数。一系列的研究表明,MVD是肿瘤转移的一个强劲信号,因此预后[11- - - - - -13]。尽管如此,没有标准的方法来获得MVD。怀德等人乳腺癌的MVD提供免疫组织化学(包含IHC)测量血管的数量在热点地区(14]。其他研究人员评估MVD通过改变微观的放大或包含IHC抗体(CD34、CD105等。)15]。这些方法已经产生了不一致的结果,影响可靠性的MVD癌症预后的指标。MVDs只是从一个或几个选定的组织学切片。二维(2 d)数据可能不足以证明肿瘤脉管系统的完整结构。

本研究的目的是使用PCI给胃癌血管的完整视图,提出一种新的3 d MVD参数,可以证明微脉管分布更全面,因此提供了一种新方法评价胃癌治疗的成像方法。实验的细节和数据处理提出了以下部分。在结果中,我们评估的价值3 d MVD在评估胃癌血管生成,然后得出结论。

2。方法

2.1。动物模型制备

七个成年雄性Balb / c裸小鼠体重15 - 25 g被用于实验。六人随机分为正常组( )和肿瘤组( ),另一个是用于植入皮下肿瘤。在实验中,所有的老鼠都提高了SPF(特定病原体免费的)条件下,12 h-day和晚上周期,免费获取食物和水。所有实验和程序进行批准的动物是动物福利委员会首都医科大学。

肿瘤细胞悬液(1×107细胞/ 100μl)人类胃癌细胞株bgc - 823,是一个雄性裸鼠皮下注入(Balb / c)。肿瘤直径1 - 2厘米,之后我们切除,切成碎片(1毫米3下原位移植)。

三小鼠肿瘤组织,肿瘤片段为每个老鼠orthotopically植入到subserosa 8 - 0的胃手术缝合。然后,我们关上了腹壁和皮肤。大约一个星期后,产生的原位肿瘤直径增加到0.5厘米,可以感动肋下。老鼠在对照组没有收到任何操作。

众所周知,PC-CT可以提供更好的与软组织;然而,我们仍然应用造影剂进一步加强健壮的微血管MVD测量。在我们的实验中,硫酸钡暂停使用,因为它可以沉积在血管相对较长时间。在成像之前,所有的老鼠都由10%水合氯醛麻醉,0.4毫升/ 100 g, i.p。然后,我们打开他们的胸腔暴露心脏,使注射结束后的左心室21-gauge冲针,连接到一个输血设备与生理盐水,然后做了一个动物的右心房切口。大约5分钟后,肺和肝变白时,我们删除了输血设备更改为10毫升注射器和硫酸钡悬挂(20%v/v),进入微血管的细碎。最后,胃样本孤立和快速保存在福尔马林溶液。

为了验证成像结果的准确性,在成像实验中,样品被嵌入到石蜡,切成5μ米厚的部分,和苏木精和伊红染色())。

2.2。相位对比计算机断层扫描

相衬显微镜的图像收集上海同步辐射装置(SSRF) BL13W beamline。SSRF是世界上先进的第三代光源。BL13W的成像系统是相对简单的,低光学器件的要求。成像的原理如图设置1。同步加速器高能和准直梁来自存储环首先达到双晶单色仪。梁因此选择一个从8 keV 72.5 keV能量。然后单色光束通过成像的样品被放置在六自由度运动平台。样品可以在水平面旋转360°CT扫描。样品的光束进行信息传播为一个特定的旅行距离。在这个距离内,菲涅耳衍射发生,因此导致一种改进的图像对比在不同的组织。最后,光束接收和转换成可见光CCD探测器。在我们的实验中,成像参数如下:光束能量:17.5 keV和样品旋转程度:180°;样品旋转速度设置为0.4°/ s,所以总扫描时间大约是8分钟约有900的预测。 The exposure time of each projection was 6 ms. The distance between the sample and the CCD was 90 cm. The image pixel size was 9 μm。


图1
成像的原理图设置。
2.3。数据处理

胃是一种中空的消化器官,丰富的血管网络。这是一个具有挑战性的任务,科学家分析它们在二维投影图像,因为组织重叠,图像噪声,小血管的大小,病理异常。为了获得3 d微脉管信息,体积重建和必要的图像处理进行了研究。

2.3.1。特征提取

我们得到的图像直接从PC-CT投影图像。CT体积使用过滤反射影重建(FPB)方法(16]。随后,血管应该分段。然而,微血管,注入造影剂后,有不同的灰度值相比更大的船只。我们通过微脉管增强、阈值分割处理这个问题。

CT切片的微血管不同灰度的小点周围软组织区域。是不可能通过一个简单的阈值。因此,灰度重建算法用于微脉管增强[17]。一旦增强微血管,大津阈值方法应用于CT容积段血管(18]。三维可视化的船只,表面呈现基于游行立方体算法应用,使得复杂的微血管系统的清晰可见。

2.3.2。MVD计算

MVD已经作为一个参数量化船舶血管生成。MVD量化的一般方法是计算船舶在2 d组织学切片高度血管化的地区。然而,仍然没有MVD量化标准,和结果可以作为这种MVD冲突限制在2 d,不能给出一个全面的描述肿瘤血管生成。在这项研究中,我们使用容器中心线的特点来定义一个3 d MVD。

该船的中心线是一个重要的特性。它可以用来监视船增长,分布,变形,而且疾病的进展。因此,在本研究中,我们使用容器中心线计算3 d MVD。为此,我们使用并行细化算法找到的3 d中心线(19]。再一次,这是一个形态学操作转换选择前景像素迭代1像素宽的线条,消除内部像素形状收缩不缩短或打破它。因为并行细化算法对血管的表面非常敏感,修剪后进行了薄船中心线。

然后,3 d MVD可以定义如下:

在这里,我们使用血管中心线作为特征来描述血管网络。这些中心线的体素之间的比例和数量的所有体素在感兴趣的体积可以反映血管的密度在这个地区,这是3 d MVD。

3所示。结果

成像数据包含正常的胃和恶性的。对于每一个样本,近900的投影图像在拍摄PC-CT实验(图2(一个))。CT切片重建了FBP算法(图2 (b))。

(一)
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图2
PC-CT和CT重建图像中的投影。(一)一个投影图像;(b) CT片(酒吧:1毫米)。

胃的生理功能决定了它的形状像一个袋子一样,表面有一系列折叠。正常血管生长在胃里有弹性和直径均匀,光滑的墙,正态分布,常规的分岔。图3(一个)显示的3 d模型正常胃的血管网络,指出模型a .癌症样本,有大量的积累与异常的肿瘤血管结构包括刚度、粗糙的墙壁,和混乱的分布,如图3 (b)作为模型指出,我们随机选择感兴趣的三卷(看到)模型A和B,分别给出了放大视图的数据3 (c)- - - - - -3 (h)。这些看到的大小相同 像素。为了提供一个样本的定量评价,MVD是计算。我们在数据显示中心线提取结果3(我)- - - - - -3 (n),然后MVDs 7.17×10−4,3.99×10−4,7.07×10−4,20.72×10−4,10.01×10−4和9.72×10−4,对应于看到C h .肿瘤组织中的MVD明显高于正常组。然后,我们选择十看到每个样品和MVD在图的统计分布4。正常组MVD改变从2.87×10−49.52×10−4,平均为5.97×10−4,而在肿瘤MVD组从9.53×10−420.72×10−4平均为13.38×10−4。被学生发现明显差异t测试( )。

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(我)
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(左)
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图3
胃部正常的3 d模型和一个肿瘤。(一)正常胃的三维模型;(b)的3 d模型与癌症的胃;(碳氢键)的兴趣(VOI)模型A和B;(i n)中心线提取的结果(碳氢键)。酒吧:1毫米。

图4
MVD两组样本的统计数据。

探讨胃肿瘤的血管分布,我们随机选择10看到内部的外层和10看到肿瘤检查MVD。如图5肿瘤表面,MVD远高于在里面( ),反映肿瘤表面具有较高的船angiogenetic活动。

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(b)
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(c)
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图5
肿瘤MVD比较表面和内部。(一)肿瘤表面VOI之一;(b)一个VOI的肿瘤内部;(c)两组MVD ( 每组)。

确定nontumor地区肿瘤生长的影响,我们测试的MVD nontumor地区肿瘤组(10看到)并与正常组(10看到)。有趣的是,即使在nontumor区域,肿瘤的生长仍有强烈影响血管系统(图6)。MVD有统计上的显著差异( )。

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图6
MVD比较nontumor地区肿瘤组和正常组。(a)一个VOI nontumor地区肿瘤组;(b)的一个VOI正常组;(c)两组MVD统计( 每组)。

根据2 d MVD方法,如果我们选择在3 d VOI一片,计算船舶数字图像中,我们可以得到2 d MVD。这种方法后,我们得到了2 d和3 d MVDs表1。2 d切片是手动选择第十和每个VOI五十片。顺理成章地,肿瘤血管分布异构。2 d切片的视角主要影响的结果2 d MVD。例如,2 d MVD卷4、5、6发生了戏剧性的变化,从第十片五十。因此,一个特定的部分可能不反映肿瘤血管生成。3 d MVD微血管的体积可以保证更健壮的和一致的结果。

表1
MVD十看到。

的3 d MVD,我们也尝试过其他两个方法在四船模型情况下:(1)计数VOI的船舶数量和(2)计算船舶VOI的体素。我是一个船树大曲率;例II和III是两船树不同的直径;和第四例血管树有三个不连续代表一些检测失误。结果如图7。无论多么形状的变化或直径的变化,该方法(1)总是给了相同的结果,这意味着它不能被用来作为一个有效的方法。(2)的方法,结果是极大地影响血管直径。这两种方法不能提供合理的描述血管分布相比,该方法。


图7
从三种方法3 d MVD参数。

4所示。讨论

越来越多的证据表明,血管生成与肿瘤发生和转移有密切关系,是恶性肿瘤的主要指标之一20.,21]。根据最近的研究,CSC可能密切参与angiogenetic过程(22],这揭示肿瘤治疗的一个新的,虽然仍有不确定性的过程(23]。我们的研究提出了一种新的方法对胃癌微血管观察3 d。它提供了一个全面的视图和定量描述肿瘤血管化和可能有助于理解CSC因子在肿瘤血管生成。

肿瘤组织的血管,故可将其与正常组详细,如曲率、血管壁,分支,等等。此外,作为我们的观察显示,肿瘤微血管拥挤在表面。即使在nontumor区域恶性样本,3 d MVD高于正常组,这意味着微血管分布仍明显密度比正常细胞。

证明MVD是肿瘤血管生成的一个指标,它与肿瘤的生长和转移有密切关系。此外,它可以揭示胃癌的恶性肿瘤和作为预后的预测因子之一24]。考虑到微脉管密度的定量描述,仍然没有金本位制。这直接导致肿瘤血管生成研究的差异。怀德的二维MVD一直是公认的测量领域。然而,也许错过了“热点”,也可能不存在一个完整的肿瘤的观点证明了我们的实验表1。相比之下,3 d MVD是更健壮,微血管更直接、全面的评价。

微脉管成像、显微术是最常见的方法在最近的研究中使用。或共焦荧光显微镜可以提供高分辨率的血管,甚至细胞(25]。然而,随着精度的提高,视野大幅下降,成像深度是有限的。标本应专门保存。是非常复杂的,耗时的,resource-demanding工作的3 d图像连续胃癌的组织学切片和图像处理。通过CT重建和图像分割,我们相衬成像方法成像分辨率和软组织对比度高;此外,视野适合正常的生物样本。

一个限制在我们的研究是收集的数据。在CT扫描,胃样品有时萎缩,因为胃壁太薄,抵抗变形,使我们后续的CT重建的大麻烦。图像中的微血管只有几个像素宽。容器变形是非常困难的校准,最终造成数据丢失。

5。结论

我们的工作表明,胃癌的相衬成像可以产生清晰的视图和它的血管系统,已证实了组织学部分。我们可以定性地理解微脉管分布和检测血管的病理变化形态。血管图像分割和中心线提取后,我们的研究结果表明,3 d MVD与胃癌的病理改变密切相关。该3 d MVD能提供可靠的定量测量胃癌血管生成的。新规可以更好地促进肿瘤进展和预后的评估比2 d测量。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢员工从上海同步辐射装置BL13W beamline同类援助的实验。这项研究得到了国家自然科学基金,批准号。81401549和81401549。