FGF-18和TGF -协同效应β3在人类脂肪中提取间充质干细胞软骨形成的颗粒文化

文摘

细胞治疗作为软骨修复的有效方法。相比之下,自体软骨细胞来源有限,脂肪干细胞(ADSCs)提出了一个有吸引力的软骨再生的细胞来源。如何驾驶chondrogenic分化ADSCs有效还有待进一步研究。TGF -β3展示了一个强大的chondrogenic ADSCs行动。最近,纤维母细胞生长因子18 (FGF-18)获得了显著的关注由于其对软骨代谢合成代谢的影响,但现有的数据有关的角色FGF-18 chondrogenic潜在的间充质干细胞(msc)是相互矛盾的。此外,是否FGF-18和TGF -的结合应用β3将改善的效率chondrogenic ADSCs尚未彻底研究的潜力。在目前的研究中,我们孤立的人类ADSCs和表面抗原的表达特点。同时,我们评估的chondrogenic潜力FGF-18 ADSCs使用在体外颗粒模型通过测量粘多糖(GAG)内容,胶原蛋白水平,组织学外观,cartilage-related基因的表达。我们发现FGF-18,类似于TGF -β3,有一个积极的影响chondrogenic分化和矩阵沉积时整个文化时期。更重要的是,我们观察到FGF-18和TGF -协同效应β3的ADSCs chondrogenic分化在体外颗粒模型。我们的研究结果提供关键信息的治疗使用的帮助下ADSCs FGF-18和TGF -β3软骨再生。

1。介绍

关节软骨是一种无血管的组织一个贫穷的再生和修复能力(1]。软骨缺陷常常引起骨关节炎的发展和顺向残疾。自体软骨细胞移植已被证明有利于治疗关节缺陷患者在过去二十年(2,3]。然而,困难的软骨细胞的扩张和倾向去分化期间延长文化导致了使用间充质干细胞(msc)作为替代软骨修复(4]。

成人msc显示高潜在增殖和multipotency和可以从各种孤立的组织如骨髓和脂肪组织(4]。自我更新的能力,人类骨骨髓来源的潜在chondrogenic msc (bmsc)已经有据可查的5]。与bmsc相比,人类脂肪干细胞(ADSCs)包含相似的特征bmsc和丰富有自己的优势,易于访问和更好的维护细胞表型在通道(6]。越来越多的证据表明,骨髓和脂肪干细胞可以促进软骨的再生;然而,潜在机制,管理他们chondrogenic潜力在很大程度上仍未知(4]。因此,它是至关重要的识别关键生长因子微环境将有选择性地促进软骨形成和软骨生产。

由于间充质凝结在软骨发展至关重要,高密度细胞颗粒模拟chondrogenic程序被开发并用于检查chondrogenic msc分化[7]。特定生长因子或生物活性分子被添加到颗粒文化系统确定msc chondrogenic分化的影响。目前,转化生长因子-的成员β(TGF -β)总科都公认为主要chondroinductive生长因子(8]。TGF -有三个成员β年代,包括TGF -β1、TGF -β2,TGF -β3,结合TGF -β然后激活受体下游分子。在这其中,TGF -β3对ADSCs chondrogenic最强的影响,显示增加基质沉积和chondrogenic分化(9,10]。

最近,纤维母细胞生长因子(fgf)及其受体发挥关键作用被发现在软骨关节软骨修复和维护11]。在这些成员,FGF-18已经获得了显著的关注由于其合成代谢影响软骨(12]。人们已经发现,FGF-18能促进软骨的发展,延缓关节软骨的退变,并刺激的效力透明关节软骨的再生13- - - - - -16]。然而,现有的数据关于FGF-18对msc的chondrogenic潜力的影响是相互矛盾的。在肢芽间充质细胞,有人建议,通过选择性地绑定FGF-18 prechondrogenic FGFR3促进分化的间充质细胞cartilage-producing软骨细胞(13]。另一方面,FGF-18表现出消极的作用在人类bmsc的软骨形成添加在程序的开始,虽然表现出一种合成代谢作用后来添加的TGF -β1 (17]。因此,chondrogenic FGF-18对ADSCs的影响仍有待进一步调查。此外,是否FGF-18和TGF -的结合应用β3将提高效率的chondrogenic ADSCs尚未彻底研究的潜力。

在目前的研究中,我们孤立的人类ADSCs和检查的主要表达标记成人msc。我们评估FGF-18的chondrogenic潜力ADSCs通过测量粘多糖(GAG)内容和ollagen数量、组织学外观,cartilage-related基因的表达。我们还确定FGF-18结合TGF -β3可以提高chondrogenic ADSCs的分化在体外颗粒模型。

2。材料和方法

2.1。细胞分离和培养

所有的脂肪组织都从三个不同的捐赠者获得知情同意(年龄55 - 75年)。伦理批准这项工作的道德委员会被授予中国人民解放军总医院第一附属医院。组织被广泛用PBS,完全切成小方块,然后用0.1%胶原酶消化(美国σ)解决方案在37°C 60分钟。然后消化组织是75年过滤后使用μm滤网(美国BD生物科学)和离心5分钟,每分钟1200转,上层的删除以及成熟的脂肪细胞。随后,颗粒细胞在DMEM resuspended LG的边后卫为10%(美国康宁公司)和培养在烧瓶孵化器有限公司为5%₂,在37°C。中了第二天,此后每3天。当细胞达到90%融合,文化使胰蛋白酶化,通过进一步两次T75文化水瓶(美国康宁公司)血压得到较好的控制。通过3 - 5细胞用于chondrogenic分化实验。

2.2。流式细胞仪细胞特征

人类ADSCs从通道3的特点是使用以下单克隆抗体流式细胞术:反CD14-PE, CD34-PE, CD45-PE, CD90-FITC, CD105-PerCP, CD166-PE (BD生物科学)。细胞用0.25%胰蛋白酶/ EDTA消化,resuspended PBS /的边后卫(1%)、计算,调整1×10的密度⁷/毫升。在每个流仪管,包含1×10整除⁶ADSCs孵化了抗体1 h在避光4°C,根据指令。消极的控制,缓冲了鼠标IgG1抗体。暂停ADSCs洗,然后分析与FACSCalibur设备(BD生物科学)。对于每一个样本,20000事件是与CellQuest获得和分析软件(BD生物科学)。细胞被认为是msc如果他们积极CD90、CD105,存在和消极CD14、CD34、CD45。

2.3。Chondrogenic球文化的分化

高密度细胞颗粒文化是用来检查chondrogenic msc分化。每个小球的制备,通过3 ~ 5人ADSCs收获和清点,整除的5×10⁵细胞在定义中旋转在300 g 10分钟15毫升聚丙烯锥形管(美国康宁公司)。基本chondrogenic培养基由DMEM补充10%的边后卫(美国康宁公司),100 nM地塞米松,其+预混料、100年的1%μ50 g / mL丙酮酸钠,μ40 g / mL L-ascorbate-2-phosphate,μpenicillin-streptomycin g / mL脯氨酸,和1%。所有试剂都是来自Sigma-Aldrich除非另有注明。球被分成4个实验小组,包括对照组,TGF -β3组(10 ng / mL), FGF-18组(100 ng / mL)和TGF -的结合β3和FGF-18组。丸是基本chondrogenic培养基培养(见上图)补充了TGF -β3(美国PeproTech)和/或FGF-18(美国PeproTech)表示时间。对照组治疗基本chondrogenic中等的价格也就是其他三组。媒介是改变每三天。

2.4。粘多糖(GAG)和DNA量化

在指定的时间点,ADSC颗粒收集和消化18 h 60°C使用125μg / mL木瓜蛋白酶解(1毫升/样本木瓜蛋白酶解),然后通过离心澄清。整除的上层清液是分开化验粘多糖(GAG)和DNA含量。呕吐在球团矿评估使用dimethylmethylene蓝色(DMMB)绑定之前分析描述18]。二百毫升水中DMMB试剂(16毫克1 L水含有3.04 g染料的甘氨酸,2.37克氯化钠,和95毫升0.1 M盐酸)被添加到50μ木瓜蛋白酶消化,L的上层清液和吸光度在525 nm立即测量。分析使用的标准曲线软骨素4-sulfate标准。从papain-digested提取的DNA样本的标准协议使用蛋白酶K和苯酚,然后确定浓度直接使用NanoDrop ND 2000(美国热科学)。DNA内容/脚手架计算时考虑样本稀释。对于粘多糖的合成活动,插科打诨的比例在每个样本归一化/ DNA。

2.5。羟脯氨酸(忧郁)测定

总胶原蛋白含量测定颗粒中羟脯氨酸含量,首先量化后5周chondrogenic归纳。羟脯氨酸(忧郁)分析是根据指令执行的商业工具(南京建成生物工程研究所、中国)。简而言之,样本与等量的6 M盐酸水解95°C 5 h。然后,水解样品冷却到室温和pH值调整为6.0 - -6.8,其次是有序的三个试剂包。之后,样本60°C孵化15分钟和离心机3500 rpm 10分钟。上层清液被用来确定在550 nm的吸光度。羟脯氨酸含量是根据公式计算中所描述的指令。胶原蛋白的总量/脚手架被羟脯氨酸的含量转化为使用羟脯氨酸胶原蛋白比之前报道的1:7.69 (19]。

2.6。RNA提取,互补脱氧核糖核酸的合成,实时PCR

总RNA提取颗粒按照制造商的指示使用试剂盒试剂(美国表达载体)。RNA隔离之前,人类ADSC丸被保存在RNAlater RNA稳定试剂chondrogenic感应5周后(美国试剂盒)。然后,RNA是reverse-transcribed cDNA使用一体化的互补脱氧核糖核酸合成SuperMix(美国Bimake)。实时PCR进行测量相对mRNA水平使用QuantStudio 5(美国应用生物系统公司)与UltraSYBR混合物(CWBIO,中国)。所有样品都以一式三份和内部控制GAPDH规范化。计算每个目标基因的表达水平QuantStudio桌面软件设计和分析。退火温度57°C,引物序列如下:胶原蛋白II (forward-5亚美大陆煤层气有限公司太极拳CTC AAC AAC CAG AT3和reverse-5CCA GTA GTC苑CTT CCA3行动X (forward-5),胶原蛋白GGC AAC AGC ATT ATG ACC C3和reverse-5得到手枪GGC CCC TGA A3),Sox-9 (forward-5侠盗猎车手CCC GCA CTT GCA CAA C3和reverse-5TTC TTC ACC广汽TTC CTC C3),aggrecan (forward-5TAC AAA公司治理文化AGA CTA CAG亚美大陆煤层气有限公司C3和reverse-5AAA GCG ACA AGA AGA GGA CA3的区域),COMP (forward-5CCC AGA AGA ACG ACG ACC AA3和reverse-5CCC答ACC ATC GCC ATC ACT3),Prg4 (forward-5TGA CGG CTA TGA TTA CTA TGC3和reverse-5AGT TGA CTC CTC CTT TGC TC3)和GAPDH (forward-5TGG CTA CAG CAA CAG GGT G3和reverse-5甘氨胆酸ATG GTG gg gg G3行动)。

2.7。组织学和免疫组织化学分析

5周后chondrogenic感应,一夜之间,人类ADSC丸被固定在4%多聚甲醛(PFA),其次是在分级脱水乙醇系列,和嵌入石蜡。标本被切成5μ米的部分。部分被苏木精和伊红染色())或阿尔新蓝和小天狼星红形象化的存在和分布粘多糖(GAG)和总胶原蛋白所描述(20.]。使用单克隆抗体进行免疫组织化学检查对II型胶原蛋白(美国Abcam)如前所述20.),细胞核被苏木精复染色。所有图片获得了光学显微镜(日本奥林巴斯)和数码相机附件(尼康、日本)。

2.8。统计分析

结果报告为±标准差。使用SPSS 17.0软件进行统计分析。邓恩单向方差分析和多重比较的测试被用来检查显著差异( )。

3所示。结果

3.1。Immunophenotypic培养ADSCs的表征

人类脂肪干细胞(ADSCs)从脂肪组织分离,随后文章3 - 5被用于我们的研究。形态、文化表现出典型的呈特性主要MSC(数据未显示)。由于间充质干细胞表达典型的表面标记,ADSCs通道3的表型特点是流式细胞术分析。在我们的研究中,间充质特征进行评估使用积极的MSC标记,CD90、CD105,和CD166 - MSC标记,CD14、CD34、CD45。正如预期的那样,MSC标记CD90、CD105和CD166在75%以上的细胞,而MSC -标记CD14、CD34、CD45观察不到5%的细胞(数字1(一)- - - - - -1 (f))。这些结果表明ADSCs我们培养维护典型表型msc和可以用来调查chondrogenic分化。

3.2。生化分析ADSC颗粒的细胞外基质

三维高密度颗粒文化是一种常用的体外软骨形成的模型。独自调查chondrogenic FGF-18潜力,结合TGF -β3,ADSCs诱导对软骨细胞颗粒文化使用基本chondrogenic中补充了TGF -β3只,FGF-18,或FGF-18和TGF -的结合应用β3指定的时间。ADSCs基本chondrogenic培养基培养被认为是消极的控制,而暴露TGF -β3被认为是一个积极的团体。定量的比较矩阵生产不同组之间随着时间的推移,粘多糖(GAG)水平和胶原蛋白含量ADSC丸被DMMB化验检查,2,3,4周和羟脯氨酸量化在5周,分别。2周后chondrogenic感应,TGF -β3显著增加呕吐在以往的生产报告(图2(一个))。值得注意的是,球团培养与FGF-18显示显著增加呕吐内容与负控制在四个不同的时间点,表明添加FGF-18整个文化时期刺激软骨形成ADSCs以及TGF -β3(图2(一个))。此外,插科打诨最高水平观察综合治疗的TGF -β表示时间点(3和FGF-18组数据2(一个)和2 (c)),这表明FGF-18和TGF -有协同效应β3 ADSCs chondrogenic分化的。每粒DNA含量的差异不显著是这些团体(图中观察到2 (b))。GAG规范化DNA高chondrogenic组含有生长因子比消极的控制,无论TGF -的存在β3、FGF-18(图2 (c))。几乎没有增加呕吐/ DNA在对照组(图2 (c))。同时,协同FGF-18和TGF -的影响β3插科打诨的生产中观察到四个不同的时间点(图2 (c))。量化的胶原蛋白含量ADSC颗粒诱导显示TGF - 5周β仅3或FGF-18增强胶原蛋白的生产与控制相比,分别(图3)。此外,TGF -β3结合FGF-18很大程度上增加了平均每丸大量的胶原蛋白,显示协同影响ADSC软骨形成(图3)。呕吐和胶原蛋白的生化评价内容表明FGF-18担任chondrogenic代理以及TGF -β3,FGF-18和TGF -β3可能提高ADSCs chondrogenic分化潜能。

3.3。组织学和免疫组织化学分析ADSC颗粒

为了评估FGF-18的行动或FGF-18和TGF -β3 ADSC chondrogenic分化,进行组织学和免疫组织化学评估来确定细胞外基质合成和沉积在小球chondrogenic分化ADSCs文化。)染色显示,颗粒大小和组织学外观没有差别在这些颗粒在5周(图4(a))。接下来,我们进行阿尔新蓝和天狼星红染色软骨蛋白聚糖胶原蛋白,分别。阿尔新蓝染色表明,蓝色的颜色增加细胞外基质的ADSC文化接触FGF-18和TGF -β(图3相对于其他文化4(b))。也显示更多GAG沉积FGF-18-treated丸与阴性对照组相比(图4(b))。5周后chondrogenic感应,天狼星红染色表明一个更强烈的染色观察胶原蛋白的信号ADSC丸接受FGF-18和TGF -β3在一起(图4(c))。我们进一步确定了II型胶原蛋白表达水平在ADSC丸培养5周的免疫组织化学分析。与组织学结果一致,更高的II型胶原蛋白表达被发现在群FGF-18和TGF -β3比其他群体(数据5(一个)- - - - - -5 (d))。还有II型胶原蛋白的表达增加颗粒文化中对待FGF-18或TGF -β3单独与-控制(数字5(一个)- - - - - -5 (c))。这些结果进一步证实FGF-18 chondrogenic财产以及TGF -β3,FGF-18结合TGF -β3大强人类ADSCs chondrogenic分化在体外颗粒模型。

3.4。基因表达变化ADSC颗粒

发现潜在的基因表达模式,软骨形成的程度被量化评估chondrocytic特异性基因,包括II型胶原蛋白(Col2a1) aggrecan, SOX-9,蛋白多糖4 (Prg4),软骨寡聚基质蛋白(COMP),和X型胶原蛋白(Col10)。chondrogenic感应5周后,实时PCR分析发现,所有这些chondrocyte-related基因更ADSC丸中高度表达的培养的生长因子(仅FGF-18, TGF -β3,或FGF-18 + TGF -β比消极的控制(3)数据6(一)- - - - - -6 (f))。单独治疗FGF-18大幅度调节chondrogenic基因表达相对于消极的控制,类似于著名的影响chondrogenic代理TGF -β3(数据6(一)- - - - - -6 (f))。没有发现显著差异表达薪酬FGF-18 + TGF -之间β3和FGF-18或TGF -β3人(图6 (e))。然而,结果显示,Col2a1 aggrecan, SOX-9, Prg4, Col10 mRNA表达FGF-18 TGF -β3-cotreated颗粒明显高于颗粒治疗FGF-18或TGF -β3,表明FGF-18和TGF -有协同效应β3在chondrogenic基因表达在体外颗粒模型(数据6(一)- - - - - -6 (d)和6 (f))。

4所示。讨论

在这项研究中,我们已经成功分离人类ADSCs和表面抗原的表达特点。我们发现FGF-18,类似于TGF -β3,有一个积极的影响chondrogenic分化以及矩阵沉积贯穿文化的时候。另外,我们观察到FGF-18和TGF -协同效应β3 ADSCs chondrogenic分化的。

人类ADSCs视为一个可选的替代细胞关节软骨修复的诊所,因为他们丰富的供应和拥有chondrogenic潜力和简单的可访问性(21]。与bmsc ADSCs显示类似的特征,但也表现出不同的特性,也就是说,细胞表面标记,在体内分化潜力,丰富(4]。在目前的研究中,我们从人类脂肪组织分离出ADSCs和分析细胞表面标记为未分化ADSCs。与前面描述的结果一致(22),我们观察到阳性细菌培养ADSC人口CD90、CD105,存在和消极CD14、CD34、CD45,表明这些ADSCs配备标准的msc可以进一步用于chondrogenic分化分析使用在体外球文化模式。

ADSC申请软骨修复的主要挑战是如何控制和方便chondrogenic分化。尽管越来越多的信息关于msc、软骨形成的机制导致ADSCs并不明确。理性的策略之一是识别关键的生长因子和概括体内环境通过使用这些生长因子改善ADSCs软骨形成。先前的研究表明,各种生长因子如TGF -β年代,igf - 1、胰岛素和最佳管理能够刺激体外软骨形成ADSCs [8,23- - - - - -25]。在我们的颗粒chondrogenic文化系统中,作为一个积极的团体,TGF -β3-treated ADSC丸也显示增加总额限制在不同的时间,提高胶原蛋白的表达,调节chondrocyte-related基因的表达后5周chondrogenic归纳。重要的是,我们的研究结果显示,FGF-18极大地调节细胞外基质的产生呕吐和胶原蛋白的生化和组织学分析评价,表明FGF-18单独补充基本chondrogenic介质能充分直接ADSCs以及TGF - chondrogenic承诺β3当现在整个分化程序。与结果一致,FGF-18提升chondrogenic肢芽的分化和软骨生产间充质细胞(13]。

有两种不同意见的角色FGF-18 MSC chondrogenic分化:一种认为FGF-18积极调节chondrogenic分化(12,13),另一个表明FGF-18负调节软骨形成(26]。我们的研究结果表明,FGF-18促进chondrogenic分化ADSCs通过增加SOX-9的表达并促进Col2a1 chondrocytic矩阵基因的表达和aggrecan ADSCs软骨形成。除此之外,FGF-18行动的时间点也是有争议的。一些报道表明FGF-9和FGF-18抑制细胞外生产或没有显著影响软骨形成的早期阶段,但发挥了合成效果当在后期添加(17,27]。与这些报告相比,我们发现FGF-18有力chondroinductive行动在msc chondrogenic介质在整个文化中。矛盾的结果可能与不同chondrogenic感应媒体(有或没有的边后卫10%)的浓度FGF-18 (100 ng / mL或10 ng / mL), ADSCs固有的差异,等等。chondrogenic培养基用于我们的研究包含10%的边后卫,这可能足以刺激增殖和生存的ADSCs颗粒文化模型和覆盖或超过ADSC增殖生长因子的影响。此外,我们推断,更高浓度的FGF-18 (100 ng / mL)也可能有更强的chondrogenic效力比以前ADSCs 10 ng / mL FGF-18 [17]。

据我们所知,本研究首先显示的增强和协同效应FGF-18结合TGF -β3 ADSCs软骨形成。当ADSC小球受到FGF-18和TGF -β3整个文化时期,更多chondrocytic标记和细胞外基质。ADSC丸cotreated与这两个生长因子显示增加呕吐积累,提高组织学外观与强烈的阿尔新蓝和小天狼星红染色信号,并增加cartilage-related基因的转录,如aggrecan Sox-9 Col2a1, Prg4。此前,一些结果还显示,胰岛素样生长因子1 (igf - 1)增强TGF -软骨形成的影响β1,TGF -的结合应用β3和BMP-2 chondrogenic分化[有协同效应23,25]。此外,它还显示,BMP-2和igf - 1能调制的增殖和chondrogenic分化ADSCs [28]。在当前的研究中,我们发现FGF-18和TGF -βADSCs 3联合效应在诱导分化为软骨细胞组织学外观和chondrogenic基因表达谱在体外颗粒模型。合作的具体分子机制需要进一步阐明在不久的将来研究。此外,是否这两种生长因子能促进软骨形成体内还有待进一步研究。

5。结论

ADSC颗粒文化的总之,我们的结果表明,FGF-18 chondroinductive行动几乎等于TGF -β3,这两个生长因子有协同影响ADSC软骨形成。因此,同时刺激ADSCs TGF -β3和FGF-18可以作为一种有用的方法协助转化研究的细胞疗法针对软骨组织再生。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这个项目的资助来自中国国家重点研究和发展计划(批准号2017 zyc1103300)和北京市自然科学基金(批准号7162187)。作者感谢秀山阴来自沈阳大学的化学教授技术修改和校对手稿。

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