文摘

组织血管有效分配营养物质,清除代谢产物,具有选择性细胞渗透组织生长和功能。策划组织模型已经被小卷,有限的低细胞密度和入侵细胞提取由于无效的养分扩散和cell-biomaterial附件。在此,我们描述陶瓷中空纤维膜的制备和测试(HFs)能够独立红细胞(红血球)和单核细胞(跨国公司),并被纳入三维组织模型改善营养和代谢物交换。这些HFs中红细胞表面过滤从人类脐血红细胞表面(CB) 20%的悬浮液产生90%红细胞滤液停课。当合并在5毫升的3 d collagen-coated聚氨酯多孔支架,medium-perfused HFs中保持无毒葡萄糖,乳酸,pH值,高细胞密度超过21天的文化相比,nonperfused 0.125毫升支架。这种中空纤维生物反应器(HFBR)需要一个较小的每个细胞中要求和在细胞密度> 10倍高于目前的2 d方法同时允许连续细胞通过HFs中收获。在此,我们建议HFs中提高3 d细胞培养营养和代谢产物扩散,增加文化体积和细胞密度,不断收获产品转化细胞疗法生物制造协议。

1。介绍

细胞生物制造平台细胞治疗、疾病的造型,和组织再生nonphysiological细胞生长限制,文化建筑,小型生物材料和无效的养分扩散卷,稀疏的细胞密度,和不纯的细胞产品产量(1]。文化的人类细胞在静态液体悬浮和2 d系统一直局限于密度低于5×10⁶细胞/毫升(2)提高在增强营养转移由搅拌釜或摇摆生物反应器提供10⁷细胞/毫升(3]。取得更高的文化密度tissue-mimetic多孔支架的三维结构(4灌注),而中空纤维生物反应器(HFBRs)已达到最高的人类细胞培养密度报道,接近原生的组织(10^{8 - 9}细胞/毫升)[5- - - - - -7]。尽管提供了仿生结构和细胞密度,3 d文化需要终止细胞收获和通常是混合细胞以外的其他血统或成熟阶段所需的细胞疗法或研究[8,9]。虽然HFBRs不断应用于提取病毒细胞产品通过中空纤维过滤(HFs) [10),没有纤维可以选择性地过滤槽产品实现连续3 d文化生物制造。

红细胞(红血球)代表一个细胞疗法临床需求:高红血球的速度需要每天8000血单位在英国每年花费2.5亿英镑(11]。CB-derived红细胞生产表明临床效用对人类输血(12),但仍然受限于自然低生产密度过高介质成本(2]。生理血液生产发生在骨髓(BM)和支持复杂的血管和骨小梁结构密集滋养,multilineal,空间非均匀分布的造血基质细胞(13]。大英博物馆产生数千亿红血球每天占外周血细胞> 95%,但只有< 25%的骨髓细胞,由于一个有效在活的有机体内过滤(14]。渗透骨髓血窦允许出口成熟细胞,成熟的网织红细胞变形通过紧缩缺口(1 - 3μ米)在内皮细胞墙15,16),同时保留跨国公司后代的骨髓。三维多孔支架结合medium-perfused cell-filtering HFs中可以支持组织如细胞密度,概括生理细胞微环境,不断收获红细胞表面类似于大英博物馆(1,6,17,18]。

在此,我们描述了制造sponge-filtering层组成的双层陶瓷HFs和finger-void层可以包含在三维多孔支架tissue-mimetic文化系统。这些HFs中包含一个分布的孔隙大小,平均0.1以上μm,演示了一个无限制的过滤的营养、代谢物和细胞因子,似乎能够运输小细胞(19,20.]。HFs追究他们的表现在无核的红血球的过滤悬浮液CB跨国公司和红细胞表面的三个过滤格式:一个被动shell-to-lumen过滤(“错流过滤”),强制lumen-to-shell过滤(“终端过滤”),和错流过滤格式用于长期灌注中空纤维生物反应器文化在一个3 d支架(“HFBR文化”)。而其他研究制造微流体设备有效的高通量leukoreduction过滤器(21),我们把这些陶瓷HFs中融入三维多孔支架作为灌注平台连续收获细胞过滤。

2。材料和方法

2.1。陶瓷高频制造和表征

陶瓷HFs中捏造了准备1和4的混合物μ英国米氧化铝粉末(VWR Lutterworth) wt / 58.6%v装载密度、wt / 1.3%vArlacel P135(聚乙二醇30-dipolyhy-droxystearate;Uniqema、约克郡、英国),15 ~ 30% wt /vpolyethersulfone (PES) N-methylpyrrolidone (Sigma-Aldrich,多塞特郡,英国)。这是在7 - 10天完成通过铣削用锆球(跨国际、利文斯顿新泽西)和脱气2小时。产生的涂料解决方案是通过管挤压孔喷丝板的外直径3毫米,内径1.2毫米内孔周围流体的水或DMSO (Sigma-Aldrich),掉进了一个浴缸和一个气隙的0到15厘米。八个不同的HFs中被调整的氧化铝粉末,颗粒大小,PES活页夹内容,类型的液体,两孔流体流速和涂料解决方案,spinneret-to-water-bath气隙以及烧结温度在一个装置之前描述(22]。首次筛查纤维结构完整性和形状,然后在高温下烧结形成最终产品之前评估由汞孔隙度入侵porosimetry (MIP)、毛细管流porometry (CFP)和扫描电子显微镜(SEM)。

2.2。过滤和文化平台组装

评估这些过滤陶瓷HFs的效用有核和阐明细胞分数隔绝人类脐带血,三个不同的过滤平台建立了:(1)错流过滤平台终端过滤平台(2),(3)长期HFBR文化平台(如在图所示1)。

在错流过滤(图1(一)),四个HFs中坚持在polyfluoroalkoxy (PFA)细牙螺纹耀斑三通(接头锁紧螺母、伦敦、英国)应用快速干燥的双组分树脂(环氧树脂、巴塞尔、瑞士)反应堆的进口和出口。灌注介质可以入口的反应堆,通过高频腔,出口。

在终端过滤(图1 (b)),一个定制的外壳加工内部从一个PFA杆(ThePlasticShop、考文垂、英国)包含进口和出口倒钩灌注帽和壳释放帽。单个高频是粘在壳牌和阻塞与树脂灌流液出口。油管在收集中流出的壳释放帽。

在长期(图3 d HFBR文化1 (c)),一个高频由水孔液粘在错流过滤PFA壳(接头套管)。解决5%的聚氨酯(聚氨酯;诺誉,布鲁塞尔,比利时)1,4 -二恶烷(Sigma-Aldrich)溶解在一夜之间60°C随后注入5毫升到extraluminal壳空间和随后冻结2小时的−80°C。1,4 -二恶烷是通过热诱导相分离选择性地升华(TIPS)采用真空压力0.01 mbar−15°C留下多孔聚氨酯支架,随后涂上牛胶原蛋白1型(Sigma-Aldrich)彻底沉浸,混合和灌注HFBR磷酸盐(PBS、生活技术,佩斯利,英国),70%乙醇(VWR), 62.5μg / mL牛胶原蛋白1型(Sigma-Aldrich) PBS的pH值7.0最后一个用PBS紧随其后。

细胞接种之前,所有平台被灌注和清洗消毒PBS的壳程,乙醇(2小时)和PBS在多个洗伴随着紫外线杀菌。灌注生物反应器平台相比,是一个静态的聚氨酯支架平台0.125毫升立方体的形式准备,涂布,消毒同样如前所述4]。所有平台然后在细胞培养基条件至少24小时。

2.3。研究批准

研究进行了符合赫尔辛基宣言和接收所需的道德规范和当地的研究批准(参考05 / Q0405/20 London-Harrow nr委员会(英国)。

2.4。CB的隔离和接种

跨国公司分数从采集的新鲜孤立CB (NHS血液和移植,Colindale血库,英国)由Ficoll-Paque (Sigma-Aldrich)收益率大约70 - 80%的跨国公司和无核细胞20 - 30%。过滤实验,细胞被存储在人类血清在4°C 90%接种前10小时,讲述了。CB悬液接种到平台如下列举,和所有的系统模型包括20毫升/小时的速度。(我)错流过滤:3×10⁷细胞/ mL被播种到两个5毫升PFA灌注贝壳和24小时。过滤面积:10 - 12厘米²。(2)终端过滤:5×10⁶细胞/ mL被播种到480毫升水库和灌注成四个平台6小时。过滤面积:0.6 - -0.7厘米²。(3)HFBR文化:4×10⁷细胞/ mL被播种到5毫升的多孔支架PFA灌注壳牌和21天。过滤面积:3厘米²。

HFBR培养基由60毫升回收批IMDM补充30%v/v胎牛血清(的边后卫;生命技术),1%v/v美国马里兰州penicillin-streptomycin(写明ATCC)和100 ng / mL干细胞因子(SCF);研发系统,阿宾顿、英国)。从第二天,回收批交换与1国际单位/毫升新鲜培养基促红细胞生成素(EPO);研发系统)和不自洽场以一个连续0.5毫升/小时的速度从100毫升溶液美联储每周中补充。这个5毫升HFBR灌注60毫升水库的媒介是与nonperfused相比,静态的,0.125毫升collagen-coated聚氨酯支架立方体准备同样在1.5毫升的上层清液培养基培养和交换每2天。

总数量的、可行的和单核细胞数使用血细胞计数器和台盼蓝(干细胞技术,法国格勒诺布尔)或亚甲蓝(干细胞的技术)染料排斥污渍。

2.5。流式细胞术

悬浮液的10⁶细胞沾染了赫斯特33342(300 /毫升μg / mL,热费希尔)和钙黄绿素(2.5μg / mL,热费希尔)PBS 45分钟在室温下,准备根据制造商的规格。与细胞悬浮液然后洗染色缓冲(CSB),下面描述,沾染了鼠标在100年反人类的单克隆抗体μL台网和20μL的边后卫和孵化1小时在4°C详细表1。悬浮液然后洗CSB和PBS和过滤分析之前50000事件LSRFortessa流式细胞分析仪与FACSDiva软件(BD生物科学)。荧光染料检测溢出是补偿与single-stain控制相比,和积极的标志检测与同形像和清白的控制加工使用FlowJo版本10.0.8(树明星,亚什兰,俄勒冈州)。

CSB wt /准备通过增加1%v牛血清白蛋白(BSA);wt / Sigma-Aldrich)和0.01%v南₃(Sigma-Aldrich) PBS。

2.6。共焦显微镜

评估可行性,冷冻纤维或反应堆部分立即孵化在4 37°CμM ethidium homodimer-1(表达载体)和2μ米钙黄绿素为1小时(表达载体)的培养基紧随其后洗PBS和成像在徕卡SP5直立共焦显微镜与徕卡LAS AF软件(徕卡,米尔顿凯恩斯,英国)。

评估细胞类型,冻结部分准备类似如前所报道(23]。简单地说,部分都被立即固定wt / 4%v多聚甲醛溶液(Sigma-Aldrich) PBS为12小时,permeabilised 0.1%v/v特里同x - 100 (Sigma-Aldrich)共焦显微镜污点缓冲区(人们,下面描述)2小时,和阻止了10%v/v驴血清(AbCam,剑桥,英国)人们对4个小时在4°C,紧随其后的是一夜孵化与初级抗体或同形像控制在4°C CSMB详细表1,潜伏期长达6个二级抗体在人们在4°C,一夜孵化在1:200年核(DAPI,生活技术),和1:1000质膜(CellMask红、生活技术)复染色在PBS溶液,然后存储在wt / 0.01%v南₃在PBS溶液在4°C。由多个15分钟每一步分离洗涤步骤适当的缓冲。部分被成像在徕卡SP5反向共焦显微镜如上所述。获得图像中操纵数据通过调整对比度和亮度样本和负(同形像)控制相同。

人们含有1% wt/ vBSA, 0.5%v/vTween-20, 0.01% wt /v南₃在PBS。二次抗体包括驴antirat Alexa萤石488和驴antirabbit Alexa萤石555 1:1000稀释(热费希尔)。

2.7。扫描电子显微镜

立即冻结部分被固定为3%v/v戊二醛溶液(Sigma-Aldrich)索伦森的缓冲区(在下面描述)至少12个小时。部分被洗两次与索伦森的缓冲和后缀wt / 1%vOsO₄(Sigma-Aldrich)索伦森的缓冲一个小时后跟两个洗在同一个缓冲区。部分被脱水在越来越绝对乙醇稀释梯度与索伦森的缓冲区为0.067 M, pH值7(50:70:90:10,95:5 - 100:0次),其次是进一步干燥hexadimethylsilazane梯度的增加(Sigma-Aldrich)绝对乙醇(70:90:95:5,100:0次,Sigma-Aldrich)和风干一夜之间。溶剂蒸发后,部分被坚持SEM存根和碳带(电子技术、斯坦斯特德、英国),sputter-coated用金(20 mA, 30年代)成像在房子前- 6010扫描电子显微镜(扫描电镜;乔尔,英国Watchmead)。索伦森的缓冲区被滴定的解决方案准备0.067 Na₂HPO₄与0.067 KH去离子水₂阿宝₄在去离子水(Sigma-Aldrich)直接使用前pH值为7。

2.8。胞外代谢物和蛋白质分析

灌注HFBR媒介收集从我家的龙头(史密斯的医疗,沃特福德,英国)后立即直接在进入和离开HFBR。细胞外营养物质和代谢产物、pH值和溶解气体分析使用BioProfiler化学分析仪(新星生物医学、道、英国)和平均/ 3相同的复制。

3所示。结果

3.1。逆相生流体控制陶瓷纤维微孔结构

8个不同类型的陶瓷HFs中通过步骤制造涂料的制备、纤维挤压、逆相,通过调整涂料和烧结氧化铝粒子大小和PES粘合剂组成,孔液、涂料和孔流体流量,烧结温度。涂料和孔流量选择维持稳定的纤维挤压;否则,这些参数是不同的放大沿纤维平均孔隙尺寸的外表面,代表细胞filtration-limiting孔隙大小,从0.2到2μ米,内表面的平均孔隙尺寸从0.35增加到11.5μ从45米,增加高频峰值80%。在制造参数检查(图2(一个)内孔),选择液体最重要的纤维孔隙度的影响,其次是spinneret-to-water-bath气隙距离,而增加4%v/v乙醇或改变最大的烧结温度没有明显差异(图2 (b))。观察纤维横截面(图3)展示了卫星传回的孔隙内形成一个曲折的陶瓷海绵的直径、长度和频率也主要依赖于液体和空气间隙距离。

使用溶剂(DMSO)孔液代替水产生较大的外表面孔隙大小,内表面孔隙大小、孔隙度和纤维(纤维1:0.18μ0.43米,μ0.62 m, 62%纤维5:μ5.04米,μ米,80%)。纤维旋转DMSO孔流体包含较大的孔隙尺寸和孔隙度(纤维5 - 8:2μ11.77米,μ米,80%)。最大的孔隙大小,在纤维6中,导致结构不稳定的纤维,它只能在大直径装配式防止过滤。纤维结构可以稳定增加PES粘合剂浓度导致更大的外表面孔隙大小(纤维7:1.84μ7.28米,μ米,71%;)。纤维8中的使用较大的粒径增加限制孔隙直径:从2.5倍(7)纤维4倍(8)纤维与纤维相比1和5的毛细管流porometry(图3)。

从八纤维成功制作,4代表纤维(纤维1、5、7、8)被选为进一步检测对细胞从八纤维过滤成功伪造。纤维2、3和4是消除因其相似性纤维1、5、7(图2)。纤维6是消除由于其大直径相对于生物反应器的壳。然而,纤维的孔隙结构7和8无法过滤器堵塞和断裂纤维细胞和引起平台7(在0.5 h)和纤维8 (2 h后)在终端过滤。纤维1和纤维5成功筛选细胞在两种平台上进一步被描述为“水纤维”和“DMSO纤维”,分别。

3.2。错流过滤丰富阐明细胞分数

错流过滤在DMSO纤维发生在一个八大率与水纤维(图4(一)、表2)。然而,DMSO纤维为无核细胞选择性降低了11%(图4 (b))。可行的水过滤纤维细胞数量的增加在整个时间点取样,而DMSO纤维在活细胞数量减少收集在连续时间点。过滤后的细胞生存能力从90%下降到60%之间的5和24小时的过滤纤维,可能由于高频毛孔污垢。错流过滤浓缩红细胞表面30%的接种悬挂无核的92%(水纤维)或81% (DMSO纤维)滤液阐明细胞悬架。流式细胞术证实阐明CD235a⁺红细胞表面分离从跨国公司错流过滤(补充图1、表2)。

24小时后过滤,纤维切片共焦显微镜,观察和更多的跨国公司在DMSO纤维与水相比,纤维。细胞出现可行,并表示仍在HFs钙黄绿素(图4 (c))。不到1%的细胞包含在水纤维表达CD235a CD61、而DMSO纤维含有更多的细胞表达血小板CD61标志(图4 (d))。

3.3。终端过滤过滤大量无核红细胞

终端细胞过滤发生至少600倍的速度和错流过滤,这是类似的纤维类型(图5(一个)、表2)。终端过滤浓缩红细胞表面19%的接种悬挂无核的84%(水纤维)或81% (DMSO纤维)滤液阐明细胞悬浮,98%的无核细胞表达红细胞CD235a表型(图5 (b);表2)。而过滤单元可行性仍> 97%的前4小时过滤、细胞的可行性被水过滤纤维在6小时下降到83% DMSO纤维维持在99%,与细胞成像在水纤维(图5 (c))。

纤维成像的终端过滤长达6表明,大量的有核细胞内保持水和DMSO纤维类型。细胞成像的可行性在终端过滤的过程中明显小于错流过滤,特别是对于水纤维,具有更高的表达ethidium homodimer-1(图5 (c))。对纤维、小细胞可以abluminal纤维表面成像后过滤(图5 (d))。更多的细胞在错流过滤仍在DMSO纤维、终端过滤促进类似的滤过率对纤维(图5 (e)),CD235a⁺阐明和有核成红血球细胞可以通过横在过滤的过程中发现部分DMSO纤维(图5 (f))。

3.4。连续纤维灌注增加营养交换和细胞增殖的三维多孔支架

灌注HFBR保持一个更加稳定的细胞外葡萄糖,乳酸,和pH值超过21天与静态的文化相比,表现出有毒的pH值和乳酸水平的文化(pH值7.1,乳酸> 20毫米;图6(一))。回收利用的营养物质和代谢产物进入HFBR多样的进口和出口< 5%浓度,标志着灌注快速地近似拟稳态条件。HFBR补充了一半的数量每接种细胞和介质静态文化和3.3毫升(1.56毫升每10超过21天的文化⁶CB跨国公司)。而4×10⁷细胞接种/毫升,21天后只有1.5×10⁷细胞/毫升可以手动的吸气HFBR文化和10⁷从静态的文化细胞/毫升,而额外的10⁶细胞内收集HFBR-perfused中(图6 (b))。

成熟红细胞内表型CD235a成像HFBR和静态文化由20 - 28%的吸气细胞内容,分别为(图6 (c))。细胞观察高频(图的侵犯6 (d))与无核的红血球(CD235a⁺DAPI⁻)在灌注介质(图中发现6 (c))。原位,HFBR细胞由小球形红细胞形态除了大,扩散,附着形态(图6 (d))。这些细胞原位表达c - kit, CD36 EPO-R、CD71, CD235a表型表现出不同程度的红细胞成熟(24),以及osterix (OSx)和骨桥蛋白(OPN)成骨和CD31内皮细胞表型增强造血功能(25),稳态特性和multilineal HFBR红细胞生成(补充图2)。

4所示。讨论

我们制造陶瓷HFs中,改善营养和代谢产物扩散,不断收获细胞产品毫升范围内三维多孔支架的文化。这手稿研究不同的影响高频加工参数对微尺度孔隙度、CB细胞过滤,和阐明细胞分离和合并成一个三维多孔支架作为HFBR。可以过滤的主要结果表明HFs细胞率高于10⁸/ h的孔隙度可以通过调优在制造分离不同的细胞类型。HFBR文化展示一个更稳定的代谢轮廓尽管扩大细胞密度更大的体积大于nonperfused 3 d的文化。

两个工业相关应用程序存在进一步高频发展:leukoreduction血样和连续长期3 d造血细胞产品收获从文化。当前临床标准leukoreduction是一次性的,终端过滤器,减少外周血从10的一个单位^{8 - 9}到10^{6 - 7}残余白细胞,类似的(≥99%)的效率被最近通过微量过滤平台(21]。虽然HFs中只能终端分离效率达到97%,过滤悬浮液中含有更大比例的单核阐明细胞(5:1),比标准外周血造血文化更贴近当前leukoreduction(1: 1000),在更高的跨国公司内容可能会导致污染。这些leukoreduction方法,高频过滤器可以在长期内独特的结合3 d文化过滤养分和细胞(19,20.,26]。

陶瓷和主要特征在纳米聚合物HFs和反渗透过滤平台化学分离(27- - - - - -30.)或在哺乳动物细胞HFBRs分离病毒和抗体产品(7,10,31日- - - - - -36]。到目前为止,没有研究调查的角色HFs中微尺度分离的细胞分数。这里,我们开发了陶瓷中空纤维用于红细胞表面分离从CB跨国公司停业(加拿大皇家银行分离效率19% - 90%)的速度每小时十亿细胞。虽然有效地操作低于当前leukoreduction过滤器(21),这些HFs中能够被集成到长期CB三维多孔支架生物反应器来提高灌注和唯一允许连续细胞收获。尽管如此,高频和HFBR制造参数必须进一步优化限制污垢在过滤和提供可行的细胞产品收获来自HFBR文化,而高频介质的影响灌注HFBR文化动力学特征。

4.1。工艺参数对高频结构和过滤的影响

提出参数高频制造的各种各样的孔隙大小、结构、参数和过滤效率,影响纺丝机制和逆相似乎特别敏感36]。在旋转,液体渗透高频膜,形成大型卫星传回的陶瓷结构的空隙中停止接触后水浴阶段反演。因此,改变了液体或飞行时间喷丝头和水浴(气隙距离)之间产生毛孔不再像手指一样的空虚:减少曲折而且纤维的结构完整性。

纺丝纤维在DMSO孔流体产生平均外孔隙大小限制在1 - 2之间μ米,接近那些网织红细胞出路在骨髓中发现窦内皮(2 - 3μm;(37])与平均孔隙尺寸的限制纤维纺使用水作为流体(0.2 - -0.4μm;图2)。然而,这些大毛孔经常呈现纤维结构不稳定(6)纤维和其他人使用包含一个曲折的海绵层没有像手指一样的空洞,使细胞通道,导致断裂纤维(7和8)。因此,稳定和曲折而不是孔隙大小成为细胞过滤的关键因素,并使用纤维细胞只能过滤均匀光滑像手指一样的通道空间。我们滤液产量可能进一步增加如果孔隙尺寸较大的纤维可能是捏造的,但严格控制孔隙大小分布必须实现不稀释滤液纯度。

完全,最好的孔隙大小是由在DMSO溶液纺丝纤维孔而少曲折的手指毛孔周围产生水了。因此,我们建议使用混合了水和DMSO溶液纺丝纤维结合以达到1 - 2厘米的气隙长手指孔隙层和短的海绵层,同时保持结构可用纤维。此外,我们建议制作纤维使用两个不同粒径利用本(1和4μm)增加平均孔隙大小同时提高孔隙均匀性类似通过谭et al。38]。一旦达到一个最佳高频结构,进一步functionalisation表面改性和化学强化可以测试提供选择性细胞吸引和防止细胞粘附和污染39,40]。

4.2。实现长期的过滤

小平均孔隙尺寸的纤维没有禁止通过细胞,但可能有限过滤效率尤其是通过污染。两厘米的陶瓷纤维过滤每小时近十亿红血球尽管平均孔径小于1μm。尽管MIP只提供平均孔隙大小,我们在孔隙大小在成像过程中,视觉上观察到的变化和细胞很可能成功egressed通过孔隙大小的看法,虽然比细胞被困和堵塞毛孔。

在错流过滤,larger-pore DMSO纤维(纤维5)过滤更多的细胞比水纤维(纤维1)较低的无核的选择性。然而,DMSO纤维过滤先后进行速度较慢,随着时间的推移,暗示更大的更大数量,有核细胞成像在DMSO纤维可能被困和犯规纤维过滤。在终端过滤、大毛孔内高频表面可能允许更多的细胞进入,无法通过较小的外表面毛孔,被困在纤维壁导致减少原位成像的可行性。而细胞可以通过纤维成像过滤后21天HFBR文化、数量小得多的细胞中发现了HFBR滤液相对于那些吸气,表明虽然小孔隙大小没有禁止通过细胞,在长期的文化过滤可能受到阻碍。

切向流过滤是一种很有前途的过滤格式限制细胞污染主要经历在abluminal高频表面,提高长期的细胞分离和生存能力。然而,切向流过滤可能提供贫穷短期收益率与终端过滤(相比41],它能够过滤1×10的暂停⁸阐明细胞混合5×10⁸跨国公司(后者是相当于一个CB跨国公司单位)在6小时内,同时保持高(> 90%)细胞的可行性。因此,终端过滤是足以CB细胞分离。此外,切向流过滤单元需要细胞流动相的一部分,不像错流过滤和HFBR文化有关。

4.3。高频灌注3 d文化在长期的好处

推广HFBR平台展示了高频灌注改善营养扩散,代谢物清除、细胞扩张文化终止,同时允许连续细胞产量在文化过滤。HFBR操作在40倍增加支架体积(5毫升灌注HFBR和0.125毫升nonperfused立方体)和包含只有一个高频时更多的体积可以合并在一个类似的支架。即便如此,一个高频的平台展示了灌注减少有毒代谢物积累在静态脚手架文化。这些有毒代谢物可能阻止了细胞在两种文化的扩张,对静态文化展示一个更大的影响。养分扩散和清除代谢废物的长期(21天)是至关重要的文化,而不是短期(≤1天)过滤实验,提供过度的介质和错流高频传输的葡萄糖和乳酸无限制(每4×10的高频渗透率⁻⁵厘米/秒)(19,20.]。细胞密度和扩张在21天的愿望,不得占附着细胞原位成像。而红细胞表型CD235a表示在HFBR送气音原位成像,过滤后的细胞没有发现明显的表达,表明HFBR细胞内容不够包装促进红细胞重要出口。

之前的研究利用静态三维文化接种2×10⁷CB 54-fold跨国公司/毫升,28天扩张cytokine-free条件但导致有限(10%对20%)CD235a成熟的文化(4]。此外,在HFBR文化接种10⁹CB跨国公司/毫升10毫升支架内卷,这是包括在相同的流速与类似的媒介,在31天34倍扩张获得生产10¹⁰只有5%表示CD235a吸气细胞[19]。相比之下,目前的2 d hematopoietic-erythroid大规模放大(-)文化可以达到> 10⁵生产扩张,90%阐明CD235a红细胞表面,适合人类输血(2,12]。然而,这样的CB CD34 -文化接种罕见⁺跨国公司扩大的密度下5×10⁶细胞/毫升。-文化需要大量的媒介,昂贵的细胞因子浓度异常高,生产成本1 - 2个数量级以上捐赠RBC单位成本(2,20.,26]。最近描述永生成红血球细胞线可以减轻细胞来源的局限性提供了无限的红细胞生成(42),而媒介需求和红细胞收获可以更加经济可行的使用提出了HFBR生物工艺策略,在CD235a去核率将是未来研究的一个关键参数。

造血细胞增殖和分化的微环境控制在活的有机体内由骨髓血管营养和生长因子分布信息以及cell-matrix利基相互作用[16,37,38]。的效用在体外细胞微环境变得更好的理解通过decellularised支架组成的细胞外基质蛋白(43]。此外,骨髓出口被认为援助红细胞成熟通过重组膜蛋白(15),压力由窦血流量和紧孔隙几何图形提供机械刺激。借鉴了这一过程的各个方面在体外机械的研究和生产其他类型的细胞,例如从巨核细胞血小板剥夺了骨骼的正弦墙(44,45]。进一步HFBR发展探索平台几何形状的影响,流量、介质成分、和细胞培养液形成微环境改善红细胞的生成。

5。结论

总之,使红细胞表面的连续过滤CB微孔陶瓷HFs和可以合并在3 d文化平台来提高养分扩散增加细胞密度,使连续细胞收获过滤。两种操作模式使用陶瓷纤维与不同的目标:实现错流过滤的被动红细胞在更高的细胞的异常和终端过滤分离超快的和有效的红细胞分离。整合成一个陶瓷HFs CB-inoculated, 21天的三维多孔支架生物反应器改进营养扩散在使用更少的介质,增加终端CB密度,并允许连续细胞收获。我们建议这些HFs中作为更高效的生产工具生理相关的细胞疗法生物过程。

信息披露

马克·c·艾伦比和Asma Tahlawi应该考虑的第一作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

马克·c·艾伦比和Asma Tahlawi这项研究同样起到了推波助澜的作用。

确认

支持这项工作ERC-BioBlood(没有。340719),理查德。托马斯白血病基金Northwick公园医院白血病研究基金,和一个帝国理工学院化学工程奖学金马克c·艾伦比和Asma Tahlawi沙特阿拉伯国家石油公司提供的奖学金。作者斯蒂芬•Rothery感谢大卫•Gaborieau黛博拉·凯勒和帝国理工学院的Andreas Bruckbauer核心电影设施,罗伯特gedik PFA外壳加工,雨果马赛和玛丽亚仁德为有用的讨论。

补充材料

补充图1:跨国公司retainment错流过滤。osteogeneic,补充图2:表达造血和内皮标记内的脚手架地区天21 HFBR横截面。(补充材料)