层粘连蛋白521稳定人类胚胎干细胞的多能性表达式模式最初派生馈线细胞

文摘

人类胚胎干细胞(他)细胞是研究细胞早期发展的一个重要工具。前面描述的使用重组人层粘连蛋白(LN) 521代表了进步产生临床安全的文化条件。测试LN521在培养他的短期效应细胞,五男他细胞株培养人类包皮成纤维细胞(高频电炉),基底膜基质,LN521,和LN121 qPCR、免疫荧光分析,以及他们的潜力three-germ层分化。具备干细胞多能性相关基因表达的变化,和睾丸细胞在不同的段落被qPCR评估和文化条件。所有的细胞系表达多能性标记蛋白质和RNA水平,能够分化成细胞类型的三个培养后细菌层LN521九段。减少变异的多能性标记表达式可以观察到细胞培养后LN521九段。他LN521表现出更少的分化细胞培养,细胞生长更快,附件相比他LN121或人工基底膜上培养的细胞。我们的结果表明积极影响LN521在稳定多能性基因表达和可能的第一步为他细胞更可控更健壮的文化条件。

1。介绍

人类胚胎干细胞(他)细胞,诱导多能干细胞,提供一个独特的平台来研究人类的分子和细胞机制。尽管他细胞在早期发展阶段,受精后[五到八天1,2)和有可能产生的三个胚芽层,不同细胞系似乎都有不同的增殖能力和分化。他们似乎表现出不同的表达谱和更喜欢各种分化途径(3,4]。除了这些细胞line-specific档案、分化潜能已被证明是方法,甚至laboratory-dependent [5,6]。因此,新策略涉及定义良好的就业和控制培养条件需要建立健壮的他细胞分化协议。

一般来说,他对馈线细胞细胞cocultured [7),但他细胞未来的个性化医疗的使用需要xeno-free甚至理想feeder-free培养条件(8- - - - - -10]。这样的韩国帝王——和feeder-free文化条件是需要避免免疫原性,微生物或病毒污染,批次使用的可变性文化矩阵(11]。在第一个试图创建一个feeder-free文化系统,人工基底膜是一种蛋白质混合物来自小鼠肉瘤细胞,含有层粘连蛋白(LN) 111年,IV型胶原,perlecan, nidogen,以及一些未知的组件和生长因子,使用(12]。在很大程度上,这些未知的组件和基底膜基质复杂的批次变化之间的可比性他细胞实验(13]。

为了避免可变性,定义良好的文化环境,包括,例如,蛋白质纯化矩阵如LN521 xeno-free媒体相结合,旨在进一步提高了可靠性和重现性使用的各种差异化协议(8,14- - - - - -16]。最近用于人类多能干细胞定向分化成多种细胞类型,例如,肝细胞、视网膜色素上皮细胞,和多巴胺能神经元17- - - - - -19),这些文化条件可以被视为一个重要一步多能干细胞的应用在个性化医疗。

除了已经提到的优点使用LN521,减少他LN521上培养的细胞的DNA损伤与文化在老鼠馈线细胞相比,据报道后就一个通道(20.]。然而,评估涉及几个他细胞系的基因表达谱对馈线细胞生成和转移到LN521特别注重在第一通道的差异和对多能性基因表达的影响还没有被执行。

因此,在目前的研究中,我们旨在调查LN521的短期效应在不同的基因的表达,包括常见的多能性基因的表达在馈线细胞衍生他细胞系后转移到和培养LN521 9个段落。

2。材料和方法

2.1。道德

伦理批准他的推导和分化细胞株用于本研究从区域获得伦理委员会在斯德哥尔摩医嘱,454/02)。

2.2。细胞系

人类ES细胞系HS360 HS364、HS380 HS401, HS420,推导出所有核型46,XY,机械隔离six-day-old胚胎内细胞质量的。分析被证实是正常的46,XY在所有五个细胞系17-40段落对人类包皮成纤维细胞(高频电炉)。在培养他细胞LN521 (LN521-02,重组人层粘连蛋白521,# 80104,Biolamina,瑞典),LN121——(LN121-02,重组人层粘连蛋白121,测试样本Biolamina,瑞典),和基底膜基质——(康宁基底膜基质hESC-qualified矩阵,354277年,康宁,贝德福德,妈,我们)涂层板、他mitotically上培养的细胞灭活高频电炉(crl - 2429,写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)在淘汰赛(KO) DMEM培养基(KO-DMEM, 10829018,表达载体,生活技术,佩斯利,苏格兰)含20%血清KO替换(KO-SR, 10828028,表达载体),0.5% penicillin-streptomycin(15140122,表达载体),2毫米L-GlutaMAX(35050038,表达载体),1%不重要的氨基酸(11140035,表达载体),0.5毫米2-mercaptoethanol(31350010,英杰公司)和重组人成纤维细胞生长因子2在8 ng / ml (FGF2, 234 - fse / CF、研发系统,明尼阿波利斯,美国)。除了他细胞培养在DMEM高频电炉,如上所述,他上培养的细胞灭活高频电炉(crl - 2429,写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)在NutriStem介质(NutriStem hESC XF, 05 - 100 - 1 - a,生物产业以色列贝特Haemek有限公司,以色列)37°C的5%股份_2,日常中改变。细胞殖民地通过机械在四到六天的间隔。

使他细胞培养在LN521 LN121-coated盘子,LN521和LN121慢慢解冻一到两个小时在4°C和稀释1:10比包含CaCl DPBS₂和MgCl₂(DPBS^{+ +}10)的最终浓度μ克/毫升。盘子被涂上LN521或LN121 5μ克/厘米²一夜之间在4°C紧随其后的是一个小时37°C或两小时37°C根据制造商的指示。他在NutriStem培养基培养细胞(NutriStem hESC XF, 05 - 100 - 1 - a,生物产业以色列贝特Haemek有限公司,以色列)在37°C和5%的有限公司₂,日常中改变。

对Matrigel-coated盘子,执行他细胞培养基底膜基质在冰融化在一夜之间在4°C。板块与基底膜基质孵化稀释1:84在4°C NutriStem隔夜或室温1小时。

细胞是通过保持酶的使用TrypLE选择(12563011,英杰公司)每五至七天。三到四个段落之后,细胞被扩大到收集资料进行分析。

2.3。身体自发分化:胚状体的形成

在通过九,在达到融合LN521-coated盘子,他细胞被允许形式拟胚体(EBs) 24-well超低附件板(# 3473;康宁)14天在NutriStem生长因子(# 06 - 5100 - 01 - 1;生物产业)。EBs被镀LN521-coated文化板块或室幻灯片(# 354104,康宁)额外的14天。共有28天后,分化的细胞用于基因表达分析或与4%多聚甲醛固定immunocytofluorescence分析。

2.4。RNA隔离和互补脱氧核糖核酸扩增

人类胚胎干细胞收获与TrypLE选择使用酶消化。RNA进行隔离使用RNeasy工具包(# 74104、试剂盒、德国)根据制造商的协议和处理DNase (RNase-free DNase集,79254年,试剂盒)。互补脱氧核糖核酸合成使用iScript互补脱氧核糖核酸合成装备(# 170 - 8891,Bio-Rad)后,制造商的协议。

2.5。基因表达分析

2.5.1。Taqman低密度测定

比较五他细胞系,96个基因的表达进行了分析使用Taqman低密度(TLD)阵列卡(4385344,应用生物系统公司,卡尔斯巴德,92008年,美国),由国际干细胞计划设计,根据制造商的协议。与96年短暂,TLD阵列卡加载TaqMan探针同时运行。包含在96个基因标记的未分化的干细胞,多能性维护,具备干细胞和分化,六个内部控制。数据分析使用RQ-Manager 1.2软件。所有的他细胞系都运行在三个生物复制。

2.5.2。定量实时聚合酶链反应

定量PCR进行使用TaqMan普遍PCR反应混合液(# 4369016,应用生物系统)TaqMan探针(应用生物系统)根据制造商的协议(补充表1)。GAPDH是作为内部控制。

2.6。DNA隔离和核型分析

与TrypLE收割他的细胞后,DNA被隔离使用DNeasy血液和组织装备(69504年,试剂盒)根据生产的手册。Photospectrometry是用来控制DNA浓度和纯度。核型分析是在芬兰功能基因组学中心执行,芬兰Turku BACs-on-Beads技术的基础上,使用bead-bound细菌人工染色体探针,它允许执行分析只有一个低数量的DNA从整个细胞分离池,如前所述[21]。

2.7。Immunocytofluorescence分析

immunocytofluorescence和免疫荧光分析,细胞与4%多聚甲醛固定15分钟,洗了三次1×磷酸盐(PBS)和permeabilized 0.3% Triton x - 100(# 108643,默克公司、德国)PBS为十分钟。与5%驴堵塞一小时后血清(125558年,杰克逊ImmunoResearch), 1%牛血清白蛋白(BSA;001-000-162,杰克逊ImmunoResearch)和0.1%渐变20(# 655205,默克公司)1×PBS在室温下,这些细胞被孵化主要抗体抗体解决方案(BSA驴血清1%,0.1%,0.1%在PBS Tween20)在一夜之间4°C(补充表2)。第二天,细胞被洗了三次与二次抗体1×PBS和孵化(驴anti-mouse Alexa萤石488共轭(715-546-150,杰克逊ImmunoResearch)或驴anti-rabbit Cy3共轭(711-166-152,杰克逊ImmunoResearch))在抗体溶液一小时在室温下在黑暗中,然后与DAPI复染色1μ135 - 1303 g / ml (PureBlu DAPI, BioRad) 15分钟。幻灯片是可视化和图像被使用共焦显微镜(LSM700、蔡司、德国)。详细描述中使用的主要抗体研究补充表中可以找到2。

2.8。统计分析

基因表达(qPCR)计算平均值±标准偏差(SD)一式三份运行每个细胞株。表达式是归一化的表达GAPDH管家基因。单向方差分析应用于比较之间的差异五个细胞系(SigmaPlot 11.0, Sysat软件公司,加州,美国。Shapiro-Wilk测试正常后,通过使用Holm-Sidak两两进行多重比较的过程或图基的测试(SigmaPlot 11.0, Sysat软件Inc .)。差异被认为是显著的值< 0.05。

TLD数组数据规范化使用GAPDH管家基因控制,和未被发现的基因被删除。分离和比较细胞系的基因表达谱,复制的dCT方法绘制热图,分离细胞系使用层次聚类。此外,常见的表达模式进行了探讨,通过路口的基因高表达,任意定义为展示dCT < 5,以及低表达(dCT > 15)。

2.9。变异系数计算

每个基因的变异系数(CV)是通过计算SD之间的比例和所有的细胞系的平均值。基于CV值变化被分为四组:(I)高达10%,(II) 11 - 25%, (III) 26 - 50%, (IV)超过50%。

3所示。结果

3.1。异构他细胞系的基因表达水平转移到LN521

检查他的行为细胞在第一通道高频电炉feeder-free文化条件下,我们成长五男他细胞系(HS360, HS364, HS380、HS401 HS420)四个段落(p4) LN521-coated盘子。殖民地形成单层膜和持续增长加速分化(图的迹象1(一))。

确认的多功能特性五他细胞系,96个基因的基因表达分析使用TLD数组显示相似但不相同的表达谱(图1 (b)和补充表3)。在p4,所有五个细胞系表现出增强的九个基因的表达(ZFP42,TDGF1,SFRP2,PODXL,NR6A1,CD9,DNMT3B,IFITM1,LIN28),它都具备干细胞相关,并降低四种基因的表达(答,PAX4,IAPP,DDX4分化(图),这是相关的1 (c))。分析被证实是46,XY在所有5个细胞系在p4 LN521(数据没有显示)。

3.2。稳定的他多能性细胞系高频电炉和转移到LN521派生而来

多能性状态和潜在影响培养法本身的五他细胞株培养LN521测试经过长时间的文化(9个段落)。培养细胞的形态没有改变与细胞培养p4(数字1(一)和2(a))。所有五个细胞系表达一组五俗称多能性基因的蛋白质水平。免疫荧光染色显示核表达NANOG SOX2, POU5F1和细胞质SSEA4和TRA-1-60(人物的表情2(b) -2(f)和补充图1)。多能性基因表达的定量分析核,在所有5个细胞系,并没有发现显著差异表达的细胞系NANOG (98%±2%), POU5F1(98%±1%),和SOX2(99%±1%)(补充表4)。

LN521票数后,细胞分化的能力自然成三个胚芽层(星质,中间,和内胚层)在体外EBs的形成进行了测试。所有他的外胚层细胞系表达标记,中胚层和内胚层自发分化后28天(数字2(g) -2(我)和补充图2)。细胞分化为内胚层透露AFP分泌。细胞表现出表达式的TUJ1骨骼证明外胚层的细胞来源。细胞αSMA阳性蛋白表达被确定为中胚层细胞。qPCR分析证实了RNA的表达内胚层、中胚层和外胚层,以及trophoblast-related基因。GATA6,法新社,DDX4被用作内胚层的,KDR和ACTC1中胚层,NEUROD1和PAX6外胚层的标记,KRT7作为一个滋养层标记(补充图3)。

3.3。相似的多能性相关的基因的表达水平

为了调查的影响利用LN521作为他细胞培养一个矩阵,分析了由qPCR 17基因的表达。自LN521已被证明是在脱细胞基质的成人睾丸(22),我们包括标记的男性性腺的细胞分析(图3和补充表5)。当比较高频电炉上培养的细胞的基因表达谱与细胞在DMEM培养在NutriStem高频电炉,类似的表达模式观察(补充表6)。

然而,当比较他的基因表达谱的高频电炉和LN521在p4的17个基因研究中,14个基因显示超过50%的基因表达变化在高频电炉相比,11个基因LN521显示超过50%的基因表达变化。在票数LN521文化,只有7个基因(图显示超过50%的差异3)。

化的多能性基因表达在所有的五个细胞系表达变化进行对比p4和票数。在票数,两个多能性基因(NANOG和GDF3)显示的变化小于50%(34%和28%,分别地)在p4超过50%(54%和66%,resp)。POU5F1和SOX2显示减少的变化小于50%(32%和26%,分别地。)在p4不到25%(21%和20%,分别地。)票数。

探索培养他的影响细胞使用LN521矩阵在其他基因对细胞早期发育很重要,我们分析了RNA表达的基因与具备干细胞和胚芽和体细胞标记在p4和票数。节点,LEFTB,EBAF,TDGF1,UTF1,LIN28显示的一个变体p4和票数的50%以上。然而,变化的表达式LEFTB,UTF1,LIN28减少在票数p4相比(图3)。

性腺的细胞相关基因的变化表现出不同的模式表达式之间p4和票数。DDX4和明星显示没有变化表达式,而工具包,CYP11,SF1,SOX9在票数显示更少的变化。相比之下,自洽场显示更多的变化在其表达票数(图3)。

调查LN521之间的区别和其他矩阵用于细胞培养他,我们培养两个他细胞系(HS380和HS360) LN521, LN121,基底膜基质四个段落(补充数据4和5)和一个他细胞系(HS380) 9个段落LN521 LN121和七个段落为基底膜基质(补充图4)。我们观察到一个更高的发病率的分化细胞培养基底膜基质和LN121相比LN521培养。此外,他的细胞连接和较低的速度增长LN121 LN521相比。LN121 LN521之间的差异,基底膜基质与长时间的文化变得更加明显(p7 p9)相比,p4(补充图4)。

4所示。讨论

自第一隔离他细胞,在1998年,推导和建立临床安全他细胞系已被证明是一个挑战(23,24]。不完全定义的文化条件和使用异种的材料他细胞培养和扩大有限的解释和理解机制控制自我更新,多能性和分化特点。因此,可能使用人类多能干细胞在个性化医疗是有限的13]。建立更多的文化定义的条件,例如,通过使用合成矩阵将导致更好的控制条件。

建议他细胞层粘连蛋白的表达四个不同的亚型,LN521, LN121, LN511, LN111,因为他们表达α1,α5β1,β2,γ1层粘连蛋白链(9]。此外,5α链层粘连蛋白在小鼠囊胚的内细胞质量(ICM)这表明α5包含层粘连蛋白亚型的干细胞利基市场(25]。因此,我们认为LN521可能最优矩阵不仅对文化的新派生的多能干细胞还他以前派生和高频电炉上培养的细胞。他的成功和健壮的适应细胞高频电炉和培养使用LN521支线,xeno-free条件允许特征明显,越来越他细胞系可用于建立差异化协议定义。

在目前的研究中,5个XY他细胞系的表达谱,派生于高频电炉,分析了关于LN521短期后多能性文化。我们培养他细胞系(HS360, HS364, HS380、HS401 HS420) LN521 p4和票数。所有五个他细胞株生长在单层LN521-coated井,如前所述[9]。观察一个支流层五到七天内没有显示加速分化的迹象。后从高频电炉LN521和培养转移到p4,所有五个细胞系表现出正常的46,XY染色体组型。这些结果与之前的研究显示的可行性LN521作为他的矩阵xeno-free和化学定义文化系统中细胞培养(8]。然而,长期影响基因组稳定性需要进一步检查确认我们的短期结果的文化。

尽管整个多能自然的五个细胞系,为多能性和分化的基因表达的变化观察,表明细胞line-specific表达模式。然而,当比较多能性基因的表达(SOX2,NANOG,POU5F1,GDF3)之间的五个细胞系培养高频电炉和LN521 (p4),一个均质表达谱观察LN521他细胞培养。此外,随着长时间的文化(p9) LN521,基因表达变化进一步减少相比LN521 p4。不同细胞株培养之间的同质化LN521表明他更容易预测和健壮的文化条件细胞,这是有用的要求建立定向分化和细胞line-independent协议。

评估如果这种均化效应发生由于文化NutriStem LN521或变化,细胞培养基,我们培养的四个细胞系(HS360, HS364、HS380 HS401)四通道高频电炉在两个不同的媒体,在NutriStem DMEM和补充。我们的结果显示一个类似的图片变化具备干细胞多能性基因和基因的表达与细胞培养基。这表明变化对LN521 NutriStem中培养时,细胞没有明显的效果。

脱细胞基质中的表达LN521获得人类睾丸(早些时候被描述22]。因此,我们研究了潜在LN521对基因表达水平的影响在早期胚芽和体细胞,通过包含标记通常表达在人类胎儿男性性腺。我们研究了规范和相关基因的表达在人类身上出现早期原始生殖细胞的(装备,UTF1 LIN28,和DDX4)和性腺的体细胞基因相关(自洽场CYP11、SOX9,明星,SF1)以及基因表达差异的他细胞和相关节点路径(EBAF LEFTB,节点,TDGF1),在早期细胞命运起着主要的作用,包括规范生殖细胞和内胚层规范以及维护的多能干细胞的状态26]。我们的研究结果表明,LN521没有影响基因的表达水平与早期性腺的细胞,例如,对于生殖细胞规范和分化。

此外,我们发现LN521为他提供了一个更合适的基质细胞依附,基底膜基质和LN121相比增长,自我更新。长期文化的影响的详细研究他LN521和LN121相比,本研究中描述的短期文化在未来将需要确认的稳定他LN521上培养的细胞的基因表达谱。α链LN521和LN121之间的差异在文化矩阵可以解释不同影响细胞依附在他的细胞和基因表达水平。然而,正如上面提到的,这种差异的影响及其影响需要更好地理解的深入研究。

5。结论

我们的结果表明,LN521支持他细胞生长和具有积极作用维持细胞正常平衡的多能性状态。LN521导致同质化的文化基因的不同他细胞系派生高频电炉,用于这项研究。类似的表达谱不同的他细胞系可能导致更可预测,因此这些细胞不同分化的控制行为协议,可能需要使用这些细胞系再生医学领域的未来。

附加分

突出了。层粘连蛋白521提供了合适的培养条件适应馈线,xeno-free条件他馈线上培养的细胞和细胞。层粘连蛋白521有积极影响的均质化多功能基因表达谱之间他细胞系培养9个段落。层粘连蛋白521基因的表达没有明显影响雄性生殖细胞和体细胞性腺的细胞,当细胞作为他的一个矩阵的文化。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Halima Albalushi Jan-Bernd Stukenborg, Outi Hovatta构思和设计实验。Halima Albalushi,马格达莱纳库雷克,露意丝Landreh,克里斯汀Ros Kjartansdottir进行了实验。克里斯汀Ros Kjartansdottir和列夫Karlsson TLD进行化验分析。Halima Albalushi,马格达莱纳库雷克,Jan-Bernd Stukenborg,大车索德协助免疫荧光分析和解释。Halima Albalushi和Jan-Bernd Stukenborg和所有作者手稿编辑写道。

确认

作者感谢l . Antonsson博士她援助与细胞培养和Biolamina发送测试瓶LN121的实验。核型分析是在芬兰执行功能基因组学中心,图尔库,芬兰图尔库大学。作者还想感激地承认核心设施的援助因为(BEA(生物信息学和表达分析)),这是由董事会研究卡罗林斯卡医学院和研究委员会的卡罗琳斯卡大学医院。金融支持是收到Sallskapet Barnavard在斯德哥尔摩,西格德和埃尔莎Goljes今年初基金会,瑞典研究理事会/芬兰科学院Kronprinsessan Lovisas Forening Barnasjukvard / Stiftelsen Axel Tielmans Minnesfond, Samariten基金会,埃米尔och全康奈尔大学的基础。马格达莱纳库雷克财务支持的欧盟- fp7 -人- 2013之下itn 603568“Growsperm”。Halima Albalushi财务支持的资助苏丹卡布斯大学在阿曼。

补充材料

补充1。图1:免疫荧光分析NANOG、POU5F1 SOX2, SSEA4 TRA-1-60表达式,显示HS360, HS364, HS401和HS420细胞,揭示多能性标记的存在后LN521票数(红染色:NANOG POU5F1 SOX2;绿色染色:SSEA4 TRA-1-60;蓝染色:DAPI)。酒吧规模:50μm。

补充2。图2:免疫荧光分析蛋白表达的三个胚芽层(内胚层(法新社),外胚层(TUJ1)和中胚层(α- SMA))是阳性标记在HS360 HS364, HS401 HS420细胞培养后LN521自发分化。绿色染色:法新社,αSMA和TUJ1;蓝染色:DAPI。酒吧规模:50μm。

补充3。图3:QPCR分析分化相关基因的细胞系LN521:中层标记KDR ACTC1;外胚层的标记PAX6 NEUROD1;内胚层的标记GATA6,法新社和DDX4;滋养层KRT7标志。相对于的基因表达GAPDH显示之前(灰色酒吧)和之后自发分化(红条)。缩写:ND:没有检测到。

补充4。图4:比较多能性基因的RNA表达,具备干细胞相关的基因和基因表达男性性腺的细胞,他细胞培养在三个不同的矩阵(LN121, LN521和人工基底膜)。HS380差异基因表达的p4 LN121, LN521和基底膜基质,在LN121票数和LN521,在基底膜基质p7作为dCT的热图值归一化GAPDH。红色代表高基因表达(dCT低价值)和绿色代表低基因表达(高dCT值)。未被发现的(低/不表达)样本被dCT 13的价值。缩写:SD:标准差;dCT:三角洲循环阈值。

补充5。图5:比较多能性基因的RNA表达,具备干细胞相关的基因和基因表达男性性腺的细胞,他细胞培养在三个不同的矩阵(LN121, LN521和人工基底膜)。的差异表达的基因在p4 HS360 LN121, LN521和基底膜基质作为dCT价值的热图,规范化GAPDH。红色代表高基因表达(dCT低价值)和绿色代表低基因表达(高dCT值)。未被发现的(低/不表达)样本被dCT 13的价值。缩写:dCT:三角洲循环阈值。

补充6。表1:TaqMan引物的详细信息(应用生物系统公司,ThermoFisher科学)用于分析多能性相关基因的RNA表达,具备干细胞和分化,在男性性腺的细胞和基因表达。表2:详细信息的主要抗体用于分析蛋白质表达多能,中胚层,内胚层和外胚层的细胞以及免疫球蛋白作为消极的控制。

补充7。表3:数据集的dCT的平均值(±SD)的基因表达的细胞株培养LN521(4通道),规范化GAPDH。意味着dCT值(±SD)对所有基因包含在TLD数组。缩写:dCT:三角洲循环阈值;SD:标准差;TLDA: taqman低密度数组。

补充8。表4:定量分析蛋白质的多能性基因的表达(NANOG, POU5F1和SOX2)在五他培养对LN521 9行通道。没有显著区别在所有三个基因的表达。计算提出的意思(±SD)阳性细胞的数量的比例相比,细胞的总数。缩写:SD:标准差。

补充9。表5:数据集的dCT值(±SD)的基因表达的细胞株培养高频电炉,LN521 p4和LN521票数,规范化GAPDH。意思是dCT值(±SD)与qPCR所有基因进行了分析。缩写:dCT:三角洲循环阈值;SD:标准差;高频电炉:人包皮成纤维细胞。

补充10。表6:他细胞馈线上培养的细胞在DMEM p3和p4补充剂和NutriStem p4没有差异表达具备干细胞多能性基因的变异和基因有关。平均值(±SD)五个细胞系表现出相对的表达式GAPDH具备干细胞多能性基因和基因有关在男性性腺的细胞和基因表达。计算变异系数为SD /均值和线之间的变化分为四组:不到10%(绿色),11%至25%(黄色),26% - -50%(橙色)和(红色)50%以上。缩写:SD:标准差;Rel。Exp。相对表达式。

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