文摘

在骨间充质基质细胞(msc)存在于骨髓基质(BM-MSC)和骨内膜的利基,作为细胞密质骨(CB-MSCs)。本研究孤立和特征异构MSC数量从每个细分市场,随后调查广泛的细胞扩张的影响,分析人口倍增(PDs) /细胞衰老,克隆形成效率(cf), MSC细胞标记表达式和成骨的/脂肪形成的分化。CB-MSCs BM-MSCs证明相似的形态和PDs,达到100 PDs。两个种群表现出一致的端粒长度(12 - 17 kb),最小的衰老,和积极的端粒酶表达。CB-MSCs (PD15)显著低于PD50 cf。CB-MSCs和BM-MSCs都表达了MSC (CD73 / CD90 / CD105);胚胎(Nanog)和成骨的标记(Runx2,骨钙素)但没有造血标记(CD45)。CB-MSCs (PD15)强烈Oct4和p16表达^INK4A。在早期PDs, CB-MSCs拥有强大的成骨的能力和低脂肪形成力量,同时BM-MSCs拥有更大的骨生成总体两性和脂肪生成。PD50, CB-MSCs证明效力骨生成和减少脂肪生成,相比在等效PDs BM-MSCs。这项研究表明在增殖和间充质细胞特征相似性CB-MSCs BM-MSCs,但对比multipotentiality。这些发现支持进一步比较人类CB-MSCs BM-MSCs,便于选择最佳MSC人口再生医学的目的。

1。介绍

骨髓腔包含的丰富来源间充质基质细胞(BM-MSCs)。这些msc可以被视为一种不同类型的基质祖细胞的自我更新和分化能力定义为血统间充质来源,如骨骼、脂肪和其他各种胶原结缔组织(1,2]。因此,BM-MSCs高度被认为是为应用程序提供巨大的潜力在干细胞修复和再生疗法3),尤其是对骨骼本身。他们也经常用于开发在体外疾病进展的模型和监测治疗效率加速各种临床结果(4- - - - - -7]。

BM-MSCs描述了两个截然不同的细分市场内的骨内环境,即血管周的利基围绕正弦内皮细胞和周围的骨内膜的利基集中preosteoblasts和bone-lining细胞的成骨细胞8]。通过信息联系,两个细分市场提供一个角色的BM-MSCs支持造血细胞的活动,除了促进骨重建和修复,是否为应激裂隙或重大伤害引起骨折(8]。此外,在这两个领域,孤立的msc代表不同种类的人群,通常形成脂肪细胞的祖细胞和成骨细胞分化平衡支持骨对骨修复成功很重要。事实上,失调对脂肪生成与一些病态的骨重塑过程中减弱骨骼在肥胖、骨量减少,骨质疏松症(9]。克隆分析BM-MSCs已经确定细胞群,被描述为高度增殖的细胞,能够形成菌落,并具有多能——与较低的细胞群克隆形成效率,更限制他们的血统潜力(10,11]。这种理解协议用于隔离BM-MSCs后果,是否用于细胞疗法在体外细胞模型,细胞群与定义的特点是可取的。对于大多数组织的msc组织如骨骼、细胞群可以被视为异类包含“不成熟”高度增殖multipotential细胞,随着lineage-committed与较慢的增殖能力和分化细胞采样个体之间有很大的差异(3,12]。隔离后,细胞总是扩大在体外获得足够数量。这可能导致进一步的变化在异构的msc,这极有可能影响到一系列的细胞行为,如多能——功效的分化,增殖,迁移,和免疫抑制12]。然而,尽管巨大的变化在隔离程序确定临床翻译的一个主要障碍,很少有研究相比隔离技术和细胞的描述种群扩张。

经典,msc与人类和啮齿动物的骨髓组织,通过操纵他们的独特的能力,扩大在文化后坚持塑料表面,作为显示一个潜在的技术减少coculture造血细胞(13]。然而,塑料坚持本身的属性是不够的隔离msc由于存在丰富的造血细胞,内皮细胞,granulomonocytic细胞早期和后期报告的亚文化。频繁,骨髓基质细胞被分离在密度梯度溶液,如聚蔗糖™,提高净化策略,其次是低密度电镀方法(14,15]。从初步研究孤立从表皮干细胞的数量16),最近的研究也已成功隔离的异构从骨髓MSC的人群,牙髓,口腔黏膜,凭借这些成人干细胞表现出高的表面α₅β₁整合素的表达,促进快速粘附fibronectin-coated文化板块,提供更便利的选择从造血和内皮细胞类型出现在这个组织17- - - - - -20.]。骨移植技术的日益发展和骨骼组织修复,寻找潜在的MSC候选人与特定pro-osteoinductive和pro-osteoconductive能力直接来源于骨内膜的利基被描述为有前途的应用程序在骨修复治疗。在这种临床目的,最近的研究已经成功地进行了隔离的msc鼠标密质骨外植体,表明这种方法作为替代的潜在应用提供msc和骨修复疗法在体外细胞行为的模型(21- - - - - -23]。

本研究提出了数据比较孤立,扩张,并描述不同的老鼠从骨髓msc,密质骨外植体。注意给出比较每个净化方法的效率通过分析细胞增殖能力,维护间充质基质/干细胞特征,后向成骨、脂肪形成的血统和分化潜能,丰富的文化在体外。成功的隔离、扩张和描述这些msc透露,骨髓和密质骨提供潜在的两个对比在体外细胞模型的区别在于其分化能力。因此给出的结果提供了一个初始描述相关的不同的异构特性MSC人口从每个细分市场,这是有价值的在考虑适当的隔离和扩张协议在研究设计和提供一个初始可行性评估的潜在使用每个基质细胞群为未来的干细胞疗法的发展。

2。材料和方法

骨股骨收获来自28-day-old雄性Wistar鼠,牺牲按照守则的人道的杀害动物,在第一级的动物(科学过程)法案,1986年。解剖之前,动物被浸泡在70%的酒精消毒。

2.1。隔离和BM-MSCs从骨髓的文化

Six-well盘子被涂上一层1毫升/ 10μg / ml人血浆纤连蛋白(Sigma-Aldrich,普尔,英国),重组+ PBS(钙磷酸盐,补充了1毫米^{2 +}和1毫米毫克^{2 +}),24 h在4°C。股骨和肱骨无菌解剖,清洗所有的结缔组织,并收集冰在10毫升绝缘介质(IM),αMEM核糖核苷和脱氧核苷(ThermoFisher科学,佩斯利,英国),补充10% antibiotic-antimycotic (Sigma-Aldrich)。骨髓细胞收集由各长骨冲洗10毫升的完全培养基(CCM),包含αMEM heat-inactivated 20%胎牛血清(的边后卫,ThermoFisher科学),1% antibiotic-antimycotic, 100μm L-ascorbic酸2-phosphate (Sigma-Aldrich),透过70μ尼龙细胞过滤器进t - 75组织培养瓶(他一一Bio-One国际、Kremsmunster、奥地利)。细胞培养在37°C, 5%的公司₂,不依从细胞24小时后被改变的媒介。3天,细胞使用StemPro检索®Accutase®(ThermoFisher科学)和统计。优先选择不成熟的msc表达高水平的细胞表面β1整合蛋白,细胞被播种在4000细胞/厘米²1毫升的血清CCM到每个fibronectin-coated板,后立即删除PBS。20分钟后孵化在37°C,不依从细胞被洗了PBS。贴壁细胞培养在CCM 37°C, 5%的公司₂。培养基是改变每2 - 3天。

2.2。隔离和鼠骨片外植体CB-MSCs文化

从上面的长骨残余恢复骨干是切成1 - 3毫米²骨芯片和消化与温和搅拌3毫克/毫升胶原酶II (Sigma-Aldrich)αMEM 2 h在37°C。消化介质和释放细胞被移除,骨片和5毫升CCM洗了三次。消化骨芯片被孵化与CCM 37°C, 5%的公司₂。3天,骨头芯片和不依从细胞被洗PBS和丢弃剩余的贴壁细胞培养以允许集落形成和扩张。12天后,CB-MSCs收获使用StemPro Accutase(0)通过计算,然后在4000细胞/厘米²格林尼T-25培养瓶(Bio-One国际)。培养基是改变每2 - 3天。

2.3。组织学检查

在隔离过程中,组织样本的骨头被冲洗掉之前的骨髓组织和合成胶原酶治疗前后骨芯片。样本去除矿物质在10%甲酸,72 h,然后通过一个提升的浓度醇脱水,这是之前清除与二甲苯在石蜡包埋。五μ部分被削减,安装到poly-L-lysine-coated玻片(ThermoFisher科学),干一夜之间60°C,然后用苏木精和伊红染色。彩色部分安装使用DPX胶(Raymond羊羔,东苏塞克斯,英国),使用光学显微镜观察之前,与数字图像捕获。

2.4。评估人口翻倍的水平

在confluency达到70 - 80%,测定细胞通路和细胞数量。人口增加一倍(PD)价值评估的原始细胞的数量比例的使用公式:

累积PD在文化和执行策划与时间重复每个隔离程序。

2.5。细胞形态分析

细胞形态是定期检查整个文化持续时间由光学显微镜。此外,细胞PD15、PD50 PD100养殖密度4000细胞/厘米²24小时的玻璃室幻灯片(BD生物科学,牛津大学,英国)在固定4% (v/v)多聚甲醛溶液和permeabilisation 200μl / 0.1% Triton-X100 (Sigma-Aldrich), 30分钟。细胞与200年被封锁μl / 1%牛血清白蛋白(BSA, ThermoFisher科学)Tris-buffered盐水(1% BSA-TBS),在室温下1 h,肌动蛋白细胞骨架染色了20μg phalloidin-FITC ml /毫升(Sigma-Aldrich), 1% BSA-TBS和孵化1 h在4°C在黑暗中。使用Vectashield细胞玻片上的安装®安装介质与DAPI(向量实验室有限公司,彼得伯勒、英国),使用紫外(UV)和图像捕获显微镜。

2.6。克隆形成

细胞被播种密度100细胞/好6-well板和培养一段12天。视觉观察进行每24 h,殖民地的32个细胞或多个记录。

2.7。SA -β牛乳糖染色细胞衰老

分析了细胞衰老的存在senescence-associated——(SA)β牛乳糖染色使用工具包衰老细胞组织化学染色(Sigma-Aldrich),根据制造商的指示。细胞被光学显微镜,平均中阳性细胞百分比计算从5随机字段的视图(30μ米²)。

2.8。端粒长度的决心

细胞培养密度1×10⁴细胞/厘米²治疗前80%的融合,蛋白酶K,与DNEasy净化血液和组织工具包(试剂盒,克劳利,英国)。纯化的DNA是运行在0.8% (w/v)琼脂糖凝胶和南部涂抹到尼龙膜根据制造商的指示TeloTAGGG端粒长度分析工具包(罗氏,韦林花园城,英国)。

2.9。逆转录聚合酶链反应

总RNA提取使用RNeasy®迷你工具包和QIAShredder(试剂盒有限公司,克劳利,英国)。RNA纯度和数量在260 nm / 280 nm吸光度测定。互补脱氧核糖核酸合成从使用5 500 ng的总RNAμl 5 x Moloney小鼠白血病病毒(M-MLV)缓冲区,0.5μ0.625 g随机引物μl RNasin, 1.25μl deoxynucleotide三磷酸腺苷(核苷酸;10毫米),1μ15 l M-MLV逆转录酶,重组μl DNase-free水(所有Promega,南安普顿,英国总量25μ在37°C l), 1 h,紧随其后的是95°C的5分钟。

互补脱氧核糖核酸合成从500 ng使用1的总RNAμl随机引物(Promega)添加到RNAase-free水最后一卷15μl。样品在70°C运行5分钟。RT反应制备混合,包含5μl 5×Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV)反应缓冲区,3.4μl 10毫米核苷酸,0.6μl RNasin和1μl MMLV逆转录酶,15μl的随机引物/ RNA组合和重组到25μl DNase-free水(所有Promega)和执行在37°C thermocycler 1 h。混合反应-信使rna制备负控制。PCR是使用1执行μ5 l cDNA和反应试剂μl 5×缓冲区,0.5μl 10毫米核苷酸,1.25μl 10μ正向和反向引物(如表所示1英国南安普顿,引物设计有限公司),1μl 25毫米氯化镁,0.25μ25 l聚合酶,重组μl /反应RNAase-free水(Promega)。β肌动蛋白是用作看家基因。thermocycler反应进行,与最初的变性步骤94°C的5分钟,其次是35周期的1分钟,94°C的变性一步30年代,55°C退火步骤30年代,72°C扩展一步,最终72°C扩展步骤7分钟。相同的条件适用于所有引物对Nanog例外,Oct4、CD73 CD105,曾经的退火温度52°C,和骨钙素使用退火温度为62°C。产品分离用2%琼脂糖凝胶和紫外线照射下。图像捕获使用数量一个图像分析软件(Bio-Rad,赫默尔亨普斯特德,英国)。

2.10。存在分析

互补脱氧核糖核酸是如上所述生成和稀释1:5 RNAase-free水。每一个存在的反应是使用2.5执行μl和3μ引物(正向和反向,见下表1),5μl稀释cDNA样本,10μl SYBR绿色精度存在主混合(引物设计有限公司)。所有的样本分析一式三份,在明亮的白色96 -孔板(引物设计有限公司),使用ABI棱镜7000序列检测系统和ABI棱镜7000 SDS软件V1.0 (ThermoFisher科学)。反应条件如下:1 95°C的循环10分钟,40 95°C的周期15秒,55°C 30年代,30年代和72°C的引物除了骨钙素,在退火温度设定在62°C。定量分析,基因表达谱正常化的表达β肌动蛋白的管家基因,使用2^−ΔΔCt定量数据分析的方法。基因表达是表现为褶皱相比增加或减少基因表达在第0天nondifferentiating介质。

2.11。评估双电位的分化

为了评估的分化能力分离msc、特定分化标记和转录因子的表达是检查,在基因和蛋白质水平。msc在15 PDs, 50 PDs检查。

2.11.1。成骨诱导

msc被播种在4000个细胞/厘米²6-well板块的总RNA提取和8-well室组织学染色的幻灯片。细胞培养在CCM 24 h,并替换为成骨的mineralising介质组成的αMEM核糖核苷和deoxyribonuclosides补充10%的边后卫,antibiotics-antimycotics 1%, 100μm L-ascorbic酸2-phosphate 10 nM地塞米松,100μ米β从Sigma-Aldrich甘油磷酸酯(所有)和进一步孵化37°C, 5%的公司₂每2到3天,与介质的变化。作为一个消极的控制,细胞也在CCM培养。在28天,细胞被固定为10分钟4%多聚甲醛和矿物质钙沉积是沾20毫克/毫升茜素红S (Sigma-Aldrich), 30分钟的pH值4.2,光学显微镜的图像。信使rna的表达成骨的标记,骨钙素和osterix,也检查了2天,7、14和28 Q-PCR,如上所述。

2.11.2。脂肪形成的诱导

脂肪生成被提拔使用以下感应协议。细胞被镀在10000个细胞/厘米²和培养在CCM直到90%汇合的。细胞被培养在脂肪形成的感应介质(目标;αMEM核糖核苷和脱氧核苷,10%的边后卫,100μm L-ascorbic酸2-phosphate, 1μ地塞米松,100μ吲哚美辛,100μM 3-isobutyl-1-methylxanthine, 1% antibiotics-antimycotics从Sigma-Aldrich(所有),和37°C, 5%的公司₂6天,媒体改变了每72 h)。细胞被培养48 h在脂肪形成的维护中(一个mm;αMEM核糖核苷和脱氧核苷,补充10%的边后卫,100年μm L-ascorbic酸2-phosphate, 10μg / ml胰岛素,1% antibiotics-antimycotics)然后再培养直到第14天的目标。作为一个消极的控制,细胞培养14天在CCM,如上所述。细胞内lipid-rich液泡积累得到了油红O染色(500μ信用证,Sigma-Aldrich;在异丙醇3.5 g / l,混合3:2重蒸馏的水),10分钟或荧光组织学染色LipidTOX™(ThermoFisher科学)后,制造商的协议。数字图像捕获使用一盏灯或荧光显微镜,分别。信使rna样本收集2天7和14,和脂肪形成的基因表达标记,脂联素,PPARγ脂蛋白脂肪酶,C / EBPα了,rt - pcr和Q-PCR如上所述。

2.12。统计分析

数据表示为均值的平均值±标准误差(SE)。数据统计比较用方差分析(方差分析),图基的事后测试,使用SPSS 20.0版(美国纽约IBM),显著性水平接受 。

3所示。结果

3.1。组织学分析隔离程序

组织样本处理苏木精和伊红染色表明细胞在骨髓冲洗之前,冲洗后的骨髓,用胶原酶治疗后。结果显示细胞的范围出现在中央骨髓腔(图1(一)),其中大部分是容易冲走除了少数残余细胞的骨内膜的表面骨(图1 (b))。股骨内的骨皮质板层骨,与一个强大的网络,哈弗斯和福运河两旁perivascular-associated细胞(图1 (c))。治疗的骨组织相对高浓度的胶原酶会导致一些损失的矿化组织,释放细胞,包括血管周的msc和祖成骨细胞衬里表面哈弗斯和福运河(图1 (d))。

3.2。检查基质细胞特征

不同的分离方法的效果和增生性小众源寿命为每个孤立CB-MSCs BM-MSCs,确定通过累积人口倍增(PDs),如图所示2(一个)。累积PD概要文件是重复在两个不同的场合,并演示了一个一致的扩散模式CB-MSCs和BM-MSCs之间几乎没有变化。两种群证明最初的迟滞期超过60天,紧随其后的是一个快速到达PD100指数增长。两个MSC人口迅速生成一个支流从PD15单层,每2 - 3天达到70% - -80%融合;平均每周PDs记录BM-MSCs CB-MSCs是5.4和5.2,分别。

细胞CB-MSCs和BM-MSCs PD 15日PD50,和PD100积极表达间充质祖细胞表面抗原,CD73 (ecto-5-nucleotidase), CD90 (Thy-1)和CD105 (endoglin),和被发现是负CD45的表达(造血表面抗原(图)1 (b))。CB-MSCs PD15 CD34表达,由PD50丢失和缺席BM-MSC人群。两MSC人口保持胚胎干细胞标记物的表达,Nanog,同时Oct4只是CB-MSCs中高度表达在PD15 PD50和PD100微弱表达。Oct4 BM-MSCs缺席。脂肪形成的分化标记的表达,PPARγSox9, chondrogenic标志是- msc从两组。分析也证明Runx2的积极表现,以及检测骨钙蛋白的低表达在CB-MSCs和BM-MSCs PDs检查。

图2 (c)显示了CB-MSC或BM-MSC种群的cf PD15 PD50。结果表明,在PD15 CB-MSCs CFE明显降低,而在PD50细胞( 天3 - 6)和BM-MSCs PD15或PD50。的CFE BM-MSCs观察减少PD50累积PDs从PD15增加。

3.3。描述的细胞形态和缺乏细胞衰老

图像呈现在图3在每个MSC人口显示细胞的形态与肌动蛋白染色高的放大。图像表明,msc取自PD15显示清晰的观察大之细胞,夷为平地,有核体传播,与小数量的纺锤状,混合fibroblastic-like形态的细胞。然而,PD50,较小的细胞更fibroblastic-like外观的主要细胞类型,与肌动蛋白细胞骨架的组织模式,形成集中在纺锤状细胞文化。在PD100 CB-MSC和BM-MSC人口证明小stellate-like短流程的存在。

在这个扩展文化,CB-MSCs或BM-MSCs显示小细胞衰老的迹象(图4)。端粒长度的分析表明小缩短在扩展文化(图4(一)),这与持续的表达rTERT(图4 (c))。BM-MSCs稍微更长的端粒长度,从大约25.6到6.3 kbp CB-MSCs相比,范围从23.4到3.1 kbp,但这些代表平均值从3单独的印迹和统计上被认为是无足轻重的。进一步的分析表明,细胞nonsenescent,证实了< 2%的细胞每30μ米²染色阳性SA -β牛乳糖(图4 (d))和细胞仍然能够实现倍增率> 4.9 PD /周(图2(一个))。

分析与细胞周期调控相关的基因(图4 (d))表明,肿瘤抑制基因表达的各种细胞群,p53、p21和下游基因,^Waf1(监管机构在G1和S期细胞周期进展)。然而,另一个公认的肿瘤抑制基因,p16^INK4A,只是表示在CB-MSCs PD15被PD50丢失。

3.4。成骨、脂肪形成的msc分化

PD50,成骨的介质后28天文化,MSC人群展示不同的矿化骨结节的形成,与茜素红染色阳性(数字5 (c)和5 (d))。染色是BM-MSCs更大。这些结果证实了基因表达的分析osteoblast-specific标记,osterix和骨钙素(OCN) qPCR(图5 (e);表现为褶皱的差异相比,治疗前后感应介质)。分析表明,在论述媒体,CB-MSC和BM-MSCs显示相当大的叠化增加在这些在诱导成骨的基因,大大增强褶皱增加观察在BM-MSCs指出天7和21 ( )。CB-MSCs表示更高的叠化增加osterix在第二天,但是这没有持续高表达在论述媒体文化持续。

脂肪形成的分化也成功地诱导CB-MSC和BM-MSCs,油红O染色显示的形成更大、更清晰的脂质滴在分化BM-MSCs(数字6(一)和6 (b))。这些观察与BM-MSCs更高的脂蛋白脂肪酶基因表达,与角色提出参与脂肪酸吸收和存储(图6 (c))。然而,qPCR也证明了早期诱导脂肪形成的主基因C / EBP4,和下游基因,FABP4, CB-MSC内细胞群(图6 (c))。的脂肪形成的和成骨效能CB-MSC PD15和PD50也检查使用矿物沉积用茜素红染色技术和使用荧光染料形成的脂质滴,LipidTOX(图7)。PD50, CB-MSCs证明增加潜在的脂肪形成的诱导成骨的感应和降低潜力,而在PD15 CB-MSCs。

4所示。讨论

目前的研究提供了一个原始的比较分析与隔离,扩张,描述异构MSC人口可能来源于细胞与骨髓基质(实现通过优惠纤连蛋白坚持电镀技术;BM-MSCs)以及大鼠骨的骨内膜的表面芯片外植体(CB-MSCs)。不管细胞起源和隔离技术,纯化MSC人口都发现阳性选择MSC标记,CD105, CD90,和CD73,表明他们的间质起源和会议的建议要求国际社会的细胞疗法(ISCT)财务状况表13]。这些人群对CD45不利,这表明孤立的人口被成功分离造血干细胞是存在于骨髓基质中大量与之相关骨内膜的利基(8)这将干扰msc的完整描述。两个隔离技术成功地隔离能够维持长期的多功能msc在体外PD100扩张。分析细胞PD50表明双电位的的人口保持msc成骨细胞和脂肪形成的谱系分化。CB-MSC和BM-MSC细胞数量、细胞倍增时才显著增加细胞大约PD10取得。类似的滞后时间high-proliferative活动已报告之前(20.),可能反映了预期低数量的高度增殖的MSC预计在这些组织中,随后扩大成为建立在异构MSC人口,和/或细胞适应新的文化环境不同在活的有机体内利基市场环境。出于这个原因,分析当PD15细胞迅速增殖,超出时间细胞也更容易被利用在体外试验模型系统或细胞疗法。

在这项研究中,细胞PD15 CB-MSC和BM-MSC演示了一个异构形态与小,细长的双极细胞和大的多边形细胞存在。这与以前的研究一致检查从骨髓基质细胞前体孤立,这继续识别小fibroblastic-like 60 - 100的细胞μ米也积极增殖而大多边形细胞增殖较慢(12]。值得注意的是,更大的细胞由PD50似乎失去了,可能是由于其增殖率相比之下较小的细胞分裂速度慢,因此主导文化。较小的细胞可能代表符合multipotentiality较大的细胞,而更大的细胞可能代表更有区别,lineage-committed细胞或较大的衰老,衰老细胞。后者是不太可能场景自端粒长度仍持续长,不变期间文化扩张(25-8 kbp),观察发现高水平的支持的rTERT表达式。进一步分析的细胞PD50表示一些衰老细胞染色阳性SA -β牛乳糖,这表明这些细胞可能存在尽管较低的数字,尽管可能需要更多的分析验证这一结论。preosteoblastic基质细胞的存在以及nestin-positive MSC被描述在骨髓基质中的两个重要的利基市场,即血管周的利基和骨内膜的利基,重要支持造血干细胞,除了提供骨重建和修复活动的重要贡献(8]。他们的存在从而导致间充质干细胞的异构特性,明显的分解动作从骨髓(BM-MSCs)或由于外植体胶原酶消化后删除所有,但细胞与骨内膜的利基(CM-MSCs)。CM-MSCs可能另外含有血管周的msc、preosteoblasts, bone-lining细胞也驻留在哈弗斯和福运河系统,这需要从骨膜血管供应到骨头,除了支持骨细胞网络和生理骨重塑。

BM-MSC和CB-MSC种群表现出一致的胚胎干细胞标记物的表达,Nanog在所有阶段的文化。Nanog已经提出了一个支持成人msc的增殖作用的过渡在活的有机体内静止适应广阔的增长在体外(24,25]。然而,在这项研究中,我们还发现了MSC种群内CB-MSC PD15细胞群CD34⁺和Oct4⁺。一个CD34⁺在骨髓MSC族群被描述,提出与脉管系统(密切相关26),因此可能与静动脉利基最近描述出现在骨内膜的地区(27,28]。CD34的表达似乎是受到周围环境和记录,MSC CD34的表达可以改变从正到负,反之亦然,这可能的损失占表达CB-MSC文化超越PD15 [25]。Oct4提出了角色在维持多能性和用于从成人msc诱导多能干细胞的生成24,29日),本研究报告的“诱导msc”CD34⁺从成人外周血细胞分离30.]。总的来说,这些MSC的识别标记,Nanog, CD34, Oct4、在我们CB-MSC人群建议一个不成熟的MSC族群的存在保持未分化状态,至少能够为多个通道传播PD15之外,这不是可识别的MSC人群来自骨髓基质。

无论PDs,所有孤立CB-MSCs和BM-MSCs在目前研究显示积极的表达Runx2扩张期间文化基础培养基。虽然它的作用还没有完全描述,需要Runx2和osterix必不可少的促进成骨细胞分化诱导的早期阶段,但抑制终端成骨细胞分化31日]。Runx2, Sox5、Sox6 Sox9,对终端的软骨细胞分化[至关重要31日]。在本文提供的研究,我们未能发现Sox9,检测到低水平的osterix表明CB-MSC和BM-MSC异质种群也包含osteoprogenitor和preosteoblasts,细胞研究显示仍然能够广泛复制(32]。这对成骨细胞谱系的承诺,但是,预计不会否定对两性的贡献与细胞群。研究表明,转录因子,PPARγ,可以诱导Runx2表达成骨细胞MC3T3-E1细胞的转分化为成熟脂肪细胞(33]。

在各自的异质种群,CB-MSC和BM-MSC人口证明类似人口翻资料,4和5之间实现PDs /周。在每个人口MSC,细胞循环基因的表达调节复制的能力也被检查。p21^{waf1 / CIP1}和p53在依赖和相互依赖的方式阻止细胞周期G1和年代阶段进展,作为肿瘤抑制调节细胞增殖率提供基因组富达在MSC部门(34]。p53也是一个负监管机构的形成preosteoblasts和preadipocytes35),和p53的缺失可导致骨肉瘤发展(36]。p21的表达^{waf1 / CIP1}和p53,因此,调节MSC处于未分化状态的稳定扩张,人口和他们的存在表明这种MSC人口的存在。此外,CB-MSCs PD15演示了额外的p16的存在^INK4A也有提议减少干细胞增殖的作用[37,38]。它也被认为是一个关键基质细胞和体细胞衰老的标志39),可能表明衰老细胞亚群在CB-MSC隔离的隔离,尽管端粒测量建议减少长度。不过值得注意的是,p16蛋白表达^INK4Ap21和^{waf1 / CIP1}中都发现了完全分化成骨细胞来源于MC3T3和颅顶的外植体,它提出了逮捕他们参与细胞生长在这个场景中(40]。因此容易推测p16的存在^INK4A内PD15代表一个族群的人口CB-MSC postmitotic分化成骨细胞细胞,可能来源于bone-lining细胞在骨内膜的环境中。为了验证这个假设,我们检查能力各自种群内的细胞,形成殖民地从单个细胞,双电位的能力相关。目前的研究清楚地表明,cf CB-MSC人口在PD15显著降低而CB-MSCs cf PD50和BM-MSCs PD15或PD50。然而,CB-MSC PD15证明人口增加染色的沉积矿物含有骨结节和减少潜在形成脂肪细胞,在PD50 CB-MSCs相比,因此支持更成熟成骨细胞的存在的异构PD15人口CB-MSC人口,由PD50随后失去了。

在目前的研究中,我们比较cf和两性形成成骨细胞和脂肪细胞CB-MSC BM-MSCs PD50,当两个细胞群为MSC标记显示出类似的基因表达谱,CD73, CD90、CD105, Nanog,成骨的标记Runx2, p21和细胞周期蛋白^{waf1 / CIP1}p53 (CD34 Oct4、p16^INK4A积极在不被察觉的情况下)。在这个时间点,BM-MSCs脂肪形成的更大的潜力和成骨分化,而CB-MSCs。两种群表现出能力形成克隆的殖民地。这些结果表明,骨髓人口包含更多的承诺preosteoblasts,仍有能力,正确的信号环境下,形成脂肪细胞33,41]。相比之下,考虑CB-MSCs PD50,更不成熟MSC人口现在成为主流。随着这些CB-MSC文化持续在成骨的条件下,增加沉积矿化骨结节的观察,表明细胞与成骨的潜在的存在,这需要更长的时间达到一个完全分化成骨细胞合成成熟骨的能力。

5。结论

研究比较两种隔离技术产生两个异构的MSC种群的特征变化根据利基的细胞来源。数据的价值是双重的。这项研究提供了数据提供一个明智的考虑在选择使用哪种隔离技术在体外模型。协议已成功地分离MSC的密质骨,MSC的人口更血统限制用于成骨。这些细胞可能提出的第一反应者在矿化组织修复,随后与不成熟的msc增殖来取代前者细胞群(42]。因此,隔离的主要细胞骨移植组织提供了msc可能更合适当希望评估成骨的疗法的疗效,研究获得的数据可能更相关的骨修复过程。相反,BM-MSCs可能更合适当评估tripotentiality需要和能找到相关性研究的一系列外骨再生组织工程应用。此外,最初数据提供了一个重要的描述来证明研究进一步描述MSC人口在人体模型。的注意,骨再生的黄金标准是自体骨移植,包含一个骨内膜的利基,因此潜在的受益于MSC人口谱系限制性的成骨分化。进一步调查这些谱系限制性msc可能因此受益提供更明确的细胞群的干细胞疗法。

的利益冲突

没有利益冲突的声明关于这篇文章的出版。

确认

本研究通过一个ast奖学金资助授予Norhayati Yusop的高等教育,马来西亚。