转化应用的微流体和生物打印干细胞软骨修复

文摘

软骨缺陷会削弱最基本的日常活动,如果处理不当,会导致关节功能完全丧失。标准治疗的局限性软骨修复引发了干细胞疗法的发展。在这种情况下,开发高效的细胞分化协议和适当的生物材料的设计提供支持细胞损伤网站需要通过基础研究和应用研究,以充分利用干细胞的潜力。在这里,我们讨论了使用微流体和生物打印方法翻译的干细胞治疗软骨修复在诊所。特别是,我们将关注hydrogel-based材料的优化模拟关节软骨由他们使用bioinks在3 d生物打印应用程序中,在生物化学和生物物理因素的筛选通过微流体设备提高干细胞软骨形成,和使用微流体技术来生成植入与复杂的几何结构。最后,我们将介绍一些新的生物打印应用程序铺平道路的临床使用干细胞疗法,如scaffold-free生物打印和3 d手持设备的发展软骨原位修复的缺陷。

1。介绍

软骨缺陷,由于外伤或进行性关节退行性变,可以损害最基本的日常活动,如步行或跑步。由于软骨组织的自我修复能力有限,这些病变可以很容易演变成骨性关节炎(OA),导致关节功能完全丧失,后续需要关节置换(1]。在过去的几十年里,标准的外科治疗的局限性软骨修复引发了细胞疗法的发展。自体软骨细胞移植(ACI)第一个细胞治疗软骨缺损的方法(2,3),最近,干细胞已经被提议作为一种替代细胞来源的细胞软骨修复(4,5]。各种类型的成人干细胞,源自骨髓间充质干细胞(bmsc)已广泛用于软骨应用由于其充分展现出chondrogenic潜力(6,7]。除了bmsc,更最近,脂肪间充质干细胞(ADMSCs)获得不同脂肪仓库,包括膝盖infrapatellar脂肪垫,获得了日益增长的兴趣作为替代细胞来源软骨修复(8- - - - - -10]。

在组织再生的干细胞疗法的发展,生物工艺优化需要利用干细胞的非凡的潜力。特别是,高效的细胞分化协议和适当的生物材料的设计提供支持细胞损伤网站需要解决和克服通过基础研究和应用研究[11]。在这个场景中,微流体系统吸引了重大利益实现平台,当地环境条件的控制,包括生物化学和生物物理参数,是学习和直接利用干细胞命运(12,13]。的确,微流控技术使精确控制微尺度流体,从而允许模仿天然细胞微环境的连续灌注文化或通过创建化学梯度(14]。因为这些特性,微流体装置可以有效地用于调查引导干细胞分化的众多因素对一个特定的细胞谱系,测试几个条件以最小的需求而言,细胞数量和金额的试剂进行大实验(15]。迄今为止,一套微流控设备开发研究的影响生物化学和生物物理因素对干细胞分化为了概述干细胞软骨形成新的协议(16- - - - - -18]。最近,微流控技术也被用于制造先进系统为3 d生物打印为增强营养供应生产微通道支架(19)或封装细胞在微球或纤维(20.- - - - - -22]。3 d生物打印是一个新颖的研究领域,展示优秀的工程组织的发展潜力,允许异质结构的制备与生物化学成分,机械性能,与本地的组织形态和结构(23,24]。报道在最近的一些评论23,25- - - - - -28),这项技术有可能克服主要问题相关的临床翻译为软骨组织工程产品维修,一直到目前为止有限由于穷人的结果构造功能。事实上,软骨属性是由胶原纤维的各向异性特征的复杂架构方向和密度梯度的软骨细胞,甚至表达稍微不同的表型(29日,30.]。3 d生物打印,由于其能够控制物质和细胞定位,表现为一种很有前途的方法复制的复杂性区域变化的细胞密度和细胞外基质(ECM)属性(31日,32]。此外,这种技术提供了其他优势,比如可能繁殖科目的几何和地形从医学图像创建cell-laden构造合适的缺陷的具体病人(33]。

在本文中,我们将描述微流体和生物打印如何提供不同领域的见解间充质干细胞软骨修复和有助于发展新的治疗策略。具体来说,由于微流体和生物打印技术共享hydrogel-based材料的使用,在第一部分中,我们将关注这些材料的优化模拟的组成及关节软骨的力学性能。我们将描述使用微流体设备识别的生物化学和生物物理因素推动干细胞软骨形成过程中可以实现在体外成熟的打印的结构。此外,我们将描述研究,微流控和3 d生物打印技术已经应用到生成植入式复杂的几何结构。最后,我们将介绍一些新的生物打印应用程序铺平道路的临床使用干细胞疗法,如scaffold-free生物打印生成临床相关的构造使用3 d细胞球状体作为构建块和一个3 d生物制造手持设备的发展软骨原位修复的缺陷。

2。微流体和生物打印触发细胞疗法的翻译

2.1。进步在Hydrogel-Based材料

在一些临床应用,干细胞直接注入到靶组织,没有任何生物材料载体。这个过程会导致有限的干细胞移植治疗的网站,主要是由于细胞悬液泄漏在注射(34]。由于干细胞的再生潜力是强烈与细胞保留病变部位的数量,提高干细胞移植是至关重要的34]。使用水凝胶载体介绍了克服这个限制,通过促进细胞保留所需的网站,提供植入细胞与支持细胞微环境可行性和功能(34,35]。在软骨再生的环境中,水凝胶被广泛应用,因为他们的许多优势。这些高度水合可以是天然或合成高分子网络可以用于细胞嵌入以及将生长因子和ECM组件。此外,水凝胶在不同的几何形状可以很容易地定制,如果设计得当,可以为细胞提供一个环境类似于本机软骨(36,37]。

因为他们的内在特性,应用了水凝胶作为细胞培养的3 d矩阵在微流体设备(38)以及bioinks为3 d生物打印。特别是,他们越来越多地使用生物打印引发了hydrogel-based材料的优化工作,在作文方面,生长因子浓缩和机械性能。事实上,尽管生物打印的有前途的优势,主要的挑战之一是缺乏一种隐形材料,可以被认为是理想的bioink满足特定需求,所述的最近评论(39- - - - - -42]。关于extrusion-based生物打印过程中,bioink应该提供剪切稀化行为,允许通过打印机喷嘴挤压。同时,bioink应以快速剪切恢复保持印刷形状,显示足够的力学性能,保证一个合适的环境嵌入式细胞形状和长期忠诚、操作、易于处理。最后,打印的bioink应该不会引起排斥的允许长期文化细胞。这种技术的瓶颈是由复杂性结合流变/机械性能和生物性能,这通常是相互排斥的。为了克服这个问题,有两种不同的方法:要么提高材料的生物相容性特点是足够的印刷性能或改善生物相容性材料的印刷适性43]。例如,阿姆斯特朗et al。44)制定一个新的Pluronic-alginate多组分与bmsc bioink生成骨骼和软骨的结构。在这项研究中,普朗尼克被作为牺牲模板提供结构稳定性在印刷、化学交联海藻酸发生之前,以及生成微孔隙和/或各向异性式微通道的建设,增加养分扩散后删除。同样,Kesti et al。45)有所改善的印刷适性photocrosslinkable丙烯酸甲酯透明质酸(HAMA)通过添加聚(N-isopropylacrylamide)接枝透明质酸(HA-pNIPPAM) thermoresponsive聚合物具有良好的cytocompatibility作为牺牲模板。这样,作者创造了一个在室温液态,网状bioink体温。热凝胶后,生物聚合物是通过自由基聚合哈马达到稳定长期的机械稳定性。最后,HA-pNIPPAM是通过介质筛选了洗在4°C导致glycosaminoglycan-based脚手架。这个过程允许印刷支架直径10毫米和2.8毫米的高度,以高生物相容性如图所示的关节软骨细胞的生存能力。

软生物相容性材料的印刷适性的问题也解决了穆勒et al。46)开发新型海藻酸sulfate-nanocellulose bioink软骨应用程序。尽管先天水凝胶的生物相容性源自天然生物高分子如透明质酸、壳聚糖、海藻酸,流变行为的解决方案通常是不适合3 d生物打印。为了克服这个问题,穆勒和他的同事们通过添加nanocellulose海藻酸粘度增加,改变也从Newtonian-like剪切稀化行为。这项研究的结果表明,关节软骨细胞嵌入在海藻酸sulfate-nanocellulose是可行的和II型胶原蛋白合成,证明新开发的适宜性生物材料为细胞软骨修复。复合bioinks nanofibrillated纤维素(NFC)结合海藻酸(NFC / A)和透明质酸(NFC /公顷)是由阮et al。47]。特别是,在软骨,NFC模仿大部分胶原蛋白矩阵,海藻酸模拟蛋白聚糖,透明质酸的替代品本机软骨中的透明质酸矩阵。值得注意的是,海藻酸和nanofibrillated纤维素都是xeno-free和FDA-compliant材料,因此可以很容易地转化为临床使用。作者表明,复合bioinks都可打印;然而,低扩散和表型改变印刷human-derived-induced多能干细胞(万能)观察到的NFC /公顷。另一方面,则印在NFC /生产相关的hyaline-like软骨tissue-rich和hyaline-like软骨tissue-expressed chondrogenic标记,如aggrecan。不同于上述研究[47)的不同成分bioink混合与关节软骨的不同组件,该方法由Levato et al。48]概括软骨组成和架构是基于内在的主要细胞产生特定的ECM的能力。事实上,这些作者建立了一个zonal-like模型使用两个不同的细胞来源,软骨细胞祖细胞(年度"特别关注国")和bmsc封装在明胶甲基丙烯酰胺(GelMa)水凝胶。结合中国共产党,MSC-laden bioinks,打印的关节软骨的生成模型,定义的表面和深地区组成的,每个都有不同的细胞和ECM成分。值得注意的是,作者表明,他们的生物打印方法,它使用普朗尼克f - 127作为祭祀墨水支持GelMa生物制造过程中,允许编造临床相关的解剖结构。然而,与关节软骨的力学性能,打印的材料应该进行广泛的在体外成熟前植入或强化支持材料。事实上,水凝胶显示低抗压刚度结果变得不适合应用程序承载组织制造的。出于这个原因,一些策略利用,强化水凝胶使用硬材料(27]。例如,戴利et al。49)工程机械由codepositing软bioinks钢筋水凝胶,如琼脂糖、海藻酸,和GelMa,聚已酸内酯(PCL)细丝。作者通过这种方式,能够获得BMSC-laden构造与体积压缩模量与本机关节软骨相似。值得注意的是,这种方法允许同时提高软的印刷适性水凝胶和匹配所需的机械性能在联合环境承受高机械负荷,因此,很难实现当使用标准的水凝胶(23]。另一个有趣的工作,侧重于强化bioinks是由康et al。50)开发的一个集成的组织器官打印机(ITOP)。这个设备包括多个筒系统,允许cell-laden沉积的复合水凝胶结合PCL聚合物和外部牺牲普朗尼克f - 127水凝胶,这强化了材料特性和支持结构,分别在印刷。通过3-axial机动阶段系统和一个空气pressure-based控制器,ITOP能够精确调节每个材料的体积分配使生产结构与结构完整性和复杂的几何形状。获得的有前景的结果使用这个系统来生成一个人类大小的插进打印的构造也表明这种方法是适合打印临床相关的结构概括本机关节软骨的结构和特性。

尽管上述方法,制定最优bioink软骨组织再生仍要实现。此外,本机ECM的内在复杂性往往是被忽视的3 d生物打印实验。众所周知,ECM微环境中扮演着重要角色在引导干细胞分化的受体配体的相互作用和转导51]。因此,成功地生成一个有益的细胞,修复cell-ECM交互必须完成。这个目的,Pati和他的同事们52)最近提议使用脱细胞细胞外基质(dECM) bioink维持本地的复杂性组织(图1)。特别是,关节软骨脱细胞,可溶性,结合下鼻甲tissue-derived间充质基质细胞(TMSCs)和印刷一层技术使用PCL聚合框架来支持在印刷和凝胶结构。结果表明dECM支架提供了生物相容性微环境细胞增殖和超过控制材料指导组织家族承诺,所透露的增加chondrogenic标记物的表达。值得注意的是,这项研究表明,生物打印与dECM bioink是一种有吸引力的选择,为两个新方法在体外和在活的有机体内组织重建。此外,开发领域的材料也可以特别有益在体外软骨的模型,目前使用标准和特异性的水凝胶,如I型胶原蛋白和纤维蛋白,作为细胞培养的3 d矩阵。例如,dECM水凝胶,胶凝在37°C,可以很容易地用于微流体模型来更好地模拟软骨的环境,为细胞提供一个有益的单元格,代表一个重要的一步发展的仿生软骨的模型。本研究完全显示了如何努力的研究领域密切相关在活的有机体内应用程序,如3 d生物打印,可以导致其他重要进步明显不相关的领域,如在体外仿生模型,代表一个完美融合的例子不同的科学领域。

2.2。评价生物化学和生物物理因素

干细胞分化协议利用细胞发育信号指示,使他们朝着一个特定的谱系。模型的生成多种生长因子的筛选是一个至关重要的步骤来定义微分信号能够概括在体外发展过程导致软骨形成在活的有机体内。实际上,生物化学和生物物理参数的识别能够引发干细胞软骨形成的设计可以显著影响适当的文化条件在体外生成结构的介质组成以及动态培养系统的发展应用生物物理刺激。在这种情况下,获得的结果在体外模型中可以实现在体外成熟biofabricated构造注入之前,为了实现chondrogenic启动的工程组织。最合适的定义结合微分信号通常需要一些生长因子的筛选组合,以及浓度范围和时机,这很容易导致一个复杂的实验设置基于许多水平的多个参数之间的交互。在这种背景下,微流控技术提供了几个优势相关测试所需的最小数量的细胞大量的实验条件和使用大量的昂贵的生长因子很低。更重要的是,微流体模型特性前所未有的时空控制细胞微环境。事实上,控制灌注的培养基内式微通道允许维护统一的培养条件比标准的静态方法,提供稳定的供应营养和生长因子以及清除废物(13,53]。值得注意的是,控制流体流动也可以利用自动获得生长因子的梯度在同一微流体平台使用串行稀释发电机(西班牙)。这种策略最近被Occhetta等应用。16)开发了一种微流体平台实现两个不同的西班牙生成一系列浓度的可溶性因子浓度(对数刻度)或窄窗口(线性范围)(图2(一个))。这个设备是专门设计用于诱导bmsc的冷凝fluidically microchambers相连,使3 d研究的形成和统一的大小和形状。作者使用这个平台,能够在同一时间统一生成3 d细胞研究定义的空间配置和文化他们连续层流下定义转化生长因子的浓度——(TGF)β3横跨四个数量级。这种筛查导致识别TGF -最低β3浓度(0.1 ng / mL)能够诱导软骨形成和维护bmsc的增殖能力,而最高的TGF -β3浓度(100 ng / mL)诱导研究的解集。值得注意的是,这项研究的结果表明,开发的模型允许复制步骤3 d扩张发生在肢体发展的早期阶段,克服的一个主要限制其他的3 d模型,比如macropellets经验减少细胞的数量随着时间的推移,由于形成坏死核心(54]。西班牙的使用也已实现微流体平台设计和开发选择最合适的浓度和/或生长因子的组合有利于关节软骨细胞增殖,在单层培养(55]或[hydrogel-based文化56]。低数量的细胞,可以从患者的活检是ACI程序的主要限制因素之一,因此,为软骨细胞扩张的优化协议代表了一个关键的一步来改善这种临床方法的结果。另一个策略来克服这一限制是由结合Higuera提出的msc和关节软骨细胞et al。57)开发了一个植入筛选设备,允许多个coculture条件的分析在体外和在活的有机体内。设备由3 d打印平台由阵列的微毫米级的井,可以皮下植入裸鼠评估细胞来源的影响在ECM的积累。因为这个系统,作者确定了最优的比例msc及关节软骨细胞实现软骨基质沉积,表明最优条件的存在这两种细胞类型之间的串扰。

除了生化因素,生物物理因素的作用因素在干细胞分化也获得越来越多的关注。仿生微环境的发展允许更精确的研究在physiological-like条件下细胞的行为。在这个场景中,微流体主要优势相比传统2 d文化由于复制的某些方面的可能性在活的有机体内3 d环境的生物化学和物理刺激。在这种背景下,里维拉和Baskaran [17)开发了一种微流体设备调查同时剪切应力的影响和生物分子梯度BMSC对齐和软骨形成。三星期的接触TGF -β1通过流体流动增强梯度的形成chondrogenic总量增加细胞伸长流向一个常数相比TGF -β1浓度。细胞排列更加明显在支流区域对nonconfluent区域证明两个剪切应力,和接触BMSC行为的影响。因此,揭露bmsc chondrogenic因素和剪切应力梯度的似乎是一种很有前途的战略诱导软骨形成,可以生成实现工程组织与优越的特性相比,标准的文化。另一种微流体的方法是利用调查的影响顺序机械和生化刺激干细胞分化(18]。这个目的,剪切刺激系统由一个控制注射泵被用来应用生理切应力的1.5 Pa暂停bmsc流经管。Shear-stimulated bmsc被暴露在生化因素来确定预处理bmsc与chondrogenic机械刺激可以提高反应的因素。值得注意的是,本研究强调,bmsc保留的记忆一个剪切刺激经验,3周后,承诺对chondrogenic血统还是优越shear-stimulated nonstimulated细胞相比,证明这种方法的潜在影响干细胞命运对区分因素在短时间内和响应性。

近年来微流控技术的进步也允许加入纳米结构的3 d微流体模型来创建一个更仿生微环境和理解转导动态调节干细胞的命运。特别是,钟等。58)综合取向纳米纤维通过电纺的成一个微流体平台调查地形线索的同时作用和机械流体流动(图提供的线索2 (b))。作者设计了一种微流体装置包含独立microchambers与多个方向对静电纺丝允许流体流动形式不同角度nanofibrous衬底。结果表明:bmsc优先沿着纳米纤维方向拉长,提高软骨形成的垂直流动。在这种情况下,II型胶原蛋白的表达是更高,而显著增加的I型胶原蛋白在细胞在平行流,展示具体转导信号通路调节BMSC分化,将机械刺激转化为生化信号。

从干细胞关节软骨的修复,同时触发有效的干细胞软骨形成和骨生成空间定义的地区的一个3 d支架似乎是一个有前途的战略发展在体外模型研究软骨相声,因此,实现新策略来改善关节软骨移植的集成。在这种背景下,微流控技术提供了强大的工具来工程师界面组织利用内在multidifferentiation干细胞的能力。这些结构可以作为疾病模型研究致病作用的信号可能影响软骨和软骨下骨或生成可植入人体的构造,代表英国航空公司特征维之间的在体外和在活的有机体内应用程序。最近,史和他的同事们(59)开发了一种微流体系统能够生成梯度chondrogenic和成骨生长因子引导的空间控制的软骨形成和骨生成ADMSCs嵌入在相同的水凝胶(图2 (c))。这个gradient-generating系统包括一个底层组成的PDMS池满杆cell-laden琼脂糖凝胶微孔膜覆盖,表层包含两个横向蛇形通道和一个中央线性通道。产生一个仿生成骨和chondrogenic区之间的过渡阶段,一个没有任何分化的培养基因素被引入中央通道而chondrogenic和成骨的媒体引入两个侧著。经过25天的文化、空间控制干细胞的分化成软骨细胞和成骨细胞和一个地区实现了模仿观察软骨界面中部地区的水凝胶。实现这种类型的gradient-generating系统更复杂,临床相关的设置可能铺平了道路在体外工程界面组织从一个单细胞播种在单一生物材料来源。这个平台也可以用来研究疾病的发病机制涉及关节软骨和软骨下骨,如办公自动化。事实上,生成的构造可能代表一个可靠的在体外骨软骨界面的模型和两个侧著可以用来生成一个梯度的致病性信号(例如,促炎细胞因子)从关节软骨或骨。类似的方法已经被林和他的同事们(60)建立了一个microphysiological模型骨软骨的单元将微流控系统集成到一个多室生物反应器。该系统是利用来实现空间定义chondrogenic或成骨分化的bmsc装载在丙烯酸甲酯gelatin-based脚手架和诱导OA-like反应通过有针对性的治疗关节软骨或骨间的促炎细胞因子白介素- 1 (IL)β。使用这种方法,作者表明,il - 1的骨层的接触β导致更强的分解反应比il - 1的直接应用软骨的层β软骨的组件,表明两者之间的积极交流组织。3 d生物打印技术已经也利用生成各向异性微尺度多相三维组织模型的潜在影响在体外药物检测、发现和发展据Gurkan et al。61年]。在这项研究中,一个界面组织的生成是通过印刷bmsc只水凝胶滴封装或骨形成蛋白- 2 (BMP)或转化生长因子-β1对不同血统的分化。作者表明,表型通路和网络分析可以执行使用从模型中获得的基因表达数据,证明打印的各向异性组织功能的潜力在体外三维组织模型。

2.3。构建架构的改进

在干细胞软骨应用程序中,使用水凝胶生物材料介绍了改善在受伤部位细胞保留,为植入细胞提供良好的微环境。然而,大部分水凝胶的使用一些缺点包括异位软骨形成的风险高和效率低的氧气和营养供应由于有限的水凝胶中扩散,通常局限于200年μm和导致坏死核心(62年]。

随着工程技术的进步,如软光刻技术和3 d生物打印,微流体通道和复杂几何图形被改造成水凝胶来提高灌注的氧气和营养物质和代谢废物的清除嵌入式细胞(19,63年- - - - - -67年]。获取打印微流体通道,小张和同事(19)结合3 d生物打印代cell-embedding中空纤维和微流体。在这项研究中,同轴喷嘴的使用三个fluid-dispensing技巧和装配输送管,外管和内管。进料管海藻酸被用来交付解决方案到外层之间形成的空腔和内胎,而CaCl₂交联的解决方案是美联储通过内胎创建空心丝。通过调节流量的海藻酸和CaCl₂作者的解决方案,能够优化核心直径和纤维直径之间的比例展示这项技术的极大的灵活性。软骨细胞祖细胞(年度"特别关注国")封装在空心海藻酸纤维显示细胞生存能力很高,证明这一过程的cytocompatibility。明显,chondrogenic标记的表达在封装年度"特别关注国"加强与单层培养相比,表明海藻酸中空纤维为年度"特别关注国"提供一个理想的环境来区分和履行cartilage-producing功能。这个策略允许制造3 d结构含有祖细胞,产生细胞的生存能力和功能播种在中部地区,通常获得营养和氧气有限。此外,作者所设想的,这种方法可以通过印刷实现共产党球状体细丝和泵之间的培养基通过中空的渠道促进cartilage-specific矩阵组织结构的形成与临床相关的大小。正如上面提到的,营养和氧气供应不足和低效浪费切除是主要缺点当工程体外三维厚组织。3 d内嵌入微流体网络水凝胶支架是一种很有前途的方法来改善通过厚组织灌注。崔和同事(65年)提出了一个战略控制支架内可溶性物质的分布和对流质量传递通过微流体网络嵌入到梗塞部位生物材料。作者利用光刻技术来生成功能的微流控著在海藻酸钙水凝胶播种与关节软骨细胞和对流和扩散溶质传输特征,证明了微流体通道启用有效的溶质交换大量的脚手架和定量控制的可溶性细胞信号。这种方法也适用于生成两个独立的微流体网络相同的支架,这可能是特别相关的政府不同的生长因子诱导干细胞的空间微分控制播种在相同的水凝胶,工程师界面组织。一个类似的策略是通过高盛和Barabino [66年)设计琼脂糖结构嵌入微流控蛇为了提高封装关节软骨细胞的可行性和II型胶原蛋白和粘多糖的生产(图3(一个))。这个目的,PDMS模具被用来生成一个cell-laden琼脂糖层集成微流控蛇纹石(425×425μ方形截面),然后密封的平面板cell-laden琼脂糖溶液完成构建。这项研究表明,微流体网络的整合cell-laden琼脂糖凝胶允许改善扩散和ECM组织工程构建的生物合成相关的厚度(2.5毫米和5毫米厚)相比,大部分水凝胶。

考虑作为生物制造微流体技术的开发,有趣的研究最近发表,微流体被用来产生3 d支架均匀孔隙大小(68年,69年]。具体地说,钟等。68年]使用微流体装置包括两个同轴锥形频道海藻酸生成气泡在液体水滴注入氮气和海藻酸水溶液通过内部和外部渠道,分别。这些泡沫自发地自我组装成液体泡沫,然后暴露于CaCl₂解决方案诱导交联海藻酸并生成稳定的泡沫。这种方法生成的支架与高度有序和相互联系的毛孔大小控制。在之后的一项研究[69年],同一组表明这种蜂窝状多孔支架,其特征是一个更有序的结构比传统的藻酸盐海绵、良好支持软骨细胞生长和表型维修证明这个高度有组织的脚手架准备与一个经济微流体装置拥有潜在未来软骨组织工程领域的应用。

最近的3 d与先进的微流控生物打印喷咀最近发现应用在许多领域,导致空前的进步空间分辨率高的生物制造复杂的组织结构(70年]。在软骨修复的背景下,基于两个同轴针已被用于制造3 d通过生物打印由ECM支架仿生水凝胶含有bmsc(图3 (b))[71年]。在细节中,作者开发了一种生物打印系统由外部喷嘴和喷嘴内部,调剂CaCl₂分别和不同alginate-based水凝胶的解决方案。通过这种方式,两种解决方案有接触,立即顶端形成的水凝胶纤维内部的喷嘴通过凝胶化过程,允许生产和高分辨率的三维水凝胶。3 d生物打印后,构造了二次紫外线交联,保证一个有效的结合在纤维属于相邻层确定支架的整体力学性能。特别是,结构与5毫米高度印刷沉淀50 100层μ米厚度。3 d生物打印实验与综合显示离子交联的海藻酸和紫外线交联没有有害的细胞生存,证明这种方法的生物相容性。

微流控技术也已经被利用来实现细胞生成cell-laden微型胶囊微凝胶在高通量的方式,报道在最近的一些评论72年- - - - - -74年]。值得注意的是,使用这些微凝胶作为构建块可以组合获得相关构造对散装水凝胶提供了一个重要的优势,由于大团促进更有效的质量输运和增强cell-matrix交互。在软骨修复的背景下,李和他的同事们开发了一个简单和廉价的微流体器件封装bmsc hydrogel-based微球,可以使用可见光(交联20.)(图3 (c))。具体来说,设备是由一个普通的吸管提示和两个管子连接到两个注射器:一个包含水凝胶前体溶液(水相)和bmsc,另一个装满油(油相)。首先,吸管室充满了油,然后,把分散的水凝胶阶段是注入管以恒定速率生成微球硅胶管。通过这种方式,作者能够生成微球直径不同,(从300年到600年不等μ米)通过调整水之间的流量比和油相。作者表明,bmsc封装到微球取得了优越的软骨形成散装水凝胶相比,微球可以注入腔模拟20量度的焦软骨损伤皮下注射针,从而证明关节内注射微球的可行性和这种方法的临床意义。

微流控技术也被剥削的制造技术制备微粒子生成临床相关的3 d结构,据周和他的同事们(21)(图3 (d))。具体地说,一个同轴玻璃微细管装置是由圆形和方形玻璃毛细血管和壳聚糖和环己烷的解决方案被空运到生成一个内部水和一个外部油相,分别。生成的乳液被收集在一个碱性溶液诱导凝胶壳聚糖微球(ϕ165 - 425μ米),然后播种与关节软骨细胞和培养7天。作者表明,这段时间足以让关节软骨细胞紧密桥壳聚糖微球通过ECM大骨料,然后转移到模具(ϕ5毫米,h2毫米)和培养在静态条件下,额外使用14天。在文化、组织学分析表明,微球之间的空间充满了cartilage-specific ECM富含粘多糖。此外,生成的结构能够承受几个压缩周期并显示一定程度的弹性,表明微球紧密结合在一起的软骨细胞分泌ECM和证明的有效性为软骨组织工程应用这种自底向上的方法。

2.4。对临床实践的新方法

一个特定的3 d生物打印方法获得高度有组织的结构组织再生Nakayama教授发明的,用细胞球状体作为构建块(图4(一))[75年]。这种创新方法属于生物材料scaffold-free方法,外源性材料不需要。不同于之前的研究,是手工组装成三维球状体临床相关的构造使用圆柱形模具[76年,77年”),在“Kenzan方法,使用3 d生物机器人位置细胞在微球状体,这是作为一个临时的支持在球状体的融合。每个数组是由160μ米厚的显微针头,500μm远离对方,因此,应该有一个直径一百微米球状体的接触和ECM为了实现一个紧凑的结构形式。球体融合后,构造从针支持和培育postprinting成熟阶段形成的孔针的再吸收由于细胞“愈合”能力。值得注意的是,尽管这一技术不同于标准的方法为3 d生物打印的细胞的存在和缺乏hydrogel-based球状体材料,它代表一个有效的方法来生产结构与临床相关的尺寸,避免潜在的有害的过程,它可以发生在标准3 d生物打印程序。

另一个有趣的方法,与3 d生物打印共享一些基本原则,如使用活细胞和生物材料构建块,由3 d生物打印笔,叫做“Biopen”,它是由奥康奈尔et al。78年]。这种新方法,代表一个最相关的临床应用生物打印的翻译,旨在克服相关问题的传统过程裁剪植入的解剖缺陷。这个过程涉及到使用的医学影像数据创建植入设计前软骨的修复过程。然而,这种方法不考虑手术的外科医生的初始步骤删除多余的纤维组织的缺陷,从而改变其大小和形状。不同于标准的生物打印方法,Biopen不使用CT / MRI图像的数字模型的发展缺陷直接沉积的细胞和生物材料,但生物打印过程是由用户手动直接写时尚在外科手术。这个特性代表Biopen方法之间的主要区别和标准3 d生物打印也是这个设备允许制造的主要优势结构完全符合软骨缺损的形状和大小。这个手持制造工具是由三个主要组件:一个内部3 d打印的核心,它包含两个共线墨水钱伯斯,定制钛挤出机喷嘴和紫外线来源。挤压过程是由用户通过脚pedal-based气动控制系统,允许单独存放每个油墨和/或同时进行。在初步阶段,Biopen已经进行2 d沉积过程来验证印刷稳定性和能力创造成分梯度控制的相对挤压利率两院。结果证明了组合对象使用的印刷能力和一致性GelMa /哈马水凝胶。 In the latter phase, biological experiments have been performed to evaluate the effects of the printing process on ADMSCs. In a subsequent work, the same research group performed a pilot study to evaluate the surgical applicability of Biopen to repair critical full thickness chondral defects (ϕ8毫米)在一个绵羊的模型79年]。不同于上述设备的新版本Biopen特点是同轴挤压系统,允许存放两相的水凝胶构成的一个内部“核心”GelMa-HAMA bioink满载ADMSCs infrapatellar脂肪垫和外部“壳”GelMa-HAMA bioink混合剂(图4 (b))。这个外壳的存在权证photocuring构造的印刷。结果表明,Biopen能够提供3 d打印支架完全拟合的形状和深度缺陷,不会引起任何炎症或感染的迹象。此外,构造通过Biopen显示更高的印刷数量的新生成的软骨如果与消极治疗控制微裂缝和缺陷处理的技术,证明软骨细胞柱状校准和维护软骨下骨完整性8周后植入。有前途的结果也评估Biopen-extruded支架的力学性能,产生了瞬时杨氏模量的值,平衡系数,最大应力类似于本机的关节软骨。有前途的结果在这些研究报道78年,79年)和最近的结果关于生物打印条件的优化来实现高细胞生存能力和相关结构刚度(80年]可能铺平了道路的使用Biopen建立mm - cm-scale 3 d结构。更重要的是,因为它能够直接控制生物材料的沉积在手术过程中,这个设备可以代表一个激动人心的进展生物打印转化为临床实践,不仅对软骨再生,还在其他应用程序组织再生是至关重要的。

3所示。前景

尽管干细胞疗法已成为一种新的治疗cartilage-based修复,他们的成功往往是有限的由于多种因素,如效率低下的分化的干细胞向chondrogenic血统和/或干细胞移植和移植后生存。此外,经常被忽视的一个重要方面是干细胞通常送到一个环境和发炎,因此,必须面对大量的分解代谢的信号,可能负面影响细胞方法的结果。

在这个场景中,微流体可以提供重要的进步在生物化学和生物物理因素的选择能够直接干细胞的命运,可以实现在新的协议对干细胞分化和动态培养系统的设计。也可以设想一个微流体模型开发个性化patient-derived干细胞的筛选最合适的差异化协议为每个特定的干细胞数量。这将允许个性化差异化的优化协议。此外,由于使用期间的生长因子在体外文化可能会构成障碍的临床翻译干细胞疗法,干细胞命运唯一可能直接利用生物物理因素,如剪切应力,似乎是迷人的。微流控模型,因此代表了一个宝贵的工具来定义生物物理刺激应该用于直接向chondrogenic干细胞谱系不使用生长因子。此外,微流体设备可以用来开发organotypic模型整个关节的联合能够概括生理或病理环境(81年),完全匹配的概念研究organs-on-chips组织发展,器官生理学和疾病病因(82年,83年]。的模型概括骨软骨单元在一个潜在的微流体芯片是一个明显的证据。的确,炎症的理解事件涉及关节软骨和软骨下骨可以帮助定义补充抗炎治疗促进生存和植入干细胞的移植。最近,一个新的策略来塑造和文化复合三维蜂窝结构具有不同的细胞类型和/或生物材料,具有高空间控制在微流体通道,开发(84年]。这种技术可以让获得连续gel-gel接口,不需要柱子划定水凝胶,并铺平了道路的发展微流体模型包括关节软骨和骨的隔间与高度特定功能的细胞和ECM成分。使用这种方法,有可能结合的微缩模型关节软骨和软骨下骨的微缩模型,包括钙化ECM、成骨细胞、破骨细胞、内皮细胞(85年]。生物打印也可以用于生成微流体模型的关节关节,因为它允许多个材料的印刷和不同类型的活细胞与高空间分辨率、可编程的方式,证明了一个伟大的潜力捏造organs-on-a-chip概括的内在复杂性的本地组织/器官(86年,87年]。

另一方面,显微射流技术3 d生物打印方法可以用来解决这个问题的可怜的病变部位细胞移植,移植的干细胞嵌入在一个ECM-mimicking环境。3 d生物打印正迅速成为首选方法几个先进的在组织工程中的应用。尽管这种技术提供的吸引优势,如快速生产cellularized构造独立的准确性和可重复性高的脚手架几何,主要进行挑战,仍然需要解决相关bioink配方。事实上,理想bioink应该提供,一方面,一个适当的矩阵细胞成熟、分化、和neomatrix合成虽然仍保持,另一方面,打印分辨率很高。到目前为止,这个问题已经解决,只有一个小范围和持续开展研究找到新的解决方案。在软骨再生的情况下,3 d生物打印代表一个合适的技术来概括组织结构而言,软骨细胞和ECM组织。特别是复杂的带状组织可能被复制在未来通过更准确的复合沉积系统的发展。此外,制定bioinks应该改进,以更好地促进干细胞分化向chondrogenic血统的合成新的聚合物的配方混合或组合bioinks,最终会导致增强neodeposited质量矩阵。另一个主要问题,必须克服为了提高工程结构的翻译软骨再生的临床相关机械性能差。事实上,本机软骨的杨氏模量约700 - 800 kPa,就是一到两个数量级高于获得的结构通过3 d生物打印。 This is a key issue that would require many efforts to be overcome. A possible solution may be found by employing more sophisticated culture systems that may lead to more functional cartilage tissue by providing controlled mechanical and biochemical stimuli. However, then, we need to be sure that biofabricated mature tissue will properly integrate with surrounding natural cartilage. So far, 3D bioprinting has already demonstrated its capacity to build complex artificial structures. However, the future work must be focused on enhancing the functionality of such constructs to prompt applications in real clinical scenarios. Finally, in situ 3D bioprinting can enable the achievement of thick tissues directly into the lesion site in a one-step approach, by translating bioprinters in the surgery room. Despite challenges, this computer-aided technology holds a great potential since it would allow overcoming the need for preshaping or reshaping of the scaffold based on the defect geometry and achieving high precision in the deposition of cells and biomaterials. Because of these features, we envision that in situ 3D bioprinting will produce significant advances in the regeneration of the entire articular units or in the treatment of complex articulations, such as the carpometacarpal joint.

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

蒙达多利卡洛塔和Valerio卢卡·曼拉德也同样特约作者。

确认

这项工作是由意大利卫生部(Ricerca Finalizzata pe - 2013 - 02356613)和波兰的国家研究和发展中心(没有决定。Pol-Nor / 202 132/68/2013)。

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