小说磷酸钙水泥Metformin-Loaded壳聚糖对牙原性的人牙髓细胞的分化

文摘

二甲双胍是一个古老的和被广泛接受的一线药物治疗2型糖尿病。我们以前的研究表明,二甲双胍可以刺激骨的/牙原性的人为多能间充质干细胞和干细胞的分化人类牙髓细胞(dpc)。由于快速稀释二甲双胍的缺陷,本研究的目的是开发一个药物输送系统与控释二甲双胍促进细胞的生存能力和dpc支持牙质再生牙原性的分化。磷酸钙骨水泥(CPC)合成了含有壳聚糖和二甲双胍作为支架。dpc被播种到支架上,生存能力和扩散进行评估在几个时间点。对于成骨变异分析,碱性磷酸酶(ALP)活性进行了测试,细胞与茜素红染色,牙原性的标记的表达被实时聚合酶链反应评估。dpc仍然可行,附加CPC-chitosan复合支架。此外,添加二甲双胍CPC-chitosan复合不影响细胞增殖,而共产党的控制。我们的数据进一步显示,这部小说CPC-chitosan-metformin复合增强dpc的牙原性的分化,就是明证更高的高山活动,提升表达odontoblastic标记,和强大的矿物沉积。这些结果表明,新的CPC-chitosan-metformin复合是一个非常有前途的脚手架与潜在的牙本质再生组织工程应用。

1。介绍

牙髓常常是被生龋齿的感染、机械损伤,临床手术过程。传统的牙髓学的治疗感染根管治疗牙髓组织,涉及炎症纸浆的毁灭,但会减少残余的断裂韧性和infection-resistance牙齿因为营养不良的1]。牙髓再生是一种最有前途的治疗策略,这将促进pulp-dentin复杂的修复和改善病人的生活质量2]。值得注意的是,随着生物科技的进展,已经有几次试图建立新的方法来更好地控制再生牙髓学的治疗程序的参数利用组织工程策略(3]。

组织工程从根本上是基于祖细胞之间的相互作用,生物化学分子,和三维支架材料(4]。人牙髓细胞(dpc)祖细胞是一个优秀的牙质再生的细胞来源。dpc很容易收获来自捐赠者包括儿童失去了乳牙和青少年自己的智齿,否则丢弃的医疗废物(5,6]。此外,dpc能够牙原性的分化形成完成复杂的牙髓组织中(7,8]。生化因素至关重要的信号分子,指导dpc实现牙髓再生。我们以前的研究表明,二甲双胍骨的/牙原性的小分子化合物的影响通过促进人类多能干细胞的分化——(hiPSC)派生的间充质干细胞(msc)和dpc [9,10]。尽管二甲双胍是重要的dpc的分化能力增强牙原性的分化,应用二甲双胍在牙质再生有限,因为它从缺陷区域快速稀释导致低效率的组织形成(11]。因此,重要的是要实现持续局部释放二甲双胍的牙髓暴露的网站。

几项研究已经将生长因子融入了磷酸钙骨水泥(CPC) (12- - - - - -14]。然而,protein-releasing共产党的强度明显低于没有蛋白质(15]。我们之前的研究表明,增强CPC复合材料含有壳聚糖是一种有效的载体和运载工具的蛋白质(13因为壳聚糖可以提供良好的机械强度和韧性的脚手架16]。然而,到目前为止,还没有报告开发CPC-chitosan-metformin复合。因此,本研究的目的是开发一种新型CPC-chitosan-metformin复合对细胞生存能力和调查其影响,扩散,牙原性的基因的表达,矿物基质沉积。我们的研究结果将提供一个基础为未来使用CPC-chitosan-metformin复合细胞象牙质和其他组织再生疗法。

2。材料和方法

2.1。制造CPC-Chitosan-Metformin脚手架

共产党粉由tetracalcium磷酸盐[TTCP: Ca₄(PO₄)₂O)和磷酸氢钙无水(DCPA: CaHPO₄)。短暂,TTCP粉通过成立DCPA和CaCO固态反应₃(从j·t·贝克、Phillipsburg NJ),是混合并在火炉中加热(林德伯格,水城,WI)为6小时1500°C。加热混合物就熄了在室温下干燥器,然后在球磨机(Retsch PM4, Brinkman,纽约)获得粒子的5μ粒度中值。DCPA和95%乙醇在球磨机获得粉末的粒度中值1μ在1:m。TTCP DCPA和混合3摩尔比率形成中共粉。中国共产党液体含有水和壳聚糖。壳聚糖是一种天然的聚合物,通常是用作骨组织工程支架因其生物相容性、低毒性,被酶降解性(17]。首先,10、30、50μ克二甲双胍,分别溶解在水中。第二,壳聚糖乳酸盐与水混合,包含各种剂量二甲双胍和溶解在水中的壳聚糖/(壳聚糖+二甲双胍+水)质量分数15%的液体形成中国共产党。15%的质量分数,因为它使用了共产党的好强度在一项研究13]。第三,共产党膏是由混合党的无菌粉与中共液体共产党粉液比3比1的质量。粘贴被放置在一个模具直径10毫米,厚度1毫米和孵化雪茄盒24小时37°C。五组标本因此制作:(1)CPC + 0%壳聚糖(中国共产党控制)(2)CPC + 15%的壳聚糖液没有二甲双胍(CPC + CN控制)(3)CPC + 15%的壳聚糖液+ 10μg二甲双胍在每个标本(CPC + CN + 10了)(4)CPC + 15%的壳聚糖液+ 30μg二甲双胍在每个标本(CPC + CN + 30了)(5)CPC + 15%的壳聚糖液+ 50μg二甲双胍在每个标本(CPC + CN + 50会面)

2.2。二甲双胍释放支架

碳14 (¹⁴C]标记化合物常用于确定药物释放量。二甲双胍的释放是评估后我们之前的方法(18,19]。简单地说,10、30、50μ克二甲双胍(包含1/10 (¹⁴C]二甲双胍)溶解在15%壳聚糖形成了二甲双胍+壳聚糖液体。粉末和液体部分被手spatulation混合在无菌条件下。(¹⁴C] metformin-loaded支架放在24-well板包含1毫升的PBS在孵化器37°C。在每个时期,微球悬浮液的离心,PBS没有收集微球(¹⁴C)二甲双胍浓度分析。100年μL PBS被转移到包含3毫升可生物降解的闪烁管计数鸡尾酒缓冲区(费舍尔科学Inc .,匹兹堡,PA)。放射性计算了多用途闪烁计数器(贝克曼LS6500计数器、沥青、钙)。

2.3。细胞培养

dpc分离和特征如前所述20.]。牙髓组织从外植体获得临床健康牙齿的纸浆从成人第三磨牙,从个人经历拔牙矫正治疗。程序的机构审查委员会批准的马里兰大学巴尔的摩。短暂,果肉组织碎和消化的解决方案3毫克/毫升的胶原酶I型和4毫克/毫升dispase 30 - 60分钟在37°C。得到细胞悬液通过消化组织通过一个70μm细胞的过滤器。这些细胞被颗粒状和播种,在培养皿中孵化αmem补充20%的边后卫,100单位/毫升青霉素G, 100毫克/毫升链霉素和50毫克/毫升抗坏血酸(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)37°C公司5%₂。不依从细胞被移除后48 h初始镀。媒介是每三天更换一次。当主文化成为subconfluent大约1 - 2周后,细胞收集的胰蛋白酶化和亚文化在5000细胞/厘米²在生长介质。

2.4。流式细胞术分析

分析细胞表面抗原表达,细胞从第二通道被胰蛋白酶/收获EDTA治疗4分钟37°C然后用PBS洗两次。1×10⁵细胞/管共轭抗体孵育20分钟在黑暗中在冰上。细胞悬浊液洗两次,在2%的边后卫/ PBS resuspended,用流式细胞术分析细胞排序优势细胞分选仪(BD生物科学,圣何塞,CA)。数据使用流式细胞仪分析软件(FlowJo LLC、亚什兰或)。使用以下共轭抗体:STRO-1-PE(圣克鲁斯生物技术、sc - 47733,圣克鲁斯,CA), CD-29-PE (BD生物科学,猫。557332号,圣何塞,CA)、cd - 90 - pe (BD生物科学,猫。555596号),CD105-FITC (BD生物科学,猫。561443号),CD-34-PE (BD生物科学,猫。560941号),CD-45-PE(圣克鲁斯生物技术,sc - 28369), FITC-conjugated免疫球蛋白抗体(BD生物科学,猫的控制。555748号),PE-conjugated免疫球蛋白抗体(BD生物科学,猫的控制。555749号)。 Isotype control antibodies were used as negative controls.

2.5。细胞生存能力分析

dpc被播种在磁盘直径10毫米,厚度1毫米在24-well板细胞播种密度为1.5×10⁵细胞/。1和7天,细胞染色生活/死可行性分析工具包(表达载体,卡尔斯巴德,CA)如前所述[21]。细胞用PBS,其次是孵化染料。活细胞被染绿了2毫米钙黄绿素和死细胞被标记成红色和4毫米ethidium homodimer-1 (EthD-1),他们检查使用显微数字化(Eclipse TE2000-S,尼康,梅尔维尔,纽约)。活细胞和活细胞密度的百分比计算(如前所述)(21]。

2.6。细胞增殖检测

细胞增殖是由细胞计数测量Kit-8化验(CCK-8、Dojindo、东京、日本)。dpc被播种在磁盘直径10毫米,厚度1毫米在24-well板密度为1.5×10⁵细胞/好,细胞培养1、3、5、7 d在37°C和5%的公司₂。培养基被替换为新的媒介每2天。在每个时间点,共有450名μL DMEM和50μL CCK-8解决方案被添加到每个孵化2 h。孵化后,100年μL的上层清液转移到96孔板和阅读使用SpectraMax M5 450纳米板读者(分子器件、桑尼维尔CA)根据制造商的协议。至少三个独立的实验,每一个都是一式三份。

2.7。高山化验

细胞被播种密度为1.5×10⁵细胞/与共产党脚手架24-well盘子。高山活动以1 7和14 d使用一个高山工具包(Wako、东京、日本)后,制造商的指示。样本洗两次在PBS添加0.5毫升细胞裂解缓冲含有0.2% Triton x - 100 (Sigma-Aldrich)与10毫米三羟甲基氨基甲烷(pH值7.0)和液1毫米EDTA (Sigma-Aldrich)到中国共产党磁盘。他们孵化20分钟,转移到−80°C冷藏30分钟和30分钟在室温下解冻。冻融过程进行两次溶解细胞,收集所有的高山样本。最后,测试样本被转移到一个96孔板,及其活动为520 nm同时与标准样品。高山活动对细胞总蛋白浓度,计算获得(pNpp (μM / min)] /[蛋白质(mg)]。蛋白质的数量在每个样品测量由BCA蛋白质化验设备(热科学、沃尔瑟姆,MA)。高山活性测定,每个样本进行了一式三份,结果在至少三个独立重复试验。

2.8。逆转录酶聚合酶链反应(rt - PCR)和实时定量PCR (qPCR)

表达水平的牙质sialophosphoprotein (DSPP),牙本质基质蛋白1 (DMP-1) runt-related转录因子2 (Runx2)和骨钙素(OCN)的mRNA SYBR绿色实时测定一(rt - pcr)如前所述22- - - - - -24]。使用试剂盒试剂提取总RNA。定量测定RNA水平在三个独立的实验进行了一式三份。实时PCR和数据收集进行ABI棱镜7500序列检测系统。管家基因GAPDH是作为内部控制规范化不同基因的表达水平。对于每个引物组,融化曲线进行,以确保一个峰值。基因表达数据分析使用△△Ct方法。使用的引物扩增的表示基因表中列出1。

2.9。茜素红染色(ARS)的矿物合成dpc

农业研究所进行评估的矿化dpc (25]。天1和21、磁盘使用10%甲醛固定30分钟,PBS洗,沾2%茜素红S (Billerica的微孔,MA) 45分钟。量化的矿物沉积,彩色矿物溶解10% chloridemonohydrate十六烷吡啶,然后提取的污点被转移到一个96孔板。562纳米的吸光度测量使用标,如前所述[26,27]。

2.10。统计分析

执行统计分析与单向方差分析(方差分析),紧随其后的是事后LSD(最小显著差)测试使用社会科学统计软件包(SPSS 20.0)。所有数据都表示为平均值±标准偏差(SD)。Kolmogorov-Smirnov测试和列文首次确认正常执行的测试和数据的方差相等。一个 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。干细胞表型标记在初级dpc的识别

STRO-1⁺、CD29⁺,CD90⁺和CD105⁺已被证明具有间充质干细胞(MSC)属性,这些标记被用来识别dpc (28]。分析了dpc的表面标记流式细胞术。符合其他msc,大多数dpc CD34、CD45阴性。文化人口STRO-1-positive细胞含26.0%,98.3% CD29-positive细胞,99.2% CD90-positive细胞,99.7% CD105-positive细胞(图1)。这些结果表明,dpc间叶细胞的祖细胞。

3.2。二甲双胍释放Metformin-Loaded共产党脚手架

分析了metformin-CPC脚手架使用的药物释放¹⁴C]标签。最初发布概要文件显示一个典型的快速释放,达成累计释放约29.9,199.4,和505.1 ng / mL的前12 h样本包含10、30、50μ分别g(二甲双胍。然后,中国共产党继续释放二甲双胍在持续率在接下来的21天(图2)。释放量与初始加载二甲双胍的浓度。基于二甲双胍的初始破裂释放和随后连续释放,50μg二甲双胍在所有进一步的实验被选中。这些结果表明,二甲双胍释放CPC-chitosan脚手架是持续和相对持久的,以满足需求的药物载体持续2 - 3周,以刺激dpc的牙原性的分化。

3.3。生存能力和细胞增殖的dpc共产党脚手架

代表生活/死染色图片如图3(一个)。有很多活细胞染色绿色)和一些死细胞(染成红色)。细胞数量增加从第一天到第七天由于扩散。在图3 (b),活细胞的百分比在共产党控制,CPC + CN控制,和CPC + CN + 50组大于89%,没有显著不同( )。如图3 (c)随着时间的推移,活细胞密度增加由于扩散,与三组中无显著差异( )。OD值表明没有明显差异的三组细胞增殖( )(图3 (d))。总的来说,三组中没有观察到明显不同,表明二甲双胍dpc中共脚手架没有细胞毒性。

3.4。碱性磷酸酶(ALP)活性

的高山活动dpc绘制在图4。二甲双胍的除了共产党导致显著增加高山活动相比,共产党控制和CPC + CN控制。共产党的高山活动不含壳聚糖是类似于CPC + CN控制( ),表明壳聚糖的加入到中国共产党对高山活动没有影响。这些结果表明dpc + CPC +二甲双胍构造的巨大潜力是一种理想的“干cell-scaffold-small分子”牙质再生系统。

3.5。牙原性的分化

进一步调查中共的影响包含二甲双胍DPC牙原性的分化,DPC牙原性的分化在三组评估。二甲双胍显著增加odontoblastic基因的mRNA表达标记,包括DSPP DMP-1 Runx2, OCN mRNA(图5)。

3.6。矿化的dpc

接下来,我们研究了矿化结节的形成,一个索引的终端odontoblastic分化,与二甲双胍dpc经过21天的孵化。产生的矿化细胞外存款dpc支架表面如图6(一)。的染色矩阵合成骨矿物质密度和黑暗,反映了矿物合成,从第一天到21显著增加。一水氯化十六烷吡啶的数据绘制在图6 (b)。每组的矿物合成的细胞数量急剧增加从第一天至21日( )。这些结果表明,CPC + CN + 50遇到最大的骨矿物合成的细胞比其他组( )。

4所示。讨论

dpc被选为适合牙质的msc再生,主要用于治疗纸浆曝光(29日]。尽管骨髓msc成为骨组织工程的主要细胞来源(30.),骨髓捐赠是一种侵入性手术。先前的研究证明了高容量的dpc牙原性的分化和潜在完成后形成复合物,当移植到小鼠免疫功能不全的(31日]。这些细胞表现出高增殖率,巨大的分化潜力,表达间充质和胚胎干细胞标记。在目前的研究中,dpc强烈表达了MSC标记,表明dpc维持干细胞特性,可能有一个高分化的能力。

目前,组织工程的应用概念发展的生物可降解支架能够驾驶牙髓细胞迁移和分化的重点牙质再生(32]。加载支架与小分子化合物已经研究并促进组织再生组织工程文献中报道。中国共产党已越来越多地应用于牙科,颅面和骨科修复骨移植替代物(33]。然而,它的使用是有限的相对贫穷的力量属性。据报道,chitosan-based支架没有细胞毒性对各种细胞类型(34]。壳聚糖并入中国共产党能提高支架的承载能力。例如,在之前的研究中,CPC-chitosan脚手架的挠曲强度(19.5±1.4)MPa,高于中国共产党控制的(8.0±1.4)MPa没有壳聚糖(35]。此外,一些研究表明,二甲双胍的分化成骨的影响通过促进msc和preosteoblasts36,37]。因此,在我们目前的研究中,二甲双胍是添加到壳聚糖溶液,然后与共产党粉混合形成中共粘贴。发布概要文件从中国共产党在10、30、50μ每个标本显示g二甲双胍的浓度持续21天。然而,有一个小得多的数量的二甲双胍释放10μg和30μ50 g标本,相比μg标本。二甲双胍的持续释放这些标本可能是因为二甲双胍为壳聚糖的分布,而初始破裂释放可能是因为二甲双胍中共表面的绑定。此外,二甲双胍释放的生物活性是非常重要的;我们的研究结果表明,细胞生存能力在1天7天所有CPC-based相似材料。活细胞密度对所有CPC-based材料也是相似的。因此,CPC + CN和CPC + CN + 50不影响细胞增殖与共产党控制相比,这对颅面是FDA批准的维修。因此,通过比较与先前的研究结果(16),我们目前的研究显示CPC-metformin可接受的生物相容性。

确认后的二甲双胍对DPC生存能力和细胞增殖的影响,我们研究了牙原性的分化能力的细胞播种在CPC-chitosan支架和二甲双胍。高山活动通常是用作odontoblastic分化的早期标志(38),在细胞矿化起着重要的作用。在最近的研究中,中国共产党+ CN + 50遇到高山活动构造产生了显著高于中国共产党控制和CPC + CN控制。符合这一发现,更多的矿化结节也观察到在dpc培养CPC + CN + 50组牙原性的分化晚期的会面。

此外,基因表达水平相关的牙原性的基因标记,如DSPP DMP-1, Runx2, OCN测量阐明中国共产党的影响+ CN + 50遇到复合牙原性的体外分化。DSPP最初认为是dentin-specific标记。尽管一些研究也表明其表达在骨39,40),DSPP有待牙原性分化的一个重要标志。此外,DMP-1的关键调节器牙原性的分化和矿化的形成和牙质管系统(41]。此外,Runx2的矮子域基因家族,是一个关键的转录因子控制骨骼和牙齿的形成通过调节骨的/牙原性的分化(42,43]。此外,OCN可以发布成和牙质矩阵,存在,它也被用作在牙髓修复分子(44- - - - - -46]。DMP-1,在目前的研究中,DSPP Runx2, OCN mRNA水平调节与中共dpc培养+ CN + 50组。然而,没有观察到影响二甲双胍在OCN的mRNA水平的早期治疗。这些结果可能归因于这样一个事实:OCN表达在细胞矿化的后期(47]。这些结果表明,二甲双胍可以被认为是一个潜在的牙原性的生化因素分化dpc在CPC-chitosan培养支架。

然而,目前的工作具有一些局限性。二甲双胍的准确和定量控制释放支架是很困难的。周围有争议甚至well-investigated小分子,研究基于不同模型往往会产生不同的结果(48,49]。因此,进一步深入调查应该执行确定二甲双胍的机制在分子水平上牙发生刺激。此外,进一步的体内实验也应该使用动物模型演示执行象牙质和其他组织再生未来的临床应用。

5。结论

本研究首次显示,二甲双胍的合并成CPC-chitosan复合显著提高牙原性的dpc的分化,没有消极的改变细胞生存和增殖。CPC-chitosan复合支架有望成为一个温和的承载矩阵单元交付(35本质)和再生,有可能作为运载工具二甲双胍促进牙质的再生以及其他类型的组织。这些研究结果将提供重要的见解对未来使用dpc /壳聚糖/二甲双胍在牙质纸浆和其他组织工程应用程序组合。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

魏秦和陈Jia-Yao同样这项工作。

确认

这项研究是由美国国立卫生研究院/国家牙科和颅面研究所授予R01 DE023578(为)。

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