文摘

干细胞移植是一种最有价值的方法治疗心肌梗死和脂肪干细胞(对asc)成为医学研究的热点话题。之前的研究表明,对asc可以分化成cardiomyocyte-like细胞,但效率和存活率很低。我们调查的作用和机制microRNA-1 (miR-1)对asc成cardiomyocyte-like细胞的分化。对asc和新生大鼠心肌细胞分离得到。我们构建慢病毒overexpressing miR-1和使用榫眼,Notch1通路的拮抗剂在体外分析。我们执行cocultures对asc和心肌细胞。对asc的分化效率被表面特异性抗原检测。我们的研究结果表明,miR-1能促进Notch1和减少Hes1的表达的表达,一个Notch通路因素,和超表达miR-1可以促进对asc成cardiomyocyte-like细胞的分化,调节Notch1和Hes1这可能发生。

1。介绍

心肌细胞非再生细胞扮演着重要的角色在维护组织灌注的功能。然而,在心肌ischemic-anoxia纤维疤痕修复会导致收缩性降低,导致重要器官的血供不足,心输出量减少、甚至心脏泵衰竭,这可以极大地影响心肌梗死的治疗。目前,常规治疗措施对心肌梗死,心力衰竭,心律失常被限制使用,因为心肌不完全再生。然而,使用干细胞和祖细胞在心肌梗死已被证实能促进心脏功能的重建和恢复。结果,大部分的研究都集中在寻找多功能细胞可以再生成心肌细胞,如胚胎干细胞,心脏祖细胞,内皮祖细胞,间充质干细胞(msc)。

干细胞是一种具有高度增殖的细胞,可以分化体细胞。这些细胞也可以诱导和分化成多种功能细胞来修复患病和老化的组织和器官。基于组织来源的干细胞,细胞可分为脂肪干细胞(对asc)、msc、和神经干细胞(1]。心肌细胞移植的方法包括直接注入干细胞通过静脉和心肌梗塞。然而,移植细胞的沉积在心肌不能充分控制,和营养供给也可以严重破坏2- - - - - -4]。此外,其他因素,包括缺氧环境和pH值,也可以使心脏祖细胞很难穿透和在缺血性心肌微环境中生存2]。

对asc首次分离出人类lipoplasty祖克等人在2001年。这些细胞共享相同的表型msc和multidifferentiation函数(5]。对asc是丰富和容易获得,因此,这些细胞已经成为研究焦点在许多实验室(6]。几项研究表明,对asc可以分化成cardiomyocyte-like细胞被移植到受损的心脏,可以改善心脏功能(6,7]。蔡等人用对asc DAPI-labeled coculture cardiomyocyte-like细胞数天,对asc和显示自发收缩性(7]。这些细胞也表达了肌钙蛋白i和叫蛋白质帮助修复受损的实验组中心肌、改善心肌梗死大鼠心脏衰竭状态;然而,这些细胞的分化率和维修能力在活的有机体内移植较低(7,8]。因此,它是至关重要的,提高分化效率和心肌梗死的治疗对asc的能力。

miRNA-1 (miR-1)是一个阳性microrna扮演重要角色在调节心脏发育和肌肉分化(9,10]。miR-1可以促进胚胎干细胞的分化和心脏祖细胞cardiomyocyte-like细胞和海拉细胞C2C12细胞骨架肌原性的(11- - - - - -15]。此外,老鼠miR-1逮捕的过度发展,进一步造成左心室的壁变薄,导致心脏衰竭(16]。击倒miR-1-1或miR-1-2导致心脏形态畸变,电生理传导,细胞周期调控,和其他心脏功能(17]。因此,更好地理解相关的函数和信号通路的miR-1可能重视使用干细胞和miR-1治疗缺血性心脏病。

Notch信号通路,包括切口受体、配体、和目标基因,在心肌细胞分化中扮演关键角色,传导细胞谱系18]。Notch1发挥多种功能在调节心脏细胞分化在鸡胚的形成;它不仅影响心室传导系统还控制着心脏细胞的分化19]。此外,激活Notch1可能导致心室传导畸变19]。一项研究报道,miR-34a预防血管平滑肌细胞的增殖和迁移通过调节Notch1基因表达(20.]。miR-34a较低的表达水平比控制动脉受伤。此外,过度miR-34a可以显著下调Notch1的表达,降低血管平滑肌细胞的增殖以及抑制neointima的形成在受损的股动脉(20.]。另一项研究还显示,miR-1可能促进msc分化成心肌细胞减少的表达Hes1, Notch通路目标基因(21]。尽管一些研究,心里microrna和等级之间的关系发展和心肌细胞增殖和分化有很大程度上是未知的。在这项研究中,我们调查的作用和潜在机制miR-1对asc的分化成cardiomyocyte-like细胞。

2。材料和方法

2.1。分离和对asc的文化

腹股沟脂肪垫两边雄性SD鼠(4 - 6周大)收集与1000 U / l penicillin-streptomycin D-Hanks方案(Solarbio,北京),然后洗了D-Hanks解决方案没有抗生素三次。剩下的血管肌肉组织被移除,切成1毫米×1毫米×1毫米。同等体积的0.25% EDTA胰蛋白酶补充0.1%的I型胶原酶解决方案是补充道,和样本轻轻挑动37°C孵化器瓶45分钟。同等体积的DMEM含有10%的边后卫添加结束消化。细胞被收集并在1000转离心10分钟;上层清液被除去,细胞在DMEM resuspended补充10%的边后卫。使用200 -孔筛过滤后,细胞被转移到培养皿和孵化37°C公司为5%224 h。媒介是改变每2到3天。每天使用相差显微镜观察细胞。细胞形态和增殖率记录,当细胞融合达到80 - 90%,细胞消化0.25% EDTA胰蛋白酶和亚文化为几个文化菜肴。

2.2。对asc的识别
2.2.1。表面抗原分析

细胞表面抗原CD29、CD31、CD45对asc被流式细胞术检测识别。第三,对asc第4和第5代收集和分为两组(5×105细胞每组):实验组和对照组(每组一式两份)。细胞被清洗和resuspended在500年μl PBS, 5μl (CD29、CD31或CD45抗体了。细胞在4°C的环境在黑暗中半小时,然后由PBS洗两次通过流式细胞术分析。

2.2.2。成骨诱导对asc和识别

4代细胞消化0.25% EDTA胰蛋白酶,收集,resuspended DMEM / F12培养基中含有10%的边后卫,和播种6-well盘子。孵化24 h后,介质被和一个osteogenesis-inducing解决方案是补充道。控制细胞只收到了介质。交换的媒介是3天后,细胞诱导为21天。细胞然后用PBS洗一次,固定在4%的甲醛在室温下30分钟。甲醛被免职,细胞在PBS洗一次,然后用茜素红染色为5分钟。细胞染色的解决办法是删除,然后洗了三次PBS,使用一个倒置显微镜观察和拍照。

2.2.3。脂肪形成的诱导对asc和识别

4代细胞收集和播种到6-well盘子。当细胞融合达到了100%,脂肪形成的诱导方案增加了;经过3天的孵化,媒介取代脂肪形成的诱导方案B 24 h,然后替换解决方案a,这是对四个重复周期。解决方案B添加另一个7 d的孵化,培养基是改变每一个3 d。正常的控制细胞培养。经过23天的感应,细胞受到油红O染色。PBS的细胞被清洗,然后使用一个倒置显微镜观察和拍照。

2.3。心肌细胞的分离和培养

新生儿鼠标(1 - 3 d)在75%的酒精浸泡1 - 2分钟。心脏被一个infrasternal获得小切口,然后沉浸在D-Hanks解决方案与1000 U / l penicillin-streptomycin 10分钟,然后洗两次D-Hanks解决方案没有抗生素。血凝块和纤维组织的心被移除,并且只提示部分。在寒冷的PBS三洗后,心被切成1毫米3块;接下来,添加0.25%胰蛋白酶和混合物中轻轻摇动37°C水浴10分钟。删除3分钟后,上层清液,主要含有血红细胞、坏死细胞和细胞碎片。胰蛋白酶(5 - 10毫升)补充说,混合消化在37°C 10分钟。细胞被洗下来使用稻草,沉淀之后。包含消化细胞的上清液转移到一个新的离心管中包含完整的媒介。这个过程重复了5 - 6次(每一轮约10分钟),直到组织完全消化。的细胞悬液离心10分钟,每分钟1000转,上层的移除。这些细胞被resuspended介质,然后播种到培养瓶。1 h后37°C和5%的文化有限公司2中,主要包含净化心肌细胞(CMs),温柔地转移到另一个培养瓶。24 h后文化交换的媒介是改变,每2 - 3天。

2.4。向量构造和慢病毒包装

的miR-1超表达载体构建,慢病毒穿梭质粒载体质粒和准备。高纯endotoxin-free进行质粒提取,用质粒转染293 t细胞。转染后6 h,介质被定期和交换媒介。48和72 h的文化后,细胞上清液,含有丰富的慢病毒粒子,是上层清液的收集和超速离心法进行集中的病毒。慢病毒载体含有GFP报告基因和嘌呤霉素抗性基因,因此,转染率估计可以通过观察GFP荧光和感染复数(MOI)可以估计。嘌呤霉素抗性基因是用于嘌呤霉素筛选。2对asc nd-generation被分为两个转染组:慢病毒与miR-1超表达和控制慢病毒(仅由空向量)。

2.5。慢病毒感染对asc

确定适当的莫伊,被播种到12-well板块也与2×104细胞/厘米2在每个盘子里。细胞被感染一旦他们达到50 - 70%融合。我们进行了初步测试,以确定无毒浓度聚凝胺(感染试剂),从2μ8 g / mlμ在24 h g / ml,浓度设置为5μ克/毫升。每个莫伊值(10、20、40、60和80年)在重复评估。达到适当的细胞融合后的第二天,聚凝胺的最终浓度添加到每个在5μ克/毫升,然后miR-1慢病毒添加到每个。12 h后,媒体是新媒体所取代。2天后,GFP荧光显微镜下观察,细胞数量记录在光学显微镜下。转染率估计,转染比例不同的莫伊值计算通过流式细胞术。60我建立了下面的实验。

实验分析,对asc镀在6-well盘子。中被删除和2毫升的聚凝胺混合物被添加到每个。慢病毒的股票被冰箱里取出并在37°C水浴中加热,然后加入盘子和混合细胞。经过12 h,媒介是换成新鲜的完全培养基,细胞培养在37°C。在48 h, GFP表达监控使用荧光显微镜。由嘌呤霉素筛选细胞被选中,第三和第四代细胞被收集。由qPCR miR-1表达水平检测,进行以下实验。

2.6。榫眼治疗

第四代的感染对asc分为六组:(1)Lv-miR-1-DA: DAPT-treated miR-1超表达组;(2)Lv-miR-1-DM: DMSO-treated miR-1超表达组;(3)Lv-miR-1: miR-1超表达组;(4)Lv-NC-DA: DAPT-treated控制病毒感染组;(5)Lv-NC:控制病毒感染组;对asc和(6)治疗。诺拮抗剂榫眼从Sigma-Aldrich co .)和购买使用的浓度5μ在组1和4克/毫升(22),相同剂量的DMSO组2。5天后,RNA和总蛋白收集。

2.7。试销与嘌呤霉素

确定适当的嘌呤霉素浓度实验使用,心肌细胞和对asc lentivirus-infected嘌呤霉素治疗各种浓度(1.3,1.5,1.7,1.9μg / ml)和培养7 d。每个浓度在重复检查。集中所有心肌细胞死亡是设置为实验浓度(1.7μg / ml)。

2.8。Coculture对asc和CMs

第3代对asc是分为三个治疗组:(1)Lv-miR-1-CMs:对asc感染miR-1超表达慢病毒与CMs cocultured 7天;2)Lv-miR-1:慢病毒感染miR-1超也没有coculture;对asc和(3)Lv-NC-CM:慢病毒感染控制和cocultured CMs 7天。两组的CMs补充道:一是嘌呤霉素筛选控制,另一个是积极控制myocardium-specific实验组的蛋白表达。嘌呤霉素筛选,和嘌呤霉素抗性基因的表达被确认;整个过程持续了7 d。细胞被培养在标准条件(DMEM / F12培养基的边后卫37°C的10%,5%的有限公司2)两代,蛋白质和总RNA收集。

2.9。逆转录和miR-1 qPCR化验

后总RNA分离试剂盒的方法。U6作为内部参考。正向引物用于miR-1放大5 -GGCGGTGGAATGTAAAGAAGT-3 ;U6引物的5 -CTCGCTTCGGCAGCACA-3 和反向5 -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3 。逆转录qPCR制造商的指令后进行;反应条件是95°C的10年代和40周期95°C 5 s和60°C 20年代。2−ΔCt方法被用来分析结果, 和 。

2.10。逆转录和qPCR测定GATA4 cTnI, Notch1和Hes1 mrna

总RNA孤立使用试剂盒的方法。lamv用于逆转录酶。特定的引物GATA4, cTnI、Notch1和Hes1 mrna设计和表中列出1。GATA4 qPCR工具包用于检测,cTnI, Notch1和Hes1 mRNA表达,反应进行一个罗氏LightCycler®480 II。反应是运行在一式三份β肌动蛋白作为内部参考。

表1
引物序列。
2.11。Immunofluorescent化验

细胞镀幻灯片与PBS清洗三次,各3分钟,然后在4%多聚甲醛固定了15分钟。幻灯片与PBS然后洗了三遍,每次3分钟,permeabilized 0.5% Triton x - 100(溶解在PBS)在室温下15分钟。细胞与PBS洗3次,每次3分钟。一只山羊血清阻断剂添加,幻灯片在室温下孵化了30分钟,然后用PBS为3分钟。主要的抗体(cTnI,联接蛋白43、Notch1和Jagged1)补充说,一夜之间,样本在4°C的环境。幻灯片与PBS洗3次,每次3分钟,然后用荧光二次孵化抗体在37°C 1 h。细胞被洗在PBS三次,3分钟,在一个黑暗的环境。样本与DAPI染色在PBS为15分钟,然后洗3次,每次3分钟。滤纸用于吸收剩余的液体的幻灯片,然后一个antifluorescence淬火剂添加到块幻灯片幻灯片之前被激光共焦荧光显微镜观察和拍摄使用徕卡TCS SP5 II荧光显微镜。

2.12。统计分析

数据分析使用GraphPad Prism 5.0,表示为均值±SEM的结果。学生的t以及执行时比较2值和方差分析测试时使用比较超过2样本。 和 分别被认为是统计学意义和非常重要的。

3所示。结果

3.1。ASC表型观察

对asc从腹股沟孤立从雄性SD鼠脂肪垫中描述的材料和方法。细胞形态学对asc的讲究的在体外显示菱形、多边形或纺锤形状,和细胞连接在swirl-like模式,如图1。

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图1
光学显微镜对asc的图像。(a, b)两个不同的领域对asc培养。放大,×100。
3.2。ASC识别
3.2.1之上。流式细胞术分析各种对asc代使用细胞表面抗原

通过检测我们下一步确定对asc CD29, CD31、CD45标记使用流式细胞仪。我们进行分析3 -,4 - 5代对asc(图2(一个))。流式细胞术结果显示CD29+CD31率为98.8±1.1%+率为0.8±0.5%,和CD45+率为6.3±3.1%。这些发现符合msc的细胞表面抗原表达模式。

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图2
对asc的识别。(一)细胞表面抗原检测对asc使用流式细胞术的结果。(一)对asc -控制处理PBS。(B) CD29对asc FITC-labeled。积极的率为99.8%。(C)对asc CD31PE-A标记。积极的率为0.3%。(D) CD45 PE-CY5-A对asc标记。(b)对asc成骨细胞诱导和茜素红染色。(一)控制对asc没有感应,与茜素红染色。 Magnification, ×40. (B and C) Differentiated ASCs dyed with Alizarin Red. Red mineralized nodules can be observed. Magnification, ×100 (B) and ×200 (C). (c) Adipogenic induction and Oil Red O staining of ASCs. (A) Control ASCs without induction, dyed with Oil Red O. Magnification, ×40. (B and C) Differentiated ASCs dyed with Oil Red O; cells showed red droplet formation. Magnification, ×100 (B) and ×200 (C).
3.2.2。成骨细胞诱导和观察

评估的影响成骨细胞的诱导对asc,细胞进行成骨细胞的诱导中描述的材料和方法,然后用茜素红染色,光学显微镜下观察到。相比与noninduced细胞染色茜素红、诱导细胞显示红色的形成矿化结节后成骨细胞的诱导(图2 (b)对asc)证实,可以分化成成骨细胞。

3.2.3。脂肪形成的诱导和观察

评估对asc脂肪形成的分化的影响,细胞受到脂肪形成的感应中描述的材料和方法和沾油红染色。与noninduced细胞相比,我们清楚地观察到红脂滴形成的诱导细胞(图2 (c)对asc),这表明,可以分化成脂肪细胞。这些结果说明对asc具有干细胞特性,可以被诱导分化成其他细胞系。

3.3。ASC慢病毒感染

检查对asc miR-1的潜在功能,我们首先构建了一个慢病毒表达miR-1和评估了莫伊浓度。细胞感染miRNA-1慢病毒(窝藏GFP标记) 表现出更高水平的GFP细胞感染 细胞感染,但类似的水平 (图3(一个))。因此,我们使用 为后续实验。

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图3
对asc感染microRNA-1慢病毒。(一)免疫荧光显微镜对asc GFP的感染miRNA-1慢病毒。GFP表达对asc 48 h后感染miRNA-1-expressing慢病毒在(A) ,(B) ,(C) 。(b)对asc miR-1-expressing miR-1表达水平。对asc miRNA-1表达式在4代qPCR感染miRNA-expressing慢病毒(Lv-miR-1组)或控制慢病毒(Lv-NC组)。 。
3.4。miR-1表达的检测

确认成功miR-1表达miR-1 lentivirus-infected对asc,我们qPCR执行。对asc的第四代感染miR-1-expressing慢病毒(Lv-miR-1组)和控制lentivirus-infected细胞(Lv-NC组)被qPCR收集和检查。结果证实明显高于miR-1 Lv-miR-1细胞的表达水平比Lv-NC细胞( ),如图3 (b)。

3.5。表达式Notch1和Hes1与榫眼治疗后

我们接下来检查切口的表达和Hes1 Notch1目标,在与榫眼对治疗的反应,对asc Notch通路的拮抗剂。对asc的感染miR-1-expressing慢病毒被分为三个亚组:Lv-miR-1-DA(榫眼治疗),Lv-miR-1-DM (DMSO溶液治疗),和Lv-miR-1(治疗)。对asc感染控制慢病毒被分成两个子组:Lv-NC-DA(榫眼治疗)和Lv-NC(治疗)。未对asc作为消极的控制。表示组治疗与榫眼或DMSO 7天。总蛋白质和RNA被收集,Notch1和Hes1蛋白和基因水平检测到免疫印迹和qPCR,分别如图4。

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图4
Notch1和Hes1蛋白质和基因表达水平对asc miRNA-1-expressing榫眼治疗后。对asc感染miRNA-1-expressing慢病毒与榫眼治疗7天(Lv-miR-1-DA)或DMSO (Lv-miR-1-DM)或未经处理的(Lv-miR-1)。对asc控制慢病毒感染治疗7天与榫眼(Lv-NC-DA)或未经处理的(Lv-NC)。未对asc作为消极的控制。(一)免疫印迹Notch1和Hes1蛋白质表达的结果。GAPDH作为标准化控制。(b和c)量化每个蛋白质的相对表达水平与控制。 和 由单向方差分析。(d和e) Notch1和Hes1 mRNA水平与控制。 和 由单向方差分析。

量化的免疫印迹结果显示显著增加Notch1表达式Lv-miR-1组相比Lv-NC集团( )(数据4(一)和4 (b)),这表明miR-1表达可以诱导Notch1蛋白质水平。Notch1蛋白表达水平也明显高于Lv-miR-1-DA组的价格相比Lv-NC-DA组。我们还观察到显著降低Notch1水平Lv-miR-1-DA组相比Lv-miR-1-DM集团( )。Notch1 mRNA表达水平显示类似的增加Lv-miR-1细胞相比Lv-NC集团( Lv-miR-1-DA组),并与Lv-NC-DA组相比,和Notch1 mRNA同样减少Lv-miR-1-DA组相比Lv-miR-1-DM集团( )(图4 (d))。在一起,这些结果表明,榫眼治疗导致Notch1信使rna和蛋白质水平降低和miR-1可以促进Notch1 mRNA和蛋白表达。

Hes1蛋白表达水平较低比Lv-NC Lv-miR-1细胞细胞( )和低Lv-miR-1-DA细胞与Lv-NC-DA细胞( )(图4 (c))。Hes1 mRNA水平也显著降低Lv-miR-1组比Lv-NC集团( )和Lv-miR-1-DA组相比Lv-NC-DA集团( )(图4 (e))。总之,这些结果表明,miR-1可以减少Hes1基因和蛋白的表达。

3.6。对asc miR-1对Cocultured CMs

第3代miRNA-1或控制对asc lentivirus-infected被分成治疗组如下:(1)Lv-miR-1-CMs (miR-1-expressing细胞cocultured CMs), (2) Lv-miR-1 (miR-1-expressing细胞),(3)Lv-NC-CMs(控制感染细胞cocultured CMs),和(4)Lv-NC(控制感染细胞)。对asc miRNA-1或控制慢病毒感染与CMs cocultured了7天,然后以1.7的筛选μ克/毫升的嘌呤霉素为7天。两个CM组设为对照组:一个是用作控制嘌呤霉素筛选,和其他被用作控制心肌标记蛋白表达实验小组。然后puromycin-resistant细胞培养的两代人,和总RNA和蛋白质收集评估Hes1的基因和蛋白质表达水平,Notch1, cTnI (myocardium-specific因素)和GATA4 (myocardium-specific转录因子(图)5)。

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图5
表达水平的Notch1 Hes1、cTnI GATA4蛋白质与CMs对asc coculture之后。三组第三代慢病毒(Lv)对asc来华检查如下:(1)Lv-miR-1-CMs (miRNA-1-expressing细胞cocultured CMs), (2) Lv-miR-1(对asc miRNA-1-expressing),和(3)Lv-NC-CMs(控制感染对asc cocultured与CMs)。(一)蛋白质免疫印迹分析表示。GAPDH作为标准化控制。(中)量化cTnI GATA4, Notch1和Hes1蛋白质水平,显示。(外)mRNA表达水平cTnI, GATA4, Notch1和Hes1表示。 和 。

虽然miR-1-expressing细胞(Lv-miR-1集团)显示主要缺席cTnI和GATA4蛋白表达水平,在coculture CMs (Lv-miR-1-CMs组),蛋白质含量显著增加( )(数据5 (b)和5 (c))。值得注意的是,这些蛋白的表达也显著的高于miR-1-expressing coculture集团(Lv-miR-1-CMs组)与控制细胞cocultured (Lv-NC-CMs) ( )。同样,Notch1 Lv-miR-1-CMs组蛋白表达水平也更高的价格相比Lv-miR-1组以及Lv-NC-CM组( )(图5 (d))。Hes1蛋白质表现出不同的表达模式;miR-1-expressing细胞中没有观察到变化在coculture (Lv-miR-1-CMs和Lv-miR-1组),虽然减少了表达水平检测与控制相比,Lv-miR-1-CMs Lv-NC-CM集团( )(图5 (e))。

总的来说,我们观察到类似的趋势qPCR结果与蛋白表达模式。cTnI, GATA4,切口1基因表达水平都显著高于Lv-miR-1-CM组比Lv-miR-1和Lv-NC-CM组( )(数据5 (f)- - - - - -5 (h))。与蛋白表达的结果一致,Hes1 Lv-miR-1-CM组基因表达水平低于Lv-NC-CM组( )(图5(我))。

这些数据还表明,Hes1的表达水平和Lv-miR-1-CM Notch1和Lv-NC-CM团体(coculture之后)显示与noncocultured组相比无显著差异。然而,GATA4 cTnI miRNA-1-expressing细胞表达水平调节后coculture (Lv-miR-1-CMs与Lv-miR-1细胞)相比,证明miR-1可以促进对asc成cardiomyocyte-like细胞的分化。

3.7。Immunofluorescent化验结果

我们接下来进行免疫荧光检测GATA4 Lv-miR-1-CMs, Lv-NC-CMs, Lv-miR-1细胞(图6)。与上面的结果一致,miR-1-expressing细胞(Lv-miR-1组)显示低表达GATA4(红色荧光)和coculture CMs (Lv-miR-1-CMs)导致更高数量的细胞表达GATA4。我们还发现GATA4表达式在Lv-miR-1-CM组高于Lv-NC-CM组。

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图6
免疫荧光检测对asc的myocardium-specific转录因子GATA overexpressing miRNA-1 cocultured CMs。五组的第三代慢病毒(Lv)来华对asc和/或CMs检查如下:(模拟)CMs孤独;(情况)Lv-miR-1-CMs(对asc miRNA-1-expressing cocultured与CMs);(我)Lv-NC-CMs(控制感染对asc cocultured与CMs);(mp) Lv-miR-1细胞(对asc miRNA-1-expressing);q - t)(对asc孤单。(a, e, i, m, q)合并图像;(b, f, j, n, r) DAPI荧光染色;(o c、g、k和s) GFP,指示ASC荧光标记;h (d, l, p和t)红色荧光,表明GATA4。

4所示。讨论

干细胞移植已广泛应用在治疗心肌梗死心肌再生方法,可以减少长期死亡率和减少急性心肌梗死后心力衰竭。Multipotential干细胞可以来源于脂肪组织,因为它包含丰富的msc可以快速繁殖和分化成多种细胞谱系在体外(23]。此外,小动物模型表明,移植的干细胞能够表达内皮细胞和心肌标记,它可以改善心肌梗死后心脏功能(24]。对asc可以分化成心肌细胞和血管细胞,进一步增加VEGF的表达和新血管形成25]。对asc丰富和容易获得。的移植骨髓基质细胞(bmsc)和对asc在心肌梗死后心肌可以优化抗炎细胞因子水平没有明显的炎症反应。此外,对asc可以显著改善心脏功能,减少梗死面积和显示效果比BMSC移植可以(26]。在这项研究中,我们对asc证明可以分化成msc和显示积极表达CD29和CD31和CD45的负面言论。对asc也可以诱导为成骨细胞和脂肪细胞。先前的研究表明,在体外移植的显示,分化成cardiomyocyte-like细胞低效率也大大限制的修复效果。因此,促进对ASC成cardiomyocyte-like细胞的分化率是一个关键的点改善ASC治疗对心肌梗死的影响。

microrna是一种内源性非编码小RNA的长度在18到22岁的英国石油公司。之前的研究表明,microrna在各种细胞过程扮演着重要角色,包括增殖、分化、凋亡,以及心脏分化(27,28]。microrna调节通过调节目标基因表达的信号通路29日]。先前的研究表明,miR-1可以促进老鼠和人类胚胎干细胞分化成心肌细胞后4天胚状体的分化。miR-1表达式中检测出老鼠的中胚层,促进了分子标记的表达Bry早期中胚层的多能干细胞。在6日和10日天胚状体的分化,过度miR-1增加早期心脏标记和转录因子的表达Nkx2.5 [11]。

myocardium-specific基因cTnI和myocardium-specific转录因子GATA4显示特定表达式在心肌细胞中,和他们的表达水平高于cardiomyocyte-like细胞与其他细胞系相比。GATA家族蛋白锌指蛋白转录因子显示组织表达和多个组织和流程中扮演很重要的角色,特别是在肌肉组织分化和发展。GATA4扮演重要角色在心肌分化和发展,及其表达密切相关的心肌细胞标记β肌凝蛋白重链、钙和钠和心肌肌钙蛋白的转录和表达。此外,GATA4是表示在整个老鼠心脏的发展,及其在心肌表达持续到出生(30.]。在这项研究中,对asc培养7天的心肌微环境显示较高的表达水平肌钙蛋白i和GATA4与对照组的实验组中。重要的是,我们发现超表达对ASC的miR-1 coculture条件促进了ASC分化成cardiomyocyte-like细胞水平高于控制对ASC coculture条件。对asc overexpressing miR-1(没有coculture)显示没有明显的表达cTnI GATA4。这些结果表明,miRNA-1超表达密切相关,对asc成cardiomyocyte-like细胞的分化,但具体的潜在机制是未知的。

Notch信号通路是高度保守的,在调节细胞分化中扮演多个角色,增殖和凋亡。Notch通路异常会导致多细胞生物的进化和各种人类疾病。Notch信号通路由多个配体、受体,和目标基因,包括四个同源受体(Notch1-4)和五个同源切口配体(δ(Dll) 1、δ(Dll) 3、三角洲(Dll) 4、Jaggedl,和Jagged2)在人类身上。

先前的研究已经检查了Notch信号通路的作用在MSC分化为成骨细胞,但结果一直存有争议。一个在体外研究表明,缺口中扮演双重角色诱导msc分化为成骨细胞(31日]。Notch1显示更高的msc coculture模型中的表达水平和心肌细胞在体外相比之下,msc单独培养。BMSC经历成骨分化的过程中,发现切口的调节表达,这表明Notch信号的激活可以促进骨生成,和切口在调节BMSC增殖和分化起了非常重要的作用。此外,分化msc显示Notch1表达水平显著高于增殖msc (32]。我们的研究结果表明,miR-1可能促进bmsc的分化成心肌细胞等级的差别,对这些目标基因,Hes1 [21]。

作为我们的研究结果表明,miR-1可以调节Hes1的表达和Notch1 Notch信号通路。超表达对asc的miR-1导致减少Hes1表达和增加蛋白质和Notch1的mRNA表达。即使阻止Notch1蛋白质表达的榫眼,miR-1还能够促进Notch1表达式。对asc的分化转移后,Notch1 Lv-miR-1-CMs组表达水平是高于Lv-miR-1组,这表明miR-1监管缺口pathway-related受体。这些结果表明,miR-1过度和coculture心肌细胞一起创建了一个微环境,促进了ASC分化成心肌细胞。

本研究调查了miR-1机制在调节对asc成cardiomyocyte-like细胞的分化。我们的研究结果表明,对asc可以诱导分化成cardiomyocyte-like心肌细胞微环境和表达cardiomyocyte-specific标记。miR-1超表达可能促进分化的过程,和cardiomyocyte-specific标记cTnI GATA4显示miRNA-1-overexpressing细胞表达水平要明显高于控制coculture条件。在对asc noninduced,榫眼治疗Notch1的差别导致了对这些蛋白表达;此外,Notch1 miRNA-1-overexpressing组中的表达水平高于对照组,这表明miRNA-1提升对asc Notch1的表达式。榫眼治疗没有造成Notch1通路的变化目标基因在对asc Hes1,但在miR-1过度集团Hes1表达显著下调。诱导分化后,Notch1和Hes1表达水平这些入伍前的几乎是一样的。因此,在miR-1促进干细胞分化的过程中,miR-1似乎激活通路,导致Notch1受体的增加和减少Hes1目标基因的表达,导致ASC诱导分化。Notch1和Hes1如何影响的具体机制ASC分化成心肌细胞仍然是未知的,和进一步的实验应该进行调查潜在机制。

5。结论

总之,我们的研究结果表明,miR-1能够促进对asc的分化的心肌微环境,这可能涉及Notch1-Hes1监管机制。基于这个途径的识别ASC分化,未来的研究可以检查基因超表达或沉默的使用提高分化率对ASC和增加对ASC的存活率在活的有机体内。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

本文得到了中国国家自然科学基金(81300035和81300035号),广东省合作创新和环境平台建设项目(2015 a050502049),广东省自然科学基金(2015 a030313520和2016 a020214017)、广东省中医药局研究项目(20151259),和干细胞临床研究项目广东医科大学的附属医院(2018 pssc004)。