低压缩级提高生物合成的间充质干细胞对髓核细胞通过TRPV4-Dependent通路

文摘

间充质干细胞(MSC)的基础治疗被认为是一种很有前途的组织工程策略实现髓核(NP)再生治疗椎间盘变性(IDD)。然而,这仍然是一个挑战促进MSC的生物合成,以满足NP再生的要求。本研究的目的是优化压缩级提高细胞外基质(ECM)沉积对discogenesis msc。因此,我们构建了一个三维文化模型为msc承担7天不同大小的压缩(5%,10%,20%在1.0赫兹的频率为8小时/天)使用一个聪明的和机械的活跃的生物反应器。然后,底层转导机制的瞬时受体电位草酸4 (TRPV4)进一步探索。MSC-encapsulated混合动力车进行评估的生活/死染色,生化试验内容,实时PCR,免疫印迹,组织学和免疫组织化学分析。结果表明,震级较低压缩促进合成代谢反应,高震级压缩为3 d-cultured msc诱导分解反应。震级较低的合成效果压缩可以通过抑制TRPV4抑制。同时,激活TRPV4增强的生物合成与震级较低压缩。这些发现表明,震级较低压缩促进ECM的合成反应沉积对discogenesis 3 d-cultured msc和TRPV4通道对机械信号转导中发挥着关键作用震级较低压缩加载。 Further understanding of this mechanism may provide insights into the development of new therapies for MSC-based NP regeneration.

1。介绍

椎间盘变性(IDD)已成为一个严重的社会经济问题,近年来吸引了公众的注意。紧固的老龄化社会,越来越多的人受到背部疼痛,颈部疼痛,减少了劳动能力造成IDD [1]。然而,目前的治疗,包括卧床休息、锻炼、物理治疗,手术,只能缓解症状,但不是消除IDD的病因,不能阻止IDD的发展进展(2]。因此,人们迫切需要找到一种有效的治疗目标IDD的病因。

髓核(NP),中央水化胶状的组织的椎间盘(试管),在这个过程中扮演着核心的角色IDD [3]。变性的NP、脱水NP失去发挥试管内的液体静压力的能力。因此,生理上拉应力外环纤维化(AF)转化为nonphysiological压应力。房颤的变化将加速退化,最终导致椎间盘突出。因此,修复退化IDD NP是治疗的关键。然而,仍然没有办法修复NP因为它缺乏自我更新和自我革新的能力。因此,组织工程技术,尤其是干细胞策略更新NP,是当前研究的热点治疗IDD [4]。

近年来,研究表明,间充质干细胞(msc)领域的巨大潜力NP再生(5]。MSC显示几个优点宽量程等种子细胞来源,简单的可访问性,可定向分化的能力,这使得它的一个潜在的NP再生的理想的细胞来源。以前,我们成功建立了一个codelivery系统与TGF -右旋糖酐/明胶水凝胶β3-loaded PLGA纳米颗粒原位诱导msc discogenesis细胞(6]。Hiyama等人最近报道,MSC-based组织工程策略可以应用修复退化盘犬(7]。这些研究表明构建组织工程NP的有前景的方法。先前的研究显示,功能性组织工程NP需要实现矩阵对封装细胞沉积,这是修复光盘的基础承受机械负荷(8]。然而,MSC的生物合成是相对不足以满足需求即使我们已经证明他们可以用合适的取向诱导表达discogenesis表型(6]。因此,它是特别重要的找到有效的刺激来提高MSC的生物合成。

机械负荷是一个最有效的外部刺激,显著影响细胞的命运9]。最近的研究表明,髓核细胞的生物合成可能加强适当的大小压缩加载盘时体外培养的生物反应器(10]。王等人也发现一些关键基因的表达目标细胞外基质(ECM)可以调节与某些压缩级(11]。然而,是否机械压缩可以用于提高MSC的生物合成对discogenesis仍然是模糊的。值得注意的是,试管是承载组织在活的有机体内和机械刺激持续存在的外部身体状况。如果合适的机械负荷可以提高MSC生物合成,再生NP和随后的功能修复试管可以使用手术技术不断恢复。

在这项研究中,水凝胶的msc封装是正确discogenesis诱导与前面的3 d文化系统。的生物学效应相对宽动态压缩的大小(5 - 20%)封装msc生物反应器进行了研究使用一个聪明的和机械的活跃。本研究的总体目标是调查潜在的动态压缩的增强NP-like msc的生物合成。为了达到这个目标,我们首先评估细胞的可行性3 d-cultured msc在不同大小的动态压缩。其次,我们研究了ECM沉积剖面3 d-cultured msc在同样的机械环境。最后,我们进一步探讨其力学效应的潜在机制的生物合成msc。

2。材料和方法

2.1。制备的TGF -β3-PLGANPs

TGF -β3-loaded PLGANPs准备如前所述[6]。简单地说,10μg (TGF -β3(美国PeproTech)在0.1毫升蒸馏水溶解。此后,PLGA(美国Sigma-Aldrich 50,50)溶解在二氯甲烷(美国Sigma-Aldrich)。后来,TGF -β三是添加到PLGA溶液,在冰浴超声处理。然后,乳状液添加到1%聚乙烯醇(PVA、Sigma-Aldrich美国)水溶液与超声治疗。获得的乳液是转移到PVA水溶液和搅拌。然后,收集固体颗粒,用去离子水清洗。

2.2。隔离和鼠标msc的文化

所有的动物实验遵循当地的动物伦理委员会的指导方针(SYXK (YU), 2012 - 0012年)的第三军医大学。作为一个先前的研究(12),骨骨髓来源msc收集从6 Balb / c小鼠后安乐死。骨髓收获了脸红的股骨和胫骨完整的培养基组成的杜尔贝科修改鹰的介质(美国HyClone DMEM), 10%胎牛血清(美国Gibco的边后卫),和1%的青霉素和链霉素(美国Gibco)。使用密度梯度离心法,msc -骨髓中分离培养,在培养皿中(美国康宁公司)。收集的附着细胞被胰蛋白酶化(美国Gibco trypsin-EDTA 0.05%)后5天。每3天中被改变。

2.3。建立三维培养系统msc

4 a-peg-acr (10000 Mw, Jemkem技术,中国),氧化葡聚糖(100000兆瓦),合成了氨基改性明胶使用先前描述的过程(13]。实现的解决方案被透析膜透析(JingKeHongDa生物技术有限公司,中国)蒸馏水为每天4次消除副产品。最后,混合冻干和低温贮藏。IPN水凝胶的准备(如前所述)(14]。短暂、右旋糖酐、明胶和挂钩方案在PBS的质量比混合5:3:2实现最终的聚合物浓度的10%,而I2959(美国Sigma-Aldrich)浓度是0.1%。然后,P4 msc的密度预拌前体解决方案1×107细胞/毫升。然后,细胞聚合物混合物注入是一个圆柱形模具( 毫米,高度为1分钟= 5毫米)37°C到第一网络形式,其次是暴露在365 nm紫外线(5 W, UVATA,中国)1分钟第二网络构建。然后,cell-encapsulated水凝胶在培养皿中孵化有限公司5%₂在37°C和文化媒体每天更换一次。

2.4。聪明的设计和机械活动的生物反应器

定制的生物反应器主要由机械加载元素,文化室、循环灌注设备、生化成分监测平台,营养交换设备,和其他附件(图1(b))。机械加载轴向与集成伺服电动机应用集成在文化室。实时压缩的大小可以调整基于反馈一个中央控制器。更详细的生物反应器可以参考我们之前的研究(15]。

2.5。机械加载配置文件

机械负荷概要见图1(a)。28天的潜伏期后,梗塞部位水凝胶被转移到生物反应器进行压缩加载机械地活跃。不同大小的水凝胶被随机压缩(5%,10%,和20%)1赫兹的频率为每天8小时。压缩时间(8小时)被选择,因为它是人类的生理条件。自由膨胀水凝胶被用作控制。灌注生物反应器是用新鲜完整的文化媒体15毫升/分钟的速度促进营养供应,随后组织重构。经过7天的动态压缩,水凝胶(图加载1(c))都被转移到文化菜放松12个小时,其次是机械加载前2小时样品评估。

调节TRPV4频道活动动态压缩下,媒体补充10μM GSK205 TRPV4-selective拮抗剂或1 nM GSK101 TRPV4-selective受体激动剂(美国Sigma-Aldrich),在压缩阶段的实验小组。对照组接受相同数量的车辆(0.1 - -0.2% DMSO)在同一时间。在静态的文化,所有的样品都接受新鲜的媒体没有TRPV4拮抗剂或受体激动剂。

2.6。生活/死亡分析

细胞生存能力与不同大小的压缩与现场调查/死可行性分析工具包(美国表达载体),根据制造商的指示。短暂,混合动力车和PBS洗3次和孵化1毫升的PBS包含EthD-1 4毫米和2毫米钙黄绿素是在37°C(30分钟 )。然后,洗混合动力车是由激光扫描共聚焦显微镜(LSCM可视化。德国蔡司780)。活细胞和死细胞比率计算ImageJ软件(美国国立卫生研究所的韦恩Rasband)。

2.7。生物化学分析

每组MSC水凝胶混合冻干( )。细胞DNA含量、细胞相关粘多糖(GAG)和羟脯氨酸(忧郁)测量。双链DNA含量是决定通过Quant-iT™PicoGreen®分析工具包(美国英杰公司)按照制造商的协议。总双链DNA含量在每个样本决定从标准曲线由DNA序列稀释股票提供。总硫酸GAG内容量化使用dimethylmethylene像之前描述的那样蓝试验(16]。恶作剧的内容决定通过已知浓度的标准曲线由连续稀释的硫酸软骨素钠盐。忧郁内容根据量化方法研究改编自Blumenkrantz和Asboe-Hansen17]。忧郁的内容决定使用一个已知浓度的标准曲线的忧郁。

2.8。组织学分析

收集的标本( )冲洗两次与PBS和4%多聚甲醛中固定24 h。然后,他们被嵌入在石蜡和分组4μ米厚度。串行部分被马森沾色。

2.9。免疫组织化学分析

ECM沉积的可视化分析,收集混合动力车进入4石蜡和分组μ厚度( )。之后,应用了部分aggrecan标准免疫组织化学染色程序。aggrecan (sc - 16492 1: 400年,圣克鲁斯生物技术、美国)和山羊anti-mouse辣根peroxidase-conjugated二级抗体(美国Cwbiotech 1: 1000年,CW0102)被应用于分析。

2.10。实时PCR试验

确定感知和响应模式的msc在不同情况下的压缩,特定的基因表达式discogenesis包括aggrecan, II型胶原蛋白,Sox-9评估使用实时聚合酶链反应(rt - pcr)和GAPDH作为内部参考。MSC hydrogel-seeded混合动力车是处理试剂盒(基因工程技术有限公司、美国)和完全接地。RNA提取cDNA生成通过应用cDNA逆转录工具包(美国生活技术)和稀释到5 ng /μ分析了l .基因表达定量rt - pcr(美国应用生物系统公司7500年热费希尔科学)。计算的数据2^−ΔΔCt方法( )。在这项研究中使用的引物如表所示1。

2.11。免疫印迹分析

分化的半定量的分析进行梗塞部位通过免疫印迹水凝胶如前所述使用以下抗体稀释3% BSA在TBST缓冲:aggrecan (sc - 16492 1: 1000年,圣克鲁斯生物技术,美国),坳二世(1:5000年,ab34712 Abcam,美国),和Sox-9 (sc - 20095 1: 1000年,圣克鲁斯生物技术、美国)抗体和山羊anti-mouse辣根peroxidase-conjugated二级抗体(1:2000年,CW0102 Cwbiotech)。蛋白质水平量化和归一化微GAPDH乐队的数量一个软件(版本4.6.2、Bio-Rad )。

2.12。统计分析

所有的定量数据平均值±标准偏差。单向方差分析被用来评估结果的统计学意义团体之间通过SPSS软件(版本15.0、IBM、美国)。差异被认为是重要的时候 。

3所示。结果

3.1。细胞生存能力的封装msc IPN水凝胶在动态压缩

荧光寿命/死染色用于可视化水凝胶中细胞的生存能力。活细胞是由钙染色,产生绿色荧光。膜组成EthD-1死去的细胞,产生一个红色荧光。荧光图像的MSC水凝胶混合动力车机械接触(数据后得到2(一个)- - - - - -2 (d))。在没有压缩的混合动力车复制(免费肿胀(FS)集团)或更低的大小压缩(5%大小的压缩(5%)集团),保留细胞几乎是生活,很少能找到死细胞。然而,在混合动力车适度压缩处理(10%大小的压缩(10%)集团)或高压缩(20%大小的压缩(20%)集团),更提出了死细胞活细胞虽然仍占绝大多数。定量分析数据(图2 (e))表明,FS可行的细胞或5%的比例组显著高于10%或20%组( )。有趣的是,有FS和5%组之间无显著差异( )。DNA内容分析的数据是在良好的协议与现场试验(图/死亡2 (f))。结果表明,我们的3 d文化系统表现出良好的msc cytocompatibility和细胞生存能力缺乏压力或震级较低的压应力。相比之下,msc的可行性时拒绝接受中等或高震级的压应力。震级较低的机械环境可能有利于压缩msc。

3.2。ECM沉积在不同压应力的大小

为了研究不同的压应力大小的影响在msc封装在水凝胶的生物合成,ECM沉积被生化成分测定,定量分析了rt - pcr和免疫印迹。如数据所示3(一个)和3 (b),msc震级较低压缩处理表现出更高的呕吐( 和忧郁 FS集团)内容与展示高架ECM震级较低抗压刺激下沉积。然而,生化成分在10%或20%的大小压缩明显下降的价格相比FS集团( )。在基因转录水平,discogenesis ECM-related基因,包括aggrecan II型胶原蛋白,和Sox-9也显著调节后7天5%大小的压缩与其他三组相比(数字3 (c)- - - - - -3 (e))。与基因表达增加的大小压缩展出一个明显下降趋势和20%组不断显示最低的基因表达在所有的组。在蛋白质水平,结果类似于基因表达(数字3 (f)- - - - - -3(我))。提供的封装msc的最高表达ECM-related蛋白质当处理低最低级压缩而遭受高震级的表达式压缩。

进一步验证了组织学和免疫组织化学染色(图4)。马森的三色的染色,软骨形成胶原纤维可能是蓝染色。如图4(一),蓝色染色msc的数量和强度水凝胶也更高的群体FS和5%。压大小的增加,蓝染色细胞数量和强度逐渐降低。

aggrecan的免疫组织化学显示,类似的情况,震级较低压缩强烈提倡aggrecan沉积在封装msc。所有这些数据证明了生物合成的msc对髓核出现明显的剂量反应关系,也就是说,低强度压缩促进合成代谢,同时高强度压缩增强分解代谢。

3.3。震级较低的合成效果压缩由抑制瞬态抑制潜在香草酸受体4 (TRPV4)通道

TRPV4最近报道mechanosensitivity发挥重要作用的软骨细胞(18]。我们进一步调查的功能是否TRPV4转导有关3 d-cultured msc。梗塞部位混合动力车是动态加载的7天或高震级较低压缩,在存在和缺乏GSK205 TRPV4拮抗剂。如数据所示5(一个)和5 (b),仅GSK205暴露没有影响的插科打诨和忧郁内容FS集团( )。级低压缩处理时,loading-induced高架呕吐和忧郁的内容被GSK205(部分减毒 )。然而,GSK205没有影响下的混合动力车的生化成分高震级压缩( )。GSK205的抑制效应是通过免疫印迹分析进一步验证在蛋白质水平。结果表明,GSK205可以显著抑制合成代谢的影响震级较低压缩aggrecan和II型胶原蛋白的表达( )。然而,ECM-related蛋白表达不受GSK205 FS和20%组( ),这与上面的数据是一致的。这些结果表明3 d-cultured msc诱导合成代谢的震级较低压缩可能通过TRPV4 channel-dependent方式。

3.4。激活TRPV4增强生物合成的类似于震级较低压缩

为了探索TRPV4通道的功能生物合成的msc、MSC-encapsulated混合动力车是暴露在TRPV4兴奋剂GSK1016790A (GSK101)在动态加载。有趣的是,如图6(一)和6 (b),GSK101可以显著提高呕吐和忧郁合成混合动力车在FS集团( )。相比之下,合成效果不明显动态加载处理时,在低模的压缩和高压缩的大小( )。蛋白质含量的结果与上述结果处于良好的协议。aggrecan和II型胶原蛋白的表达显著调节GSK101 ( ),激活TRPV4的合成效果类似于震级较低的压缩。GSK101可能略上调ECM-related蛋白表达在震级较低压缩但效应不显著( )。没有明显的GSK101对蛋白表达的影响可以发现高震级压缩下的混合动力车。上述结果说明,GSK101过程类似proanabolic震级较低压缩函数通过激活TRPV4通道。

4所示。讨论

IDD的治疗由于迅速吸引了越来越多的关注越来越多的患者近年来下背部疼痛或颈部疼痛。细胞治疗策略,尤其是使用MSC作为细胞来源,显示承诺在克服NP细胞的自我更新残疾,这被认为是困难重新生成退化试管。促进discogenesis msc,效率是至关重要的发展有效的刺激诱导东方分化和生物合成。这项研究的目的是优化压缩级提高ECM msc的沉积。因此,我们研究了不同大小的生物合成作用的压应力在组织工程NP由msc和初步探讨相关机制。

在这项研究中,我们构建了3 d文化系统msc通过IPN水凝胶支架。我们之前的研究已经表明,IPN水凝胶是够抵抗压缩的极高的大小没有结构性失败(14]。与此同时,它表现出友好的封装细胞长期培养。机械强度和生物活性的优点使IPN水凝胶支架进行合适的3 d文化机械生物研究。是以前的体外仿生器官模型(10]虽然以前一样简单的单层二维细胞模型(19]。纤维环将受伤不可避免地在水凝胶注入NP腔。以前,我们的研究显示,良好的注入能力的IPN水凝胶和照明设备最小的入侵。因此,IPN hydrogel-based 3 d文化系统适用于作为细胞载体用于光盘再生体内。此外,机械活性生物反应器可以实现动态的机械负荷,更接近实际情况的试管在活的有机体内比传统的静水压力模式15]。同时,监控压缩的大小和营养成分的生物反应器减少混淆因素造成的误差。所有这些条件让我们的模型适合机械生物研究的模型。

试管在活的有机体内动态压缩在日常活动。持续的机械环境是极其重要的生物行为的NP (20.包括再生NP使用细胞疗法。如果不同的机械环境的生物效应可以理解,可以利用机械环境改变的生物植入组织工程NP的性能。一项研究表明椎间盘细胞的生物学反应动态压缩在椎间盘细胞培养和动物大小依赖在活的有机体内研究[21]。在目前的研究中,震级较低压缩对细胞生存能力影响很小而自由膨胀。然而,细胞生存能力与提高抗压模迅速减少。这种现象是在协议与我们的最近的研究表明高震级压缩会增加凋亡细胞在不成熟的NP (10]。

试管是本质上承载的性器官,NP是中央组件力学行为的试管。Aggrecan, NP的主要ECM成分之一,可以吸收水NP和保持平衡的NP的外部载荷和内部静水压力,这是NP的负载能力的行列式(22]。因此,ECM合成和分泌自然NP核心功能的细胞和组织工程的关键参数NP。显然,震级较低压缩(5%)可以改善aggrecan和II型胶原蛋白的表达MSC-encapsulated混合动力车的信使rna和蛋白质水平与自由膨胀混合。Sox-9, ECM合成的关键调节器对软骨形成(23),也大大提升了震级较低压缩。理论上,震级较低压缩有利于细胞的持续波动状态,因为压缩和放松导致泵的流体交换盘的影响矩阵(24]。水凝胶支架也是一个矩阵的保留水。这种现象在这项研究应该属性动态压缩可以使文化媒体运动的阀瓣矩阵,这是支持改善细胞生物功能研究[25]。在这项研究中,震级较低压缩不影响细胞的生存能力,但是生物合成是有效地改变了。然而,值得注意的是高压缩的大小有一个负面影响的生物合成3 d-cultured msc、IDD的病理学是一致的26]。我们之前的研究也报道,相对较高的压缩可以减少矩阵级沉积在不成熟的NP (10]。

TRPV4 Ca是一个^{2 +}首选膜离子通道,广泛参与外部物理和化学信号转导为内部生物通过细胞内钙的生成反应^{2 +}瞬变(27,28]。O 'Conor等人最近报道TRPV4-dependent机械刺激软骨细胞合成代谢反应,表明TRPV4维护起着关键作用的矩阵内稳态机械载荷作用下(18]。下的调节生物合成震级较低的压缩msc使我们假设TRPV4可能涉及转导的过程。在这项研究中,抑制TRPV4机械诱导升高ECM合成和矩阵的积累完全妥协。令人惊讶的结果表明,TRPV4 msc的机械信号转导中起着至关重要的作用,尤其是对震级较低压缩。我们还发现TRPV4激活的化学受体激动剂可能诱发类似的合成代谢影响ECM震级较低的压缩,进一步确认这些合成代谢反应通过TRPV4 msc的转导。据报道,Ca^{2 +}瞬态信号是最早的事件响应机械负荷(29日,30.]。震级较低压缩过程中MSC-encapsulated混合动力车,TRPV4可能会导致Ca^{2 +}涌入,随后转换不同的生物合成反应(图7)。然而,很困惑为什么ECM表达式压缩的高强度下没有受到TRPV4。也许,占主导地位的转导机制是不同的msc在不同大小的压缩。TRPV4通道在MSC压应力的机理还有待进一步研究。

以前,研究人员使用了生长因子或植物化学物质来提高ECM合成(30.- - - - - -32]。然而,建立一个长期控释系统是阻碍这些药物的应用程序(33]。(等人也报告说,交联密度较低的相对温和的支架也可以促进矩阵msc对软骨形成的沉积34]。但柔软的快速降解水凝胶交联密度较低可能会影响长期的效应。我们专注于机械加载由于其长期效果。最近的一项研究表明,IDD的动态固定系统治疗可能减少目标盘的机械轴承(35]。更重要的是,患者退化盘可以减少加载后的治疗在某些情况下(36]。它可以是一个有前途的战略将植入与MSC-based水凝胶和固定与精确的机械控制系统使NP再生变成现实。这项研究有一些局限性。骨髓间充质机械负荷小鼠的生物学反应可能是不同的智人虽然最近的一项研究表明类似的效果在机械负荷(37]。另一个限制是,msc的状态在体外可能是不同的吗在活的有机体内因为NP的微环境在活的有机体内高酸度和低营养的供给。在将来,一个在活的有机体内研究应该进行探讨msc的机械生物机制水凝胶注入在直立的动物。

5。结论

总之,在这项研究中,我们调查了ECM MSC-encapsulated生物合成的水凝胶三维培养系统在不同大小压缩机械地使用一个聪明和活跃的生物反应器。这项研究的结果表明,骨髓间充质动态压缩级的生物合成相关的。震级较低压缩促进ECM的合成反应沉积对discogenesis在高震级压缩为3 d-cultured msc诱导分解反应。转导通路的研究进一步揭示了深刻的影响,TRPV4频道在机械信号传导中扮演着重要角色的震级较低压缩加载。进一步了解这个机制可以提供洞察MSC-based NP再生的新疗法的发展。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢雪杨优秀的技术支持。本研究由国家自然科学基金委的资助(批准号81272029和81272029),中国军事物流的关键项目(BWS13C014-1)和关键项目的军事医学科技创新项目(SWH2016JSZD-01和SWH2017JCZD-02)。

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