移植Hypoxic-Preconditioned骨骼间充质干细胞阻碍椎间盘变性通过提高植入老鼠体内细胞存活和迁移

文摘

客观的。特殊的低氧和高渗微环境在椎间盘(试管)减少细胞移植的治疗效果。我们调查了假设缺氧预处理(HP)可以提高骨的治疗效果间充质干细胞(bmsc)试管变性。方法。从绿色荧光bmsc protein-transgenic老鼠用氯化钴(CoCl预处理₂,100年μ米,24 h)对缺氧条件在体外。细胞凋亡(相关通路caspase-3和bcl - 2)和迁移(HIF-1的相关途径α和趋化因子受体CXCR4) bmsc中被检测到。在活的有机体内,bmsc和惠普bmsc (H-BMSCs)注入试管退化的大鼠模型。试管高度、生存、迁移和分化的bmsc移植和基质蛋白表达(胶原蛋白II, aggrecan, MMP-13)测试。结果。H-BMSCs可以大量减少试管变性增加试管高度和胶原蛋白II和aggrecan表达式与bmsc相比。值得注意的是,更多的GFP-positive bmsc观察髓核和纤维环区域的试管。惠普能显著减少BMSC细胞凋亡(bcl - 2激活和抑制caspase-3)和改善BMSC移植(HIF-1增加α和趋化因子受体CXCR4)在体外。结论。惠普能显著提高企业综合能力修复DDD通过增加植入细胞的存活和迁移和基质蛋白表达增加。

1。介绍

据统计,70%的人口将生活中饱受腰痛引起的椎间盘变性疾病(DDD),导致一个严重的公共卫生问题1- - - - - -3]。手术可以缓解临床症状,尽管它无法消除椎间盘的退化(试管)4,5]。椎间盘变性的特点是减少髓核细胞(npc)和细胞外基质(ECM),和npc被更呈表型的细胞退化试管(6]。治疗治疗DDD是一个重大的挑战,因为有限的试管本身的再生。

细胞移植已成为一种有效的治疗近几十年来DDD (7]。骨间充质干细胞(bmsc)蕴含着巨大的希望在试管再生(8- - - - - -11]。bmsc多能,多功能和具有自我更新能力和分化成特定的细胞谱系(12- - - - - -16]。然而,有障碍需要被移除之前BMSC移植的临床应用。试管是人体最大的无血管组织,和营养更新只能通过被动扩散完成(17,18]。由于缺少血管和试管的特殊高渗和低氧环境(19,20.),移植的干细胞的存活率和修复能力培养共同的文化条件下是可怜的21,22]。高渗和低氧环境能减少活动和活力的移植干细胞(23,24),一种支持移植干细胞生存和治疗效果是迫切需要的。

缺氧预处理(HP)是一个强大的、内源性保护机制,从而可以增强细胞容忍后续损伤和治疗能力(25]。一些研究表明,惠普可以有效改善移植干细胞生存和治疗心肌梗死(26和脑梗塞27,28)动物模型。时间-浓度惠普的可能机制包括调节细胞内的传导,提高细胞抗损伤,移植迁移和分化,提高生长因子分泌(28- - - - - -32]。给惠普带来的好处和试管的特殊高渗和低氧环境,我们认为惠普的假设可能是一个可行的和有效的方法提高疗效的bmsc妨碍试管变性通过提高植入老鼠体内细胞存活和迁移。

惠普条件经移植前一个梯度实验,然后缺氧信号通路的变化,细胞凋亡和迁移能力,及相关分子机制在综合检测在体外。bmsc和惠普bmsc (H-BMSCs)移植到退化试管老鼠模型来验证惠普对细胞生存的作用和疗效在活的有机体内。

2。材料和方法

2.1。动物和DDD模型的建立

Sprague-Dawley (SD)大鼠(男性,3个月大)和绿色荧光蛋白(GFP)转基因雄性SD大鼠(SD-Tg CAG-EGFP cz - 004的osb, Sina-British SIPPR / BK实验室动物有限公司,中国)购买第二军医大学实验动物中心的被用于这项研究。老鼠的骨骼达到期限在3个月,试管重构证明与鼠增长无关(33]。所有程序都是机构的动物保健和使用委员会的批准。DDD模型建立了描述卢梭et al。34]。纵向切口短暂,约2厘米,沿着尾巴是公开的横向部分尾盘,Co5 / Co6和Co6 / Co7,然后21-gauge针是1.5毫米插入光盘吸入髓核材料的体积相同的定义。射线图像被抓获,确保针是平行于侧,以避免终板损伤。

2.2。伴着文化和缺氧的协议

bmsc的提取和纯化GFP转基因老鼠进行基于之前的研究(35]。bmsc时通过细胞融合率在70%至80%之间。3代的纯度(P3) bmsc被CD29 (FITC), CD90 (PE)、CD45 (APC),和CD31 (PE、古格,南京,中国)流式细胞术(FCM、贝克曼、钙、美国)。茜素红和油红O(σ,密苏里州,美国)被用来检查P3 bmsc的成骨和脂肪形成的属性。P3 bmsc新鲜完整的培养基培养,添加不同浓度的氯化钴(CoCl₂)6、12、24、48 h。的CoCl₂在完全培养基浓度维持在0,10日,50岁,100年,200年和300年μM。

2.3。检测的影响惠普CCK-8 BMSC扩散

P3 bmsc接种到96孔板(5×10³细胞/ 100μL完全培养基),细胞坚持墙后,不同的干预文化媒介所取代:完整的培养基对细胞包含0,10日,50岁,100年,200年和300年μM CoCl₂培养了6、12、24和48 h。bmsc的扩散被发现使用450 nm紫外线标仪(美国佛蒙特州生物Tek)通过使用CCK-8工具包(Biyuntian、吉首、中国)根据制造商的指示。实验重复3次,3重复井/浓度。

2.4。检测的影响惠普在Transwell BMSC移植试验

在这个实验中,我们使用聚碳酸酯插入(孔隙大小8.0μm,微孔,麻萨诸塞州,美国)建立transwell系统中的迁移模型。transwell方法是根据制造商的说明进行的。实验分为BMSC组和H-BMSC组。P3 BMSC是使用完全培养基24 h BMSC组,而P3 BMSC使用100年μM CoCl₂24 h H-BMSC组。然后,细胞培养在transwell系统与完整的媒介。Transwell插入被培养后6、12、24 h。这些细胞被洗0.01磷酸盐(PBS) 3倍和4%多聚甲醛固定30分钟。然后,迁移的bmsc沾0.1%结晶紫(谷歌,武汉,中国)20分钟。捕获的图像是用显微镜(奥林巴斯、东京、日本)。随机选择5个视野进行细胞计数。实验重复3次,每个重复使用3井。

2.5。检测的影响惠普FCM BMSC耐受凋亡侮辱

根据细胞增殖的结果,100年μM CoCl₂24 h是惠普选择条件。P3 bmsc的密度接种到6-well板1×10⁵细胞/好,培养24小时。收集贴壁细胞,细胞凋亡率被FCM检测通过膜联蛋白V-PI工具包(美国新泽西州BD)。然后,我们对bmsc与血清剥夺24 h。粘附细胞凋亡的检测是通过FCM研究血清剥夺的BMSC宽容。所有程序都是根据制造商的说明进行。实验重复3次,每个重复使用3井。

2.6。检测的影响惠普rt - pcr BMSC mRNA的表达

惠普的影响(HIF-1 BMSC移民相关基因的表达α和趋化因子受体CXCR4)和apoptosis-related (caspase-3和bcl - 2)基因检测。P3 bmsc板材在6-well培养24小时在0和100μM CoCl₂。然后,bmsc与血清剥夺挑战24 h。总使用等基因信使rna提取试剂,并建议协议(日本基因、东京、日本)。RNA样本然后反向转录cDNA,紧随其后的是特定matrix-specific基因的扩增和电泳分离。目标基因的mRNA表达规范化GAPDH。实验重复3次。引物合成的Shenggong生物医学工程(中国上海表1)。

2.7。企业综合管理

四十SD大鼠随机分为4组:虚假的组,对照组,BMSC集团和H-BMSC集团( )。虚假的组,切口是没有插入一根针。老鼠在控制、BMSC H-BMSC组21-gauge针插入。2周后,细胞移植到Co5 / Co6和Co6 / Co7光盘进行仔细通过33-gauge显微注射器(汉密尔顿,瑞士)至少5分钟。2.0μL PBS(0.01米)在对照组注射,而P3 GFP-positive bmsc (BMSC-GFP 2×10⁴细胞)溶解在2.0μL PBS中注入BMSC集团和惠普P3 BMSC-GFP (2×10⁴细胞)溶解在2.0μL PBS在H-BMSC注射组。细胞移植后4周,试管Co5 / Co6和Co6 / Co7获得的后续研究。

2.8。影像学分析

在1天前和2,4,6周后手术,横向平片被麻醉后保持尾肌肉放松。阀瓣高度计算了圆盘高度指数(济)被林et al。36]。济的变化被表示为%济和归一化测量术前试管高度(%济=术后济/术前济×100, )。试管高度的变化在不同的周被桑特分析了DICOM自由软件。所有图片是由三个独立的观察者测量是盲目的标本。

2.9。评价存活、迁移和分化的bmsc移植

细胞移植后4周,Co6 / Co7光盘分别收获和加工在Tissue-Tek O.C.T.化合物( )。组织是与冷冻切片机(德国徕卡)冠状方向生成7μ米厚的部分。一夜之间,部分被固定在4%多聚甲醛和孵化与兔子anti-rat胶原蛋白II(美国Abcam 1: 200年,ab188570)和兔anti-rat aggrecan(1: 200年,13880 - 1 - ap, Proteintech,美国)主要抗体在4°C。然后,与相应的二次孵化的部分抗体在室温下2小时。细胞核染色了4 ,6-diamino-2-phenylindole (DAPI,哈维,美国)。通过荧光显微镜观察的部分(奥林巴斯、东京、日本)。从每组随机抽取10字段计算cell-positive率。计算阳性细胞率(阳性细胞数)/(细胞总数字段)×100%。

2.10。变化的髓核组织基质蛋白(胶原蛋白II, Aggrecan和MMP-13)检测到免疫印迹

抗体的兔子anti-rat胶原蛋白II(美国Abcam ab188570),兔子anti-rat aggrecan(美国Proteintech 13880 - 1 - ap),和兔子anti-rat MMP-13(美国Abcam ab39012)是用于检测蛋白表达在髓核组织免疫印迹。细胞移植后4周,Co5 / Co6光盘收获( ),每个样本中的总蛋白由BCA法决定。胞质分数被sds - page分离、转移和固定化硝化纤维膜。使用相应的二级抗体(1:15000;Abmart、上海、中国)在室温下2 h,免疫复合物与ECL化学发光检测系统。蛋白质微定量分析与GAPDH 5σ扫描Pro和规范化水平。

2.11。统计分析

所有的结果提出了均值±SD或意味着±SEM。数据分析是由21个软件SPSS(美国芝加哥SPSS Inc .)和图被画GraphPad棱镜5软件(美国加州GraphPad Inc .)。重复测量方差分析测试数据进行了分析。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。特征的综合

鉴定的形态学、纯洁和P3执行bmsc的分化。P3 bmsc被制服、纺锤状或不规则折射(图1(一))。荧光显微镜显示,P3 bmsc与绿色荧光标记(图1 (b))。BMSC-GFP表达式是由鸡β肌动蛋白启动子和巨细胞病毒增强剂37并证实了GFP阳性的一项研究[38]。CD90 CD29 (+) (+), CD31(−)和CD45(−)是用于检测通过FCM P3 BMSC的纯度。积极的CD29, CD90、CD31和CD45为98.8%,91.3%,0.6%,和2.4%,分别为(数字1 (e)- - - - - -1 (h)),这表明,P3 bmsc的纯度高。如数据所示1 (c)和1 (d),伴着良好的成骨的能力和脂肪形成的分化。这些结果表明,获得的高纯度bmsc适合细胞疗法。

3.2。惠普对BMSC扩散的影响

CoCl的不同浓度₂可以降低扩散,这与CoCl吗₂浓度和细胞培养时间(表2)。当CoCl₂浓度是200年和300年μM, BMSC增殖明显抑制,抑制程度与文化的扩展时间(更明显 )。根据CCK-8的结果,100年的条件μM CoCl₂在24小时被选为惠普的条件。在这种情况下,惠普对BMSC扩散的影响是显著的和可接受的。

3.3。惠普降低细胞凋亡

细胞凋亡是细胞死亡的主要形式。早期凋亡率+晚期凋亡率。FCM检测结果显示在100年之后μM CoCl₂事先已经24小时;bmsc的细胞凋亡率显著增加(数据2(一个)和2 (b), ),而率还不到10%,这是在可接受的范围之内的。根据细胞生存和凋亡率结果,100μ米的CaCl₂24 h被选为实验模型,bmsc的化学惠普。在这种情况下,惠普有重大影响BMSC增殖和凋亡率在可接受范围内。然后,我们挑战bmsc与血清剥夺另一个24小时。FCM检测结果表明,惠普能充分降低BMSC细胞凋亡率和增加血清剥夺(数据BMSC宽容2 (c)和2 (d), )。

3.4。惠普调节bmsc的迁移

transwell实验显示,惠普调节bmsc的迁移。有更多的细胞通过细胞膜H-BMSC组后6 h(数字文化3(一个)和3 (d), )和12 h(数字3 (b)和3 (e), )比BMSC组。文化24 h后,两组之间的差异不显著(数字3 (c)和3 (f), ),这表明大部分的bmsc穿过膜的两组。惠普能显著增加bmsc的迁移能力。

3.5。惠普通过HIF-1增强BMSC移植α和趋化因子受体CXCR4通路和宽容通过调节bcl - 2和Caspase-3血清剥夺

caspase-3的BMSC mRNA表达,bcl - 2, HIF-1α利用rt - pcr,趋化因子受体CXCR4决心。因为caspase-3和bcl - 2激活细胞凋亡的一个重要途径,我们惠普mRNA表达进行分析,以确定是否可以通过这个途径减少细胞凋亡。HIF-1α趋化因子受体CXCR4及其下游基因,被认为是关键因素在迁移和导航的作用。因此,我们调查了mRNA内容研究惠普是否可以通过这个途径提高BMSC移植。与BMSC组相比,HIF-1 bcl - 2 mRNA的表达α和趋化因子受体CXCR4 H-BMSC组明显增加,而caspase-3显著降低(图4, )。这些结果表明,惠普可以显著提高通过HIF-1 BMSC移植α和趋化因子受体CXCR4通路和宽容通过调节bcl - 2和caspase-3凋亡的侮辱。

3.6。惠普提高维护试管高度的综合能力

摄影表明,济虚假的组(没有明显变化 )。济降低试管变性的感应控制后,BMSC, H-BMSC组(图5)。平均济对照组继续下降直到6周后诱导试管变性。济的BMSC和H-BMSC组要高得多的价格相比对照组( H-BMSC组),意思是济远高于BMSC组细胞移植后4周( )。所有这些数据表明,企业综合管理可以保持试管高度,和惠普能增强这种能力。

3.7。惠普在退化试管增强BMSC生存和迁移

BMSC-GFP被发现在细胞移植4周后(图6)。没有虚假的GFP-positive细胞和控制组织(数据未显示)。细胞移植后,BMSC-GFP大多分布在试管的中心,细胞在移植细胞的密度更大,有更多的ECM移植细胞(数字6 (b),6 (e),6 (h))。而在H-BMSC集团BMSC-GFP相对分散在整个试管。一些BMSC-GFP迁移到纤维环的6 10盘H-BMSC组(数字6 (e)和6 (f)),以及2 10的BMSC组。的数量BMSC-GFP髓核和纤维环地区地区的H-BMSC组更高的价格相比BMSC组(图6 (h), )。这意味着更多BMSC-GFP H-BMSC组可以迁移到纤维环区域,和惠普可以上调bmsc的迁移。BMSC-GFP局部髓核地区提出了一个更圆的形状,类似于本机髓核细胞(数字6 (b)和6 (e))。内层纤维环地区BMSC-GFP纺锤状,类似于原生纤维环细胞,这可能会“区分”成纤维环细胞(数字6 (g)- - - - - -6(我))。从免疫组织化学结果(补充图1),我们发现bmsc移植可以表达胶原蛋白II和aggrecan。我们还发现,所有的NP细胞和细胞外基质在髓核地区被免疫组织化学染色胶原蛋白II和aggrecan,和移植的bmsc包围了积极的细胞外基质。所有这些日期可能导致假阳性的bmsc移植和未来需要更多的研究。惠普增强BMSC移植后存活和迁移到退化试管。

3.8。惠普增强BMSC矩阵蛋白表达

免疫印迹分析是利用胶原蛋白的表达II, aggrecan, MMP-13蛋白质在髓核组织细胞移植4周后(图7)。胶原蛋白II和aggrecan明显减少控制,BMSC,和H-BMSC团体,而虚假的集团( ),这表明矩阵蛋白表达显著减少时,试管被退化。同时,胶原蛋白的蛋白表达II和aggrecan H-BMSC组显著高于BMSC组( )。MMP-13蛋白表达显著增加相比,对照组与虚假的集团( )。与BMSC组相比,MMP-13水平大幅降低H-BMSC组( )。这些结果表明,bmsc增强矩阵相关的胶原蛋白II和aggrecan蛋白表达通过抑制MMP-13通路,惠普可以移植的效果。

4所示。讨论

本研究的目的是为了证明bmsc的假说,惠普可以提高能力修复植入DDD通过增加细胞存活和迁移。基于BMSC扩散(表的结果2)和细胞凋亡(图2与100年),预处理μM CoCl₂24 h被选为惠普这个实验条件。我们发现惠普能显著提高通过通路的HIF-1 bmsc的迁移能力α和趋化因子受体CXCR4和减少BMSC凋亡通路caspase-3和bcl - 2在体外(图4)。惠普BMSC移植和细胞凋亡的影响在体外提供了理论依据使用H-BMSCs治疗DDD在活的有机体内。研究惠普能否提高BMSC的疗效试管变性,我们评估了BMSC移植存活和迁移后4周(图6济(图)5)和矩阵蛋白胶原蛋白II, aggrecan MMP-13(图7在试管)。BMSC移植能有效治疗DDD,和这个结果与以前的研究一致8- - - - - -11]。惠普能提高DDD的BMSC治疗效果,这是一致的结果在体外。惠普可以增强bmsc的能力来修复植入DDD通过增加细胞存活和迁移。

试管退化衰老和椎间盘的压力,是一个不可避免的后果及其相关问题,如腰痛是严重的健康问题有一个很大的社会经济负担39]。细胞疗法是一种新的有希望的治疗这种疾病(40,41]。各种各样的间充质干细胞被用来修复DDD和取得良好的成果,如骨髓的细胞(8- - - - - -11,脂肪42],脐带血[43),沃顿商学院的果冻44),嗅觉干细胞(45),诱导多能干细胞(46]。容易获得bmsc收到了广泛的关注,多能,多功能的能力(8- - - - - -11]。之间的比较研究干细胞和分化细胞治疗DDD是有限的和有争议的,这需要未来的研究。分化细胞可能在生产更多的优质ECM和antidamage能力不如47,48]。然而,有许多障碍,需要解决在细胞疗法。注入试管将加速退化的试管。在细胞移植的过程中,有必要使用一根针穿透纤维环和进入髓核,导致试管的结构完整性的破坏。这里的研究证实,试管变性显著加速病人进行了录音作品目录(49]。Vadala等人发现bmsc可能发生核泄漏和不受欢迎的骨赘(50]。最小化这些并发症,33-gauge显微注射器和细胞移植用于每个试管在这项研究至少5分钟。一方面,最小的针是用来减少椎间盘变性引起的细胞移植本身;另一方面,注射时间至少5分钟,以减少电池泄漏。DDD的关键屏障限制细胞移植应用程序处理的特殊高渗和低氧环境试管。植入细胞可能遭受明显的细胞丧失,细胞活动,和分化减少在这个严酷的,贫瘠的环境(51,52]。惠普的应用移植干细胞疗法已经报道了近年来许多疾病,如心脏梗塞的(26和缺血性中风27,53]。考虑到特殊的试管与生物力学环境压力和缺氧,我们表明,惠普可以显著提高bmsc修复DDD的能力和提供了一个有效的方法来解决这个明显的细胞丧失,细胞活性,分化减少DDD的细胞移植治疗。

它是有争议的,如何准确地确定BMSC分化成NP -或AF-like细胞在活的有机体内到目前为止。只有有限的直接研究的细胞分化从PubMed试管发表的报告8- - - - - -11]。在这些论文,没有标准和具体指标的确定bmsc的分化到试管。研究将bmsc移植到试管的分化组织,我们曾试图使用免疫组织化学检测到GFP的表达,胶原蛋白II, aggrecan bmsc移植用抗体胶原蛋白II和anti-rat aggrecan(补充图。1)。从免疫组织化学结果,我们发现bmsc移植可以表达胶原蛋白II和aggrecan。我们还发现,所有的NP细胞和细胞外基质在髓核地区被免疫组织化学染色胶原蛋白II和aggrecan,和移植的bmsc包围了积极的细胞外基质。所有这些日期可能会导致移植bmsc的假阳性。研究bmsc到试管的分化细胞/组织需要标准和具体指标,这是我们未来的研究方向。

CoCl₂是一个经典化学缺氧模拟器的优点和广泛使用,因为简单的使用和简单,精确控制治疗的条件(54- - - - - -56]。缺氧机制的模拟是铁的替代^{2 +}由有限公司^{2 +}在血红蛋白,血红蛋白变化脱氧状态。在这种状态下,细胞“感觉”在常氧环境中缺氧(57]。很容易与CoCl控制实验条件₂在体外,但有一些限制。没有证据表明CoCl所扮演的角色₂积累在细胞。因此,我们反复清洗与正常培养基残CoCl的影响降到最低₂在培养基。CoCl机制₂是,公司^{2 +}低氧诱导因子和趋化因子受体CXCR4的表达增加(26- - - - - -28,58- - - - - -60]。趋化因子受体CXCR4 bmsc迁移(被认为是一个关键因素61年]。细胞培养条件可以减少bmsc的迁移能力通过下调趋化因子受体CXCR4表达(62年]。新鲜的孤立的BMSC可以迁移到受损组织,而之后BMSC文化迁移能力将明显减少在体外24小时之后。惠普能促进迁移的bmsc证明在某些研究[63年- - - - - -67年]。在这项研究中,我们证实了惠普CoCl引起的₂可以促进迁移、自导和殖民的bmsc通过趋化因子受体CXCR4和HIF-1的途径在体外。

惠普最优条件应该有一个轻微的影响细胞的生存能力,提高迁移和细胞损伤明显宽容。因此,根据细胞增殖和细胞凋亡的结果,100年μM CoCl₂培养24小时被选中。CoCl的影响₂都依赖于浓度(60]。长期的细胞培养时间可能会导致细胞分化,衰老,和其他问题68年,69年]。缺氧会导致分化的bmsc [70年)通过途径和影响细胞活性和功能的低氧诱导因子(71年,72年]。它可能是更合适的选择CoCl浓度更高₂培养时间短,没有显著减少细胞活性和细胞凋亡增加。惠普可能导致bmsc的适应性变化。虽然机制还不清楚,bmsc的适应性变化可以产生更强的适应能力和抵抗随后强有力的和有害的刺激。惠普可以促进通过HIF-1 BMSC移植α和趋化因子受体CXCR4通路,减少细胞凋亡caspase-3和bcl - 2,在本研究证实。

5。结论

总之,移植H-BMSC阻碍试管变性通过提高植入老鼠的细胞存活和迁移,这提供了一个有效的方法提高在DDD BMSC移植治疗的影响。然而,环境和试管的退化模型大鼠和人类之间是不同的。进一步的研究应该进行关于H-BMSC移植在临床应用。

的利益冲突

作者声明没有竞争的经济利益。

作者的贡献

王Weiheng Guoying邓小平进行实验工作。阳王写的手稿。杨,马骏,小东黄帮助和分析方法。肖建你们Jiangming Yu,花城Xi设计和实验支持。所有作者回顾和批准了手稿。杨Weiheng Wang Wang和Guoying邓小平的贡献同样这项工作。花城Jiangming Yu Xi,肖建你们同样支持这项工作。

确认

这项工作由中国国家自然科学基金(批准号81472071,格兰特没有。上海81301537)和围手术期血液管理(批准号2016 - n - 14 - 06)。

补充材料

补充图1:分化的bmsc试管移植后4周(200×)。和E代表DAPI细胞核图像覆盖。B和F显示GFP-positive bmsc。C显示胶原II-positive细胞。G显示aggrecan-positive细胞。D合并的A、B和c H合并E, F, G。(补充材料)

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