人类脂肪间充质干细胞更有效的促进血管生成的节目比脐带和子宫内膜内皮细胞克隆形成

文摘

血管生成是一个复杂的过程中,血管周围细胞发挥着重要作用。多能间充质干细胞/基质细胞(msc)从不同的组织已经被证明是proangiogenic和分享功能属性和与血管周的细胞基因表达谱。但是,不同的组织派生msc可能出现不同的临床应用潜力。因此,比较研究不同msc是至关重要的。这里,我们为msc从脂肪(ADSCs),脐带(UCMSCs)和子宫内膜(EMSCs)乙肝表面抗原表达、分化能力,和血管生成的能力促进内皮细胞克隆形成(ECFCs)在体外和体内。没有观察到显著差异在immunophenotype和分化。此外,三种类型的msc周围位于tubular-like coculture系统结构由ECFCs基底膜基质。但ECFCs播种ADSCs单层形成更有条理比UCMSCs或EMSCs capillary-like网络。暂停时ECFCs在基底膜基质和植入裸鼠,ADSCs提升更多的功能性血管形成后7天。此外,在小鼠后肢缺血模型中,cotransplantation ECFCs ADSCs明显优于UCMSCs和EMSCs在促进灌注恢复和保肢。 Furthermore, ADSC-conditioned medium (CM) contained more proangiogenic factors (such as vascular endothelial growth factor-A, platelet-derived growth factor BB, and basic fibroblast growth factor) and less inhibitory factor (such as thrombospondin-1), when compared with UCMSC-CM and EMSC-CM. And ADSC-CM more durably stabilized the vascular-like structures formed by ECFCs on matrigel and promoted ECFCs migration more efficiently. In summary, MSCs from adipose show significantly efficient promotion on angiogenesis both in vitro and in vivo than UCMSCs and EMSCs. Hence, ADSCs may be recommended as a more suitable source for treating hindlimb ischemia.

1。介绍

细胞疗法治疗缺血性疾病已成为一个有前途的战略,包括外周动脉疾病,心肌梗死,中风和肢体缺血1]。人类脐带血- (UCB)派生的内皮细胞克隆形成(ECFCs) [2)被认为是一个有吸引力的细胞来源缺血治疗(3,4),因为他们的增殖能力,分化为成熟内皮细胞(ECs),和秘密细胞因子(2,5]。然而,血管新成立的由单一ECFCs有限频率和大小由于没有助理的细胞类型,如血管周的细胞(6]。

多能间充质干细胞/基质细胞(msc),已证明了分享功能性质和基因与血管周的细胞(7),能够证明缺血组织的血管周的作用,促进血管形成(8,9]。最初的收获msc、骨骨髓来源msc (bmsc)有能力支持血管生成在临床上使用时和在各种临床前模型系统(1]。然而,它的入侵隔离程序,除了数量显著减少相对的msc和随着年龄的增长其分化潜力10],严重限制了大规模的临床应用。

替代来源的msc的出现提供了更多的可能性。脂肪干细胞(ADSCs)很容易从废弃的抽脂组织中分离出来,并能保持体外长时间稳定的人口翻了一番,低水平的衰老11]。此外,ADSCs有潜力增加新血管形成和提高功能恢复缺血后(12,13]。脐带间充质干细胞/基质细胞(UCMSCs),这可以很容易地收集没有侵袭性和丰富(14),较低的表达类I和II主要组织相容性复合体,这使其成为临床应用(另一位候选人15]。UCMSCs也可以提高缺血肢体灌注(16]。人类子宫内膜是一个高度增殖和不断再生组织。因此,子宫内膜间质干细胞/基质细胞(EMSCs)参与子宫内膜再生被认为是一个强大的组织修复的候选人。已经证实这些细胞产生proangiogenic MMP3等因素,MMP10, gm - csf, angiopoietin-2, PDGF-BB [17]。此外,注入EMSCs动物后肢缺血模型导致了减少肢体坏死(18]。然而,msc孤立的从不同的组织可能会表现出不同的临床应用潜力根据他们的起源,和目前尚不清楚是否有差异在这些血管生成促进msc。

在这项研究中,我们培养和鉴定ADSCs, UCMSCs EMSCs, ECFCs。Coculture系统和matrigel-based皮下注射msc和ECFCs被用来比较不同的proangiogenic潜在tissue-derived msc在体外和体内。的ECFCs cotransplantation msc被用来评估治疗下肢缺血的潜在模型中。此外,我们分析了angiogenic-related因素MSC-conditioned介质(CM)由蛋白质阵列和MSC-CM对angiogenesis-related ECFC行为,包括迁移、扩散和稳定。我们发现ADSCs分泌更多proangiogenic因素和显示更强的能力,促进血管细胞的功能和新血管形成与UCMSCs和EMSCs相比。

2。方法

2.1。道德声明

在这项研究中使用的所有方法进行依法批准中南大学的道德准则。所有适用的国际、国家和/或机构动物保健和使用指南。研究协议是由中南大学制度审查委员会批准。之前获得知情同意从所有科目学习。

2.2。隔离ECFCs

UCB从正常足月分娩获得知情同意的母亲从湖南省的妇女医院和儿童健康。分离、培养UCB-ECFCs如前所述[2]。短暂,UCB稀释杜尔贝科的磷酸盐(DPBS) 1: 1,覆盖到1.077 g / ml Ficoll-Paque™溢价(美国通用电气医疗集团),紧随其后的是30分钟的离心400 g。UCB-monocytes被收集和播种到组织培养板涂有纤连蛋白(美国微孔)EGM-2(美国Lonza) 37°C公司5%₂。培养基是改变每2天。典型的殖民地出现5和10天之间和在subconfluence通道。

2.3。msc的隔离

人类脂肪组织是通过简单的抽脂的腹部皮下三个年龄在20岁到40岁的健康女性捐赠者(中南大学湘雅医院,长沙,中国)。脂肪组织是消化使用一个包含2毫克/毫升胶原酶消化解决方案,2 U /毫升dispase和2毫克/毫升透明质酸酶(所有从Sigma-Aldrich购买,密苏里州,美国)为90分钟37°C。消化组织是离心10分钟(1000 rpm),和间质血管分数(SVF)与DPBS洗。SVF培养在杜尔贝科的修改鹰medium-F12 (DMEM / F-12)包含10 ng / ml碱性纤维母细胞生长因子(美国GIBCO bFGF)和10%胎牛血清的边后卫。媒介改变了每隔一天直到融合细胞达到80% -90%。可以收获和细胞扩张和冻结。

脐带(加州大学)获得健康的婴儿在无菌条件下(第三中南大学湘雅医院),24小时内处理。清除血管后,组织碎在0.5厘米³大块和消化消化解决上面提到的16 h在37°C。细胞在DMEM培养/ F-12包含10 ng / ml bFGF和10%的边后卫。3天后,不依从细胞被移除。每隔一天中被改变。可以收获细胞扩张和冻结,直到细胞融合达到80% -90%。

正常子宫内膜组织收集妇女(年龄在20到35)接受小手术的妇科手术的子宫内膜吸刮匙(生殖与遗传专科医院的伦理委员会CITIC-XIANGYA)。组织用PBS去除血,彻底被切碎的细解剖刀,消化消化解决上面提到的2 h在37°C。细胞在DMEM培养/ F-12包含10 ng / ml bFGF和10%的边后卫。36小时后,无限的细胞被移除。每隔一天中被改变。可以收获细胞扩张和冻结。

2.4。流式细胞术分析

ECFC单细胞悬液是由分离细胞生成TrypLE™表达酶(美国Gibco)和resuspended 1×10的浓度⁷细胞/毫升。样本孵化,分别与反CD31-FITC(美国eBioscience) VEGFR2 / KDR-PE(研发、美国),CD144-FITC(英国Abcam) CD34-PE(美国Biolegend) CD45-FITC(美国Biolegend)和CD14-FITC(美国eBioscience)。msc resuspended 1×10的浓度⁶细胞/毫升和孵化,分别与反CD29-PE(美国Biolegend) CD90-PE(美国Biolegend) CD14-FITC(美国Biolegend) CD19-PE(美国Biolegend) CD73-FITC(美国Biolegend) CD105-FITC(美国Biolegend) HLA-DR-PE(美国Biolegend) CD34-PE(美国Biolegend) CD45-FITC(美国Biolegend)和CD31-FITC(美国eBiosciences)。5μl抗体溶液添加到100年μl细胞悬液和孵化30分钟在4°C在黑暗中;400年μ分析了l (PBS添加和细胞与FACSAria我(美国,正欲)或Accuri C6(美国,正欲)和正欲CELLQuest软件。

2.5。脂肪生成

脂肪形成的分化诱导msc通道4的脂肪形成的分化培养基组成的DMEM / F-12补充10%的边后卫,1更易与L地塞米松(Sigma-Aldrich), 0.5更易与L isobutylmethylxanthine (Sigma-Aldrich), 10毫克/毫升重组人类胰岛素(Sigma-Aldrich),和100年更易与L消炎痛(广东华南制药集团有限公司、广东,中国)。感应21天后,细胞被沾油红O (Sigma-Aldrich)检测在脂肪细胞中性脂质空泡的形成。

2.6。骨生成

成骨分化的msc诱导的成骨分化培养基组成的DMEM / F-12包含10%的边后卫,10更易/ Lβ甘油磷酸酯(Sigma-Aldrich), 50μ抗坏血酸盐(Sigma-Aldrich)和100 nmol / L地塞米松(Sigma-Aldrich)。评估了骨碱性磷酸酶染色(表达载体、钙、美国)诱导骨生成后21天。

2.7。软骨形成

软骨形成的msc分化通道4是由软骨细胞分化诱导的基础培养基(美国Gibco)播种后1.6×10⁵在10μl在24-well细胞培养板的中心,与介质变化每3天。文化21天后,细胞被固定在4%多聚甲醛和沾1%阿尔新蓝(Gibco)检测软骨细胞蛋白多糖的合成。

2.8。血管生成Coculture Tubulogenesis模型基底膜基质

美国coculture系统在基底膜基质(BD)在96 -孔板。ECFCs和msc分别贴上UEA-I(向量实验室,美国)和CFSE (Dojindo实验室,日本)。简单,细胞悬架与DPBS洗3次,然后用DPBS resuspended 1×10⁶/毫升。增加50μl UEA-I或CFSE每毫升细胞悬液。细胞培养15分钟(UEA-I标签)或30分钟(CFSE标记)37°C在黑暗中。洗细胞DPBS为3倍以下实验。混合细胞(ECFC: MSC = 2: 3,总1.2×10⁴细胞)是悬浮在50μl EGM-2,播种在基底膜基质,孵化在37°C。小管被捕2 h后的图像用荧光的相机(尼康TE2000-U、日本)。

2.9。小管形成分析

msc,分别播种到24-well盘子1.5×10⁴细胞/厘米²包含10%的边后卫和孵化L-DMEM confluency直到80%。ECFCs被播种在msc单层1×10⁴细胞/厘米²和孵化EGM-2媒介。经过6天coculture, UEA-I染色。使用荧光显微镜拍摄的图像(美国ELX800 Biotek)和尼康摄影系统(eclipse Ti-S尼康,日本)。量化分析ImageJ处理软件(美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)。

2.10。条件培养基的制备

msc在通道4 (1×10⁶)在上述介质培养confluency 80%。细胞被洗DPBS然后培养EBM-2中含有0.2%的边后卫72 h。中收集和离心机,上层清液被冻结在−70°C使用。

2.11。在基底膜基质MSC-CM ECFC介导的血管生成

ECFCs,分别悬浮在50μl EBM-2 ADSC-CM、UCMSC-CM或EMSC-CM和播种1.2×10⁴细胞/ 96 -孔板在基底膜基质37°C。小管被相机捕获的图像(尼康Coolpix 4500年,日本)在不同的时间间隔。集成的血管环的视野被数进行以下分析。

2.12。ECFC扩散分析

在2×10 ECFCs被播种³细胞/在96 -孔板24 h孵化。改变了EGM-2 MSC-CM 24小时孵化。5毫克/毫升MTT然后用移液器吸取到4 h在黑暗中孵化。后用100代替MTT的解决方案μl DMSO /振动10分钟,吸光度检测在570 nm使用Bio-Rad模型680 96孔板读者(赫默尔亨普斯特德镇Bio-Rad实验室Inc .)、英国)。

2.13。ECFC迁移分析

ECFCs镀在1×10⁵细胞/在1毫升EGM-2 24-well盘子和孵化24 h。擦伤的伤口在每个生成使用200μl吸管小费。媒介是MSC-CM所取代,伤口大小被相机记录(0 h)。每24小时后再次被拍到文化。实现量化ImageJ软件(美国国立卫生研究院)。

2.14。人类蛋白质组

根据样品制备RayBiotech公司的指令,MSC-CM准备如上所述。分析了细胞因子表达人类蛋白质阵列由RayBiotech公司(美国GA)。

2.15。体内Vasculogenic化验

雄性BALB / c裸小鼠购自线性有限公司有限公司(上海,中国)。msc与ECFCs混合(比3:2,总2×10⁶细胞)在200年μ美国l基底膜基质(BD)和混合的背侧皮下注入6雄性BALB / c裸小鼠。植入后7天进行组织分析。3次重复了同样的实验,独立。

2.16。他走时染色和免疫组织化学

背侧皮下植入收获的老鼠缓冲福尔马林固定在10%,在30%蔗糖溶液脱水,嵌在石蜡中。部分(7μm),安装在幻灯片,与苏木精和伊红染色。反CD31(英国Abcam;1:250)和反alpha-smooth肌肉肌动蛋白(αsma;英国Abcam;1:100)免疫组织化学染色在清白的串行部分。负控制单独使用二级抗体生成并行,以确保没有发生非特异性染色。

2.17。建立小鼠后肢缺血模型和细胞移植

55雄性BALB / C裸小鼠20 - 25 g的体重被腹腔内注射与4%水合氯醛麻醉。右侧股动脉和静脉结扎和切断诱导缺血至关重要。24小时后,小鼠随机分为5组,然后收到细胞通过尾静脉注射移植:生理盐水(NS), ECFC, ECFC + ADSC, ECFC + UCMSC, ECFC + EMSC ( ,比3:2,总6.25×10⁵细胞)。

2.18。激光多普勒灌注成像

老鼠用4%水合氯醛麻醉,然后受到激光多普勒灌注成像(LDPI、沼泽仪器、英国德文郡)。动物被放在一个37°C加热垫2 - 5分钟允许适应测量前的环境条件。每个鼠标成像一式三份。结果报告为灌注比率(PR)相对于对侧的未经处理的后肢。

2.19。统计分析

所有独立实验至少重复3次。数据表示为平均值±标准偏差(SD)。对比组由单向方差分析用SPSS17.0 (SPSS Inc .)、美国)。动物外观恢复研究中,克鲁斯卡尔-沃利斯H使用方差分析。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。描述人类UCB-Derived ECFCs

单核细胞从人类脐带血分离形成典型的7 - 10天后cobblestone-like殖民地文化fibronectin-coated文化板块(图1(一))。分析了表面标记在通道4。细胞内皮标记CD31阳性(96.17%±1.03%),CD144 (VE-Cadherin, 96.77%±0.37%),和KDR (VEGFR2, 60.67%±14.03%),阴性hematopoietic-related抗原CD45(1.57%±0.40%)和单核细胞分化抗原CD14 (1.23%±0.26%)。CD34在一定程度上积极表达(20.33%±5.89%)(图1 (b))。ECFCs的功能特性是研究在细胞培养基底膜基质。细胞显示互联capillary-like网络(图1 (c))。

3.2。描述msc源自人类脂肪,脐带,子宫内膜

msc隔绝人类脂肪,脐带,分别和子宫内膜组织。纺锤状形态观察在初始镀后4 - 7天贴壁细胞,细胞通道4观察图2(一个)显示均匀fibroblastic-like形态

我们分析了msc的表面标记通道0和4(图2 (b))。msc在通道0部分表达了hematopoietic-related CD34标记(ADSC, 40.60%±11.86%;UCMSC, 0.70%±0.30%;EMSC, 5.60%±2.10%)、CD45 (ADSC, 4.3%±2.55%;UCMSC, 1.00%±0.30%;EMSC, 42.20%±3.52%)和内皮标记CD31 (ADSC, 5.30%±4.32%;UCMSC, 0.75%±0.45%;EMSC, 22.80%±4.95%)。随后,所有msc通道4均匀显示积极表达CD29间充质标记(ADSC, 99.53%±0.12%;UCMSC, 98.7% 0±0.30%; EMSC, 90.75% ± 0.05%), CD90 (ADSC, 97.60% ± 1.21%; UCMSC, 98.4% ± 0.33%; EMSC, 92.55% ± 0.05%), CD73 (ADSC, 98.75% ± 0.85%; UCMSC, 97.9% ± 0.5%; EMSC, 99.8% ± 0.2%), and CD105 (ADSC, 98.95% ± 0.45%; UCMSC, 93.4% ± 1.02%; EMSC, 96.95% ± 0.45%) and were negative for CD31 (<1%), CD34 (<2%), CD45 (<2%), CD14 (<1%), CD19 (<1%), and HLA-DR (<1%)

此外,脂肪形成的、成骨的chondrogenic msc分化潜力的评估。如图2 (c),UCMSCs ADSCs EMSCs显示潜在的分化为脂肪细胞,骨细胞和软骨细胞。

3.3。ADSCs比UCMSCs Proangiogenic EMSCs体外

比较的proangiogenic效应三个tissue-resident msc在体外,coculture ECFCs制度与msc进行人工基底膜。如图3(一个),ECFCs组组装成capillary-like结构。值得注意的是,三种类型的msc都坐落在由ECFCs tubular-like网络。

ECFCs随后被播种的单层ADSCs, UCMSCs和EMSCs分别。6天后孵化,ECFCs没有喂食器只显示分散分布没有tubular-like结构(图3 (b))。ECFCs播种ADSCs形成更有条理和集成capillary-like网络与UCMSCs ( )和EMSCs ( ),和血管的长度,连接的数量和比例的血管面积为18.96±3.52,81.72±14.09和23.97%±2.11%(数据3 (b)和3 (c)),分别。ECFCs播种在UCMSCs只有单管状结构形成一些连接(长度,2.90±1.31;路口,6.94±3.22;区,3.05%±1.29%),而ECFCs播种EMSCs只有聚集一些capillary-like结构形态(长度,0.22±0.31;路口,0.09±0.13;区域,0.40%±0.57%)(图3 (c))。因此,比UCMSC ADSCs更有效和EMSC在促进ECFCs体外形成管状网络。

3.4。ADSCs比UCMSCs Proangiogenic EMSCs体内

进一步评估proangiogenic msc体内的能力,基底膜基质含有ECFCs和msc是注入null-mice背侧皮下。在注射后的7天内,基底膜基质被剥去,如图4(一),红色的字段和阴影显然是不同的在不同的群体。的植入ECFC-ADSCs条件显示特别是最红。随后,为了证实血管起源、人类特定CD31和αsma抗体被用来识别内皮细胞和基质细胞,分别。如数据所示4 (b)和4 (c)血管形成,植入物被hCD31积极染色,和积极a-SMA染色是压痕周围局部新开发的血管。仅在细节,vessel-like结构由ECFCs非常小。Coinjection ADSCs和ECFCs带均匀分布vessel-like结构几乎统一的腔的大小。但在UCMSCs血管形成的腔大小和EMSCs组织截然不同,甚至表现出一种无序的状态。与此同时,组织学结果显示不同群体之间的船舶数量的差异。如图4 (d),ECFCs只有很少形成血管。ADSCs UCMSCs提升船舶数量显著增加,而无统计差异观察EMSCs组相比ECFCs孤单。其中,ADSCs团体形成更vessel-like结构与UCMSCs ( )和EMSCs ( )。总的来说,这些结果表明,ADSCs促进了微脉管ECFCs形成更有效的体内。

3.5。Cotransplantation ADSCs和ECFCs更有效地促进下肢缺血小鼠模型的血管再生

msc的proangiogenic属性进一步探讨在小鼠后肢缺血模型。24小时后右股动脉结扎和切除手术,ECFCs和msc cotransplanted通过尾静脉注射到老鼠。的灌注缺血肢体在第0天LDPI探测到,7、14、21日和28日。图5(一个)结果的代表性。ECFCs的结果表明,cotransplantation ADSCs显著提高缺血性四肢的血液流动与其他组相比在7天(0.94±0.10; )(图5 (b))。在第14天,EMSC-ECFC集团相对较低灌注率(0.52±0.13),同时观察其他组没有区别。在21天的数据显示血流的统一趋势复苏不同群体。无统计差异在所有组血液灌注率,直到28天。

在28天的恢复缺血后肢被定义为五个进步水平:保肢,臃肿的脚,肌萎缩,肢体轻微的损失,严重丧失肢体(图5 (c))。如图5 (d)细胞移植,大大提高了保肢率和降低了肢体的损失。肢体损失的比例(包括轻微损失和严重亏损肢体)在NS组50%,和老鼠最后保肢;ECFCs cotransplantation和msc明显优于ECFC单独移植。ECFC组的严重亏损率为5.6%,和ADSCs-ECFCs cotransplantation显示显著的恢复的最佳效果鼠标缺血性下肢没有严重损失的肢体( )。尽管缺血性下肢的血液流动并没有显示统计差异组28天,ADSCs组的血流灌注率高于其他群体在7天。因此,快速缺血组织的血管再生恢复其生理功能至关重要。

3.6。ADSCs分泌更多Proangiogenic-Related因素

我们查询的不同是否促进ECFCs msc对血管形成的影响是由于MSC-secreted proangiogenic细胞因子。angiogenic-related细胞因子的资料ADSC-CM, UCMSC-CM, EMSC-CM分析细胞因子抗体阵列。结果表明,三种类型的MSC-CMs所有包含多种血管生成细胞因子(图6(一))。如图6 (b),ADSCs分泌显著更高层次的许多细胞因子和基质金属蛋白酶,直接促进内皮细胞迁移、增殖和内皮发芽,如VEGF-A ( ,相比之下,UCMSC; ,而EMSC)、bFGF ( ,UCMSC; ,EMSC)、PDGF-BB ( ,UCMSC; ,EMSC), TGF -β1 ( ,UCMSC; ,EMSC)、IFN-gamma ( ,UCMSC; ,EMSC)、il - 10 ( ,UCMSC; ,EMSC)、chemerin ( ,UCMSC; ,EMSC)、MMP-9 ( ,UCMSC; ,EMSC)和MMP-13 ( ,UCMSC; ,EMSC)。UCMSC分泌趋化因子MCP-1 ( )和GCP-2 ( )相比之下,ADSC, EMSC。EMSC MMP-3的表达显示优势( )和angiopoietin-1/2 ( )。然而,ADSC血小板反应蛋白- 1的分泌少,一个强有力的抑制剂ECs的增殖和迁移,而UCMSC ( )或EMSC ( )。集体,ADSCs proangiogenic细胞因子,减少分泌抑制剂相比UCMSCs EMSCs。

3.7。ADSC-CM促进Vessel-like结构更稳定

ECFCs播种在基底膜基质中培养包含MSC-CMs EBM-2介质。capillary-like结构计算在2 h, 5 h, 24 h,分别为48 h(补充图S1)。ECFCs在所有条件下形成互联capillary-like网络2 h,和capillary-like戒指的数量没有显示出不同的CM组差异(图7)。但添加MSC-CMs显著增加capillary-like网络的形成(EBM-2, 87.5±5.5;ADSC-CM 153±7, ;UCMSC-CM 162±9, ;EMSC-CM 161±3, ;相比之下,EBM-2)。网络是随着时间的推移逐渐崩溃。剩下的血管环的数量ADSC-CM (24 h, 55±3;48 h, 39.5±0.5)显著超过UCMSC-CM (24 h, 41.5±0.5, ;48 h, 27.5±1.5, )和EMSC-CM(24小时37±1, ;48 h, 23.5±1.5, )1)(在线资源。因此,ADSC-CM比UCMSC-CM更有效率,EMSC-CM维持内皮基底膜基质上网络的稳定性。

3.8。ADSC-CM显著增加ECFC迁移

随后,我们分析了体外MSC-CM对ECFC迁移和增殖的影响。如图8(一个)ADSC-CM显示,更好的促进ECFC迁移而影响UCMSC-CM ( )和EMSC-CM ( )。ECFC的迁移率分别54.87%±11.83%(在ADSC-CM), 28.40%±6.37%(在UCMSC-CM), 32.24%±4.51%(在EMSC-CM),和27.10%±7.21% (EBM-2)(图8 (b))。ECFC扩散中观察组无显著差异(图8 (c))。

4所示。讨论

此前,移植ECFC发现促进缺血组织的血管新生(19]。但vascular-like结构由只ECs显示不稳定,这可能与缺乏血管周的细胞类型(6]。msc不仅与血管周的细胞显示类似的特征(7与ECFCs),但也有密切联系。例如,由msc分泌的因素以及ECFCs发现有互补作用对体外血管生成的影响[20.]。此外,ECFCs可以调节的再生潜力msc (21),而msc可以分泌细胞因子促进生存、增殖,迁移ECFCs [22]。另一个有趣的报告显示,MSC和骨骨髓来源的内皮细胞表达之间的直接接触Flk-1 + CD34 +可以诱导pericyte-like表型和血管生成在MSC (23]。因此,联合应用ECFC和缺血cytotherapy MSC是一个理想的模型。

值得注意的是,msc以来广泛组织起源、和组织的起源和其特定的利基市场影响力msc的可塑性24),组织之间的直接比较是有意义的,没有问题。先前的研究描述了现有的差异在不同tissue-derived msc。Kern等人相比,msc的增殖能力来源于脂肪组织,骨髓、脐带血和发现UCB-MSCs最长可以培养,增殖能力最高,而bmsc具有最短的最低文化时期和增殖能力(25]。此外,分析综合和UCB-MSCs表明前者显示与成骨分化相关的基因的表达水平较高,而后者表现出更高的血管生成相关基因的表达(25]。金等人也发现UCB-MSCs细胞增殖率最高,但表达水平显著降低衰老标记,包括p53、p21, p16 (26]。但是从脂肪组织的msc显示更好的迁移和导航能力相比bmsc [27]。但是不同的msc是否会导致不同的效果还不是决定性的。指出msc从胎盘羊膜、绒毛膜和脐带施加类似的有利影响伤口闭合和新血管形成28),和骨髓、脂肪组织和牙髓也证明了作为一个普遍的烧伤伤口愈合(MSC来源29日]。相反,Aboulhoda和Abd El Fattah证明ADSCs显示显著改善伤口愈合比bmsc [30.]。和脂肪msc也证明方面表现出更大的血管生成潜力相比,bmsc [31日]和UCMSCs [22]。这些是部分依照我们的数据。我们发现ADSCs表现出显著的优势在体外和体内血管生成促进相比UCMSC EMSC。但林等人表示一个不同的结论在研究使用四个小鼠组织派生msc,包括白色脂肪组织、骨髓、骨骼肌和心肌32]。作者发现所有四个同样msc分泌一系列proangiogenic因素和生成与ECFCs体内广泛的血管网络,得出各小鼠组织间差异没有得到在血管生成促进msc。这种差异可能是由于不同的细胞株和源用于研究。

我们观察到,所有三种类型的msc可以定位在两个capillary-like结构由ECFCs体外人工基底膜和neovessels在皮下植入人工基底膜形成的。这些结果表明,msc可能充当血管周的细胞neovessels角色提供支持。这是根据先前的研究,展示了msc可以稳定和维持血管结构体内33),与另一项研究表明msc组织祖细胞居住在靠近各种器官的微脉管系统(34]。

在这项研究中,codelivery ECFCs和msc导致不同的恢复和改善肢体的减少风险损失。这是按照动物实验的证据,在msc移植发现形成新的血管恢复缺血性四肢的血液流动(35,36]。值得注意的是,我们发现治疗ECFCs和ADSCs导致最好的预后。被认为是由于其有利的血流灌注在第七天早些时候,尽管没有观察到的差异后7天。由于广泛的细胞死亡和组织损伤可以发生在一到两周(37),有必要加快新血管形成过程尽可能早。类似的结论之前报道了皮德森et al。38和月亮et al。39]。

虽然两种机制对msc proangiogenic财产存在同时根据以前的观测,旁分泌分泌与直接分化[相比更重要24]。之前的研究和我们的发现表明,MSC-CMs有积极影响血管生成(40),可以促进ECs体外管形成。检查参与组成分泌腺,但不同tissue-derived msc是依赖于细胞的来源。因此,在这项研究中,我们分析了angiogenic-related因素的三种不同tissue-derived MSC-CMs由细胞因子抗体阵列。我们选择的因素可以澄清分成以下组:生长因子(VEGF-A, TGF-beta1, bFGF、PDGF-BB和HGF),检验和受体(ANG1、ANG2和TIE-2),基质金属蛋白酶(MMP-3, MMP-9, MMP-13)趋化因子(MCP-1和GCP-2),炎症因子(il - 10和IFN-gamma),血管生成抑制剂(血小板反应蛋白- 1的),和adipose-related因素(脂联素、瘦素、chemerin和抵抗素)。bFGF,我们的研究结果表明,VEGF-A TGF-beta1 HGF,直接促进ECs生存、增殖,迁移,都用ADSCs表示,UCMSCs, EMSCs。但ADSCs显示的最高表现。有趣的是,Arutyunyan等人发现没有可溶性VEGF-A UCMSC-CM [41),这是不符合我们的发现。周皮细胞招聘的主要细胞因子在生理血管生成,有一个争议关于PDGF-BB的表达在msc。梁等人胎盘中发现PDGF-BB表达式派生msc (24),而陈等人证明PDGF-BB不是表达msc (42]。在我们的研究中,三个msc PDGF-BB表示,在ADSCs是最高的。此外,组(而angiopoietin-2)及其受体Tie-2至关重要调节发芽血管生成(43]。也有差异表达在msc。Ang1 Ang2 EMSCs和ADSCs中高度表达。至于可溶性Tie-2碎片,也是最有ADSC-CM中发现。MMP-3、MMP-9 MMP-13中三个重要的金属蛋白酶降解ECM促进ECs发芽和入侵的44,45]。MMP-3证明是依赖于刺激的异形的细胞接触ECFCs MSC,显著减少当MSC被MSC-CM取代[46]。我们相信由msc分泌基质金属蛋白酶是一个微不足道的一部分,可能会带来不同的表达水平和细胞来源。这里,我们发现MMP-9和MMP-13 ADSC-CM中高度表达,而EMSC-CM显示MMP-3的高表达。这表明ADSCs EMSCs可能诱发更多的ECs发芽。因素,促进ECs的迁移是另一个焦点,包括GCP-2 MCP-1, HGF [47]。众所周知,MCP-1 HGF包含在检查参与组成分泌腺MSC,但分泌MCP-1和HGF UCMSCs比bmsc或ADSCs发现更密集的48,49]。MCP-1,我们的研究表明,表达GCP-2和HGF UCMSCs价格高,比EMSCs ADSCs,而GCP2和MCP-1表达UCMSCs是最高的。除了众所周知的血管生成细胞因子如VEGF和bFGF,越来越多的证据表明,许多炎症因素影响ECs迁移、扩散和管形成过程(50,51]。人类MSC HGF表达免疫抑制细胞因子,il - 10, TGF-beta1 [52),我们发现他们的表达ADSC-CM显示主要更高,只有类似UCMSC-CM HGF水平。虽然促炎细胞因子干扰素-γ也是ADSC-CM最高的表达,它是证明IFN-γ可以加强msc移植免疫抑制的HGF的表达和TGF-beta152]。这表明ADSCs可以更有效地抑制炎症反应,这可能是有益的促进血管生成。此外,作为一个强大的抑制剂ECs的扩散和迁移,在ADSCs血小板反应蛋白- 1的表达明显低于UCMSCs或EMSCs。所有这些结果共同表明ADSCs分泌更多的细胞因子直接或间接地促进血管生成。进一步的研究是在伟大的需要验证的实际功能细胞因子网络在体内的环境条件。

EC的扩散和迁移在血管生成发挥着重要作用。在我们的设置中,MSC-CMs ECFC诱导促进迁移。类似的结果已报告之前,P-MSC UC-MSC, BM-MSC厘米大大促进了人类的迁移脐静脉内皮细胞(HUVEC) [24]。此外,Arutyunyan等人还透露,UCMSC-CM有效刺激EA.hy926细胞的迁移41]。但发表的证据MSC对EC的核扩散的刺激而有争议的。在我们的实验中,三个不同MSC-CMs没有晋升ECFC的扩散。这是斯坦纳等人的支持,他们还表示,从msc厘米没有影响T17b内皮细胞系增殖(46]。也表明,骨骨髓来源要么msc EA.hy 926细胞生长没有影响(20.]。但Arutyunyan等人证明UCMSC-CM促进EA.hy926 EC线的扩散41),这是符合蔡等人使用HUVEC[报告的结果15]。有争议的结果可能是由于各种各样的细胞来源和隔离方法(36]。

此外,不同品系小鼠证明显示不同的血管生成速率和生长因子的表达53]。所以本研究的一个限制是使用不同品系小鼠的缺乏,这可能需要在未来进一步的研究。除此之外,人类组织样本的数量有限,我们使用的是另一个限制。尽管不同样本之间的结果的一致性很好,更多的组织样本进行评估仍在伟大的需要。

总之,本研究表明,msc从人类脂肪更有效比脐带和子宫内膜组织在体外和体内血管生成推广。这可能与ADSCs分泌更多proangiogenic细胞因子和更少的抑制剂,更有效地维护vascular-like结构稳定和促进ECFC迁移更有效率。因此,ADSCs可能是一个更理想的细胞来源缺血血管疾病的临床治疗。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果中包括文章和补充材料。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

我们感谢员工的妇女和儿童健康医院湖南省CITIC-XIANGYA生殖与遗传专科医院,中南大学湘雅医院,第三中南大学湘雅医院采集脐带血和人体组织样本。这项工作得到了国家高技术研究发展计划(863计划)(批准号2011 aa020113),中国科技部的科学项目的湖南省,中国(批准号2013 sk5070),和基础研究基金为中央大学中南大学(批准号2012 zzts133)。

补充材料

图S1: MSC-CMs稳定capillary-like结构由ECFCs基底膜基质。(补充材料)

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