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干细胞国际
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干细胞国际/2018年/文章
特殊的问题

间充质干细胞在癌症、药物输送和再生医学

把这个特殊的问题

研究文章|开放获取

体积 2018年 |文章的ID 6134787 | https://doi.org/10.1155/2018/6134787

伊夫Lecarpentier,奥利维尔·Schussler Antonija Sakic, Jose Maria Rincon-Garriz Priscilla Soulie, Marie-Luce Bochaton-Piallat,文森特Kindler, ”人类骨髓含有间质基质干细胞体外分化成收缩Myofibroblasts控制T淋巴细胞增殖”,干细胞国际, 卷。2018年, 文章的ID6134787, 15 页面, 2018年。 https://doi.org/10.1155/2018/6134787

人类骨髓含有间质基质干细胞体外分化成收缩Myofibroblasts控制T淋巴细胞增殖

伊夫Lecarpentier,1 奥利弗Schussler,2 Antonija Sakic,3 何塞玛丽亚Rincon-Garriz,4 普里西拉Soulie,5 Marie-Luce Bochaton-Piallat,3 和 文森特Kindler4

1友谊医院中心精选的倩碧,大是Francillien, 77104年禁令试行期,法国

2心血管外科学系,研究实验室,大学医院、医学院、瑞士日内瓦

3病理学和免疫学、医学日内瓦医学院大学医疗中心,瑞士日内瓦

4服务部门的专业医学、血液学、日内瓦大学医院、医学院、瑞士日内瓦

5组织学、日内瓦医学院医学大学医疗中心,瑞士日内瓦

学术编辑器:Somayeh Shahrokhi
收到了 2017年11月23日
修改后的 2018年2月20日
接受 2018年3月08
发表 2018年4月29日(

文摘

间充质间质干细胞(MSC),驻留在体外骨髓(BM)可以被放大。在进行(D)文化,MSC表现出形态与成纤维细胞相似,能够抑制T淋巴细胞和自然杀伤细胞增殖,并且可以分化成脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞如果暴露于特定的媒体。在这里,我们表明,medullar MSC在二维培养形成的附着基质细胞表达包含组织良好的微丝骨架α光滑的肌肉肌动蛋白和nonmuscle肌凝蛋白重链活动花絮。MSC可以种植在胶原膜生成3 d结构,在博览会50 mM氯化钾或交变电流,开发出一种收缩强度,平均34和45μN /毫米2,分别。这种机械张力是相似的强度和持续时间的人类胎盘和由硝酸异山梨酯或2湮灭,3-butanedione单肟。膜缺乏MSC并未表现出显著的收缩性。此外,MSC嵌套在胶原膜能够控制T淋巴细胞增殖和分化成脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞。我们的观察表明,胶原蛋白膜BM-derived MSC培养自发分化成收缩myofibroblasts表现出意想不到的性质而言,细胞分化的潜力和免疫调节功能。

1。介绍

间充质间质干细胞(MSC)可以从几乎任何生物体外扩增后的血管组织与媒体补充胎牛血清,血小板源生长因子(PDGF),或人类血小板溶解产物(HPL) [1- - - - - -4]。体内的标识对应的MSC,而难以实现,因为MSC前体稀缺体内(5,6]。因为这个原因在体外扩增MSC之前通常需要任何调查。以来的平均倍增时间MSC源自BM和PDGF培养4天(6),细胞在章节2 - 3(即调查。,20.days after seeding) have already achieved a significant number of mitosis in vitro and maybe biased compared to their in vivo counterpart. Nevertheless, there is now a growing consensus based on similarities in cell surface marker expression and in biological functions that MSC are derived from pericytes and/or adventitial cells that encircle the microvasculature of vascularized organs and tissues [7- - - - - -9]。媒体用来放大MSC在体外包含各种生物活性因素包括转化生长因子-β(TGF -β)、PDGF基底纤维母细胞生长因子和胰岛素样生长因子- 1显示在特定情况下促炎的特征。特别是TGF -β发布和PDGF在血小板活化参与迁移的静止的周炎症网站分化成myofibroblasts并提供一个治疗活动(审查,看10- - - - - -12])。尽管实现所需的环境MSC在体外扩增有相似之处,观察体内组织损伤后的周被激活时,大气中的氧气产生的氧过多,人造塑料表面缺乏关键的粘附分子,和重复的热冲击和trypsinations可能偏见细胞分化与体内的情况。获得的细胞在体外扩增后塑料附着,延长静B和T淋巴细胞的生存,并分化成各种间充质血统如果暴露在适当的刺激。此外,当接触到一个额外的炎症刺激等γ干扰素(γ干扰素),MSC预防T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞增殖13- - - - - -15),从而证明消炎。关于人类的MSC,调节T细胞控制的一个主要因素是酶吲哚胺2,3-dioxygenase (IDO),这削弱了必需氨基酸色氨酸(tryp) L-kynurenine (kyn) [16- - - - - -19]。被罩是全酶含有一个函数只有当血红素亚铁血红素亚铁形式减少了未知的代数余子式(20.]。因此,被罩信使rna或蛋白质的检测并不能证明酶功能;相反,产品的检测代谢的酶(即。kyn)这样的索赔要求。我被各种促炎的因素包括激活在MSCγ干扰素,它提供的炎症过程的早期激活T淋巴细胞和NK细胞(见[18])。lDO会降低tryp到了这样一种程度,T淋巴细胞、B淋巴细胞,NK细胞增殖,其起始和维持依赖tryp浓度,防止或逮捕[16- - - - - -19]。

Myofibroblasts收缩细胞最初发现在皮肤21]。他们表达α光滑的肌肉肌动蛋白(αSMA)和nonmuscle肌凝蛋白重链活动花絮(NMMHCIIA)都需要实现细胞收缩。在损伤发生,myofibroblasts合成细胞外基质蛋白质和回缩,这有利于治疗和伤害的决议(22]。此外,一些myofibroblasts展览消炎物质,也可能有利于损伤决议通过关闭不适当的延迟免疫反应(23]。的祖先myofibroblast还没有完全确定。纤维细胞、周、成纤维细胞和组织居民都尽可能地指出这些细胞的祖细胞(24,25),最近MSC来源于新生儿肺表达基因档案已被证明符合myofibroblast祖表型(26),进一步强调MSC和myofibroblasts之间的相似之处。因此调查myofibroblasts是否感兴趣的可以从组织如骨髓生成,通常用于生成MSC。

为了做到这一点,我们设计了一个3 d的文化系统,允许维持细胞生物相容性的脚手架在较长一段时间,和我们开发了特定的设备来测量细胞所产生的机械强度固定支架。MSC来自BM, HPL作为生长因子,6毫米直径补丁的支架由商用牛胶原蛋白膜。

我们展示这些文化条件下,MSC表达标记相同的2 d的文化包括αSMA和NMMHCIIA,细胞收缩和开发一个巨大的机械张力时接触到相关的刺激。此外,一旦居民膜,MSC分化成各种mesenchymatous血统和维持他们的能力发挥强有力的控制对T细胞增殖。因此MSC体外扩增MSC和myofibroblasts展览功能,它允许怀疑这些细胞是亲密的父母。

2。材料和方法

2.1。反应物
2.1.1。细胞因子和化学物质

1,4-Dithio-DL-threitol(德勤)3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)、吲哚美辛(印度),丙酮酸,L-ascorbic酸2-phosphate,地塞米松,胰岛素,chondroitinase-ABC钠β甘油磷酸盐(β全科医生)和抗坏血酸(AsA)来自Sigma-Aldrich化学GmbH, Schnelldorf,德国。L-Ascorbic acid-2-phosphate(尽快)和光纯化学工业,购自kouichi有限公司(日本大阪),1,25 (OH)2维生素D3 (vitaminD3) BIOMOL(普利茅斯会议上,MA)和三试剂分子研究中心(辛辛那提,哦)。+胰岛素,转铁蛋白,亚硒酸、牛血清白蛋白和亚油酸预混料(其)来自BD生物科学,圣地亚哥TGF - CAβ从研发系统。汉克的平衡盐溶液(hbs),罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI) 1640中、Iscove修改杜尔贝科的介质(IMDM)和penicillin-streptomycin trypsin-EDTA解决方案来自Gibco BRL,佩斯利,英国。5(6)羧基荧光素二醋酸盐,succinimyl酯(CFSE)从分子探针欧洲BV,荷兰莱顿。胶原酶II型和4 ,从Sigma-Aldrich 6-diamidino-2-phenylindole盐酸盐(DAPI)。3,3 -diamino-benzidine发色团是DakoCytomation斯特鲁普,丹麦。Streptavidin-peroxydase工具包(Vectastain, ABC装备,BA2000)从矢量实验室、伯林盖姆,CA,和3,3 -diaminobenzidine tetrahydrochloride二水合物(涂)丙烯酰胺化学。

2.1.2。抗体

(1)FITC标记。Anti-CD54(克隆15.2鼠标(m) IgG1)和anti-CD31(克隆158 - 2 - b3 mIgG1)来自Ancell Corp . Bayport, MN, anti-CD45(克隆J33 mIgG1)来自Immunotech,马赛,法国,anti-CD90(克隆5 e10 mIgG1)来自BD生物科学,圣地亚哥,anti-HLA-ABC从BD(克隆g46 - 2.6 mIgG1)是生物科学。

(2)RPE标记。Anti-CD3-RPE(克隆UCHT-1, mIgG1)从Ancell Corp . anti-CD34(克隆8 g12 mIgG1)来自BD生物科学,anti-CD105(克隆SN6 mIgG1)来自AbD Serotec,牛津大学,英国anti-CD146(克隆P1H12 mIgG1)来自BioLegend,圣地亚哥,CA, anti-HLA-DR(克隆581 mIgG1)来自BD生物科学。

(3)APC标记。从eBioscience Anti-CD44(克隆IM7 mIgG2b), anti-CD56(克隆AF12-7H3 mIgG1)是从Myltenyi研究,和anti-CD140b BioLegend (18 a2 mIgG1克隆)。

(4)无标号。反αSMA(克隆1 a4 mIgG1)是(27]。

(5)单克隆同形像控制。FITC、PE和biotin-labeled mIgG1, biotin-labeled mIgG2b来自Dako, biotin-labeled mIgG2b来自Ancell,和无标号mIgG1 BioLegend(克隆MOPC-21)。

(6)多克隆抗体。Anti-SMMHCs类型1和2兔多克隆免疫球蛋白(bt - 562)从生物医学技术有限公司,斯托顿,MA, anti-nonmuscle肌凝蛋白重链活动花絮(NMMHCIIA)从Sigma-Aldrich兔多克隆免疫球蛋白g (MYH9)。

(7)二级抗体。FITC-conjugated山羊anti-mIgG2a和rhodamine-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白作为二次抗体来自分子探针。

2.2。MSC净化、放大和体外分化
2.2.1。净化

细胞在2 d文化准备和放大之前报道(6]。股负责人期间,收集了髋关节置换手术干预,根据当地伦理委员会的指导方针后,病人的知情同意。短暂,脂肪浆刮骨股头被释放的勺子状刮匙和存入50毫升猎鹰管包含汉克的平衡盐溶液。骨头碎片被允许接受几分钟,和细胞悬液在新管转移。沉积过程是重复一次。然后收集样本,红色细胞与低渗的NH细胞溶解4Cl解决方案,有核细胞数纽鲍尔血细胞计数器。一百万的生活(台盼蓝排斥)细胞分布在100毫米直径包含10毫升的RPMI培养皿中补充5% HPL和肝素。这导致了最终的浓度2.5 ng / ml的TGF - 6βPDGF 0.5 -1.5 ng / ml, 4.5 - -9.5 pg / ml基本成纤维细胞生长因子(βFGF,也称为FGF-2)和5.3 - -6.5 ng / ml的胰岛素生长因子(IGF)等(3,28]。48小时后,不依从细胞被淘汰和文化是美联储直到subconfluency最初的媒介。细胞被trypsinated(通道1)和播种105/ 100毫米直径培养皿(对应1.3×103细胞/厘米2)和生长,直到一半融合(4×103/厘米2)。文化通过4被用于实验。

2.2.2。MSC在胶原膜播种

小缸Avitene™Ultrafoam™胶原止血剂(英国诗人有限,Crawley ref。1050050, 20 - 200μ米孔径,牛真皮胶原蛋白I型)被冲得到商用膜湿润与PBS无菌皮肤活检的6毫米直径(特格拉Miltex费舍尔科学)。每个标本,此后称为“膜”,浸泡至少24小时RPMI 5% HPL含有肝素。膜被放置在一个无菌纱布,105MSC在10μl是微妙地沉积在其上表面。细胞被允许穿透补丁1小时在37°C。膜转移在井24-well培养板,包含500μl的媒介。交换媒介是每周两次。

(1)膜表面测量。湿膜加载或不与MSC是拉登和拍摄无菌培养皿的地下室和4毫米网格2方格。使用方形网格,每个膜测定的最大和最小直径。这些值被转换在毫米,一个是乘以另一个获得近似的膜表面。

(2)MSC。膜从培养瓶中取出,转移在埃普多夫锥形管包含1毫升的汉克斯平衡盐溶液(hbs),并与哈佛商学院洗两次。消化于1000年进行μl(哈佛商学院的溶液CaCl补充3毫米2和125 U /毫升胶原酶II, 10分钟37°C,并有很强的涡流每隔5分钟,或者直到全部溶解的膜。然后细胞悬浮液离心10秒钟全速Hettich表离心机和丸resuspended在100年μl (RPMI 10% FCS前细胞和血细胞计数器计数。

2.2.3。MSC在体外分化

(1)Chondrogenic分化。Chondrogenic分化是诱导如前所述29日]。四天播种后,膜转移在无血清DMEM 1% +,丙酮酸1毫米,37.5μ10 g / ml L-ascorbic acid-2磷酸盐−7M地塞米松,10 ng / ml TGF -β。细胞培养2至4周,每3天与介质的变化。膜在4%多聚甲醛固定,嵌入在石蜡,切成5微米厚的部分。部分是沾染了戈德纳的解决方案。膜RPMI + HPL被用作-文化的控制。

(2)脂肪形成的分化。脂肪形成的差异化是根据(5]。MSC播种,4天后,膜在感应中组成的低葡萄糖孵化DMEM (1 g / l), 10μ10 g / ml胰岛素−6地塞米松,5×10−4M IBMX, 10−4吲哚美辛。48小时后,这种媒介被淘汰,取而代之的是维护中组成的高葡萄糖DMEM (4.5 g / l), 10%马血清(HS)和10−6地塞米松48小时。这个循环重复3次。膜被培养在维护中,直到分析。建立了二维文化同时作为3 d文化和提交给脂肪形成的脂肪细胞分化过程中确定最佳时间检测膜。一般脂肪细胞中检测到2 d文化分化诱导后3周。一旦出现脂肪细胞的2 d文化被确认,相应的膜被冻存切片机切片,和沾油红O。

(3)成骨细胞的分化。成骨细胞的分化是根据(30.]。四天之后膜播种、媒介转移到DMEM辅以10×10−710 M地塞米松,−2米β全科医生,5×10−5M尽快为3周。膜,然后嵌入在石蜡,切成5微米厚的部分染色茜素红S之前。

2.3。监管活动的MSC在同种异体的T淋巴细胞增殖

从外周血CD3 + T淋巴细胞获得健康的捐赠者后Ficoll-Paque梯度和消极的选择(Dynal生物技术ASA,奥斯陆,挪威)和与80 nM CFSE标记(31日与同种异体的MSC coculture之前)。MSC被播种在5×104500年24-well细胞板μl (RPMI HPL补充5%,肝素化验前24 - 48小时之内。媒介取代新鲜的RPMI包含10% FCS 5×104同种异体的T淋巴细胞/。另外MSC-laden或空膜转移到包含新鲜RPMI井,FCS, 5×104同种异体的T淋巴细胞。Cocultures补充了珠子涂布和anti-CD3 anti-CD28抗体(a3-28) (Dynal生物技术)的比率0.5珠子/ T淋巴细胞播种。细胞增殖是由流式细胞术评估5天后coculture MSC。

2.4。左旋色氨酸和L-Kynurenine检测

Tryp和kyn浓度测定中描述(32,33),分别。Tryp由荧光决定了文化的接触甲醛和FeCl后上层清液3闪烁磅970板荧光计(瑞士Regendsorf Berthold技术) 和 。Kyn决心文化上层清液的吸光度在490 nm Vmax ELISA板读者(分子设备公司,门洛帕克,CA)与三氯乙酸沉淀后与埃利希试剂孵化。

2.5。XTT化验

XTT试验执行根据制造商的指示。膜从各种孵化项目在4°C被安置在24-well包含200个盘子μl新鲜的RPMI补充HPL和肝素。100年μl XTT(2,3 -二- (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl) 2 h-tetrazolium-5-carboxanilide)被添加到每个包含一个膜。两个小时孵化后37°C, 200μ上层清液被l和吸光度测定 使用ELISA板读者提供参考 。膜被清洗和拍照,然后恢复文化。

2.6。免疫荧光和免疫组织化学
2.6.1。免疫荧光

MSC在RPMI 1%多聚甲醛固定20分钟(PFA), 2%的玫瑰,在PBS冲洗,孵化5分钟前在甲醇−20°C与反染色αSMA (34]。或者细胞被固定在乙醇30秒和沾anti-SMMHCs或anti-NMMHCIIA。整个膜固定45分钟在PBS PFA 1%,进一步在PBS冲洗,孵化15分钟前在甲醇−20°C与反染色αSMA。在某些情况下幻灯片被固定在乙醇1分钟和沾anti-SMMHCs或anti-NMMHCIIA。幻灯片是安装在缓冲聚乙烯醇。

2.6.2。免疫组织化学

膜固定在4% PFA,嵌入在石蜡,切成5微米厚的部分。免疫染色的αSMA、SMMHCs NMMHCIIA进行描述(34,35]。部分暴露在微波辐射(750 W, 5分钟)在柠檬酸缓冲(10毫米,pH值6.0)αSMA和高压锅(3分钟)柠檬酸缓冲SMMHCs和NMMHCIIA。山羊anti-mouse——或者anti-rabbit-biotinylated免疫球蛋白作为第二抗体。可视化,streptavidin-biotin过氧化物酶复杂和3,3 -diamino-benzidine发色团工作。Hemalun用作对比染色。

双重免疫荧光染色石蜡部分也进行(34]。幻灯片暴露在微波辐射(250 W, 20分钟)三羟甲基氨基甲烷/液EDTA(10毫米/ 1毫米,pH值9.1);标本被沾染了反的两倍αSMA和anti-SMMHCs或NMMHCIIA。FITC-conjugated山羊anti-mIgG2a和rhodamine-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白被用作二次抗体。核与DAPI染色。幻灯片是安装在缓冲聚乙烯醇。照片是记录在一个Axioskop 2显微镜(卡尔蔡司,耶拿,德国)配有plan-Neofluar×20/0.50客观或油浸plan-Neofluar×40/1.4客观和高灵敏度,高分辨率数码相机颜色(Axiocam,卡尔蔡司)。整个膜图像获得使用共焦激光扫描显微镜(LSM800 Airyscan,卡尔蔡司)配备2激光(激发波长在488和561海里)通过一个油浸Plan-Apochromat 63 x / 1.40 DIC f / ELYRA目标。对比和颜色调整图片,在需要时,使用Adobe PhotoShop和应用在图像的完整性。类似水平的修正是应用于控制和特定的标本标签抗体。

2.7。电子显微镜

MSC-seeded膜与1.5%戊二醛固定0.1钠甲次砷酸盐(默克公司,达姆施塔特,德国)含1%蔗糖为3小时。其次是固定在1%锇酸1小时和随后的脱水和嵌入环氧树脂。Semithin部分与甲苯胺蓝染色。薄片治疗与醋酸双氧铀及柠檬酸铅和电子显微镜检查(飞利浦CM10 TEM;飞利浦、埃因霍温、荷兰)。

2.8。测定MSC播种在胶原膜的收缩性

设置机械研究的监测进行了如前所述[36]。短暂,空或MSC-laden膜获得后19天的文化冷却到4°C 48到72小时前处理所使用的实验(延迟是不可避免的,由于装运从实验室里,MSC种植位置收缩实验是进行)。25膜满载MSC和23个空膜进行了研究。膜力学参数是由软件控制的记录个人电脑上运行。杆位移反映膜收缩测量通过一个光电传感器。小隔膜杆调制光的发光二极管(LED)落在一个光电二极管。传感器是由一个合适的d 'Arsonval面板仪表的指针被一层薄薄的l型不锈钢管作为杠杆。

2.8.1发布。初始设置

在双目显微镜下,膜是由一个小的一端动脉夹(科技b - 1夹)和固定一个小线性测微的翻译阶段。膜的另一端被固定在顶端的自制force-length换能器在这样一种方式处理,膜保持水平。膜在室温下被允许接受30分钟在Krebs-Henseleit溶液沸腾O为95%2-5%的公司2。初始位置的位移范围调整螺旋测微计为一个预加载的值约为0.2 milliNewtons (mN)。基底休息基调(BT mN /毫米2),这是紧张的自发的缩短和延长矩阵发生,和初始长度(李)记录。

2.8.2。膜被动属性和杨氏模量计算

膜被提交给进步伸长(在没有任何其他的刺激)确定杨氏模量。杨氏模量( )代表的斜率应力/应变的关系。压力( )是部队( 单位横截面积(m)2)(Pascal (Pa)或N / m2)对膜和表达

应变( )薄膜的变形是由于压力,也就是说,伸长除以膜的直径( 在休息,表示为 ,在那里 伸长的膜。的杨氏模量 表示为 (用Pascal表达;Pa)。

25膜满载MSC和23个空膜进行了研究。

2.8.3。感应的萎缩

所有膜(满载或缺乏MSC)受到交变电动破伤风(火车时间:5秒;培训时间:2秒;刺激频率:100 Hz)或50 mM氯化钾,直到达到一个高原对应的最大振幅等张缩短( )。膜被突然提交一个等距条件测量总等长张力(TT)。我们测量的最大振幅等张缩短( )和总等长张力。在实验的最后,膜重量和直径测量计算的有效横截面积(CSA毫米2)使用有效的膜重量的比值(总重量/ 3)和膜直径。力观察(mN)是标准化/ CSA导致张力(mN /毫米2)。活跃的张力是计算总张力- BT。缩短长度被李规范化李(%)。

2.9。统计数据

Mann-Whitney非参数秩检验时使用2组数据相比,高斯分布无法评估。的值 被认为是重要的。为多个比较,方差分析与Bonferroni调整确认后使用高斯分布的数据。意味着±SDs显示如果没有规定不同。

3所示。结果

3.1。MSC在2 d放大文化表达αSMA和抑制T细胞增殖

3 - 5天后文化、BM细胞悬浮液形成离散的贴壁细胞。这些殖民地继续增殖,形成了融合性的细胞层,而绝大多数呈阳性αSMA(图1(一)上面板)。高放大倍数的显微图显示αSMA是在细胞质中定义良好的应力纤维组织(图1(一)较低的面板)。trypsinated细胞进行流式细胞仪分析显示,他们表达CD44、CD54, CD73, CD90、CD105, CD140b(也称为血小板源生长因子(PDGF)受体-β)、CD146和αSMA,不利于HLA-DR、CD31、CD45、CD56(图1 (b)),CD34(没有显示)。流式细胞术分析MSC来自11个不同的捐赠者允许建立αSMA-positive细胞代表的意思是94±7.7%的细胞恢复后trypsination基质。

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图1
理学硕士培养的生物学特性在2 d。(a)放大细胞被固定在井文化与PBS PFA 1%,与冰冷的无水甲醇permeabilized,标以反αSMA。左面板:偏振光(比例尺是150μ米),正确的和较低的面板:荧光(比例尺是100和20μ米,职责)。原始放大10倍和40 x和较低的面板,分别。(b)文化之前trypsinated与各种抗体染色和流式细胞术分析。黑色简介:特定的染色,灰色简介:同形像控制。数据(a)和(b)是代表11个实验。(c)左面板:kyn动力学生产γ-IFN-stimulated MSC在IMDM介质(初始(tryp) 80μ米)。一个附加的500 U /毫升γ干扰素是0天完成的。上层清液收集在指定的时间点和kyn滴度测定。数据的一个实验中,代表3。右面板:tryp浓度对T细胞增殖的影响。新鲜洁净,CFSE-labeled T淋巴细胞孵化与a3-28 5天tryp-free RPMI中辅以0到20μM tryp,扩散被CFSE稀释评估。T淋巴细胞增殖是表示为中值的倒数CFSE荧光观察到的文化。数据的一个实验中,代表2。误差是SD。

BM-derived MSC被暴露于500 U /毫升γ干扰素(γ干扰素)。kyn, 16个小时后,在新鲜培养基中无法被确认在MSC上层清液及其浓度增加了第五天(图1 (c)左面板)。

T细胞增殖的依赖的存在tryp评估通过刺激淋巴细胞与anti-CD3 anti-CD28抗体固定在微(a3-28)媒体包含tryp浓度滴定。T淋巴细胞表现出一个次优的扩散tryp浓度小于10的时候μM和不能增殖在缺乏氨基酸(图1 (c)右面板)。

MSC降解的能力tryp存在T淋巴细胞激活和抑制其增殖评估coculturing淋巴细胞刺激与a3-28 MSC基质。为期5天的实验中,年底tryp平均的效价 ( )cocultures包含激活T淋巴细胞和MSC,而这是 包含激活T淋巴细胞只在文化,这是一种效价相似RPMI中培养5天在37°C没有细胞(21μtryp M)。Kyn,察觉在控制媒介和文化包含激活T淋巴细胞只取平均值 cocultures激活的T淋巴细胞和MSC。符合上述观察(见图1 (c),对面板)和我们之前的数据18)显示,T淋巴细胞增殖抑制tryp浓度很低时,淋巴细胞增殖是有效地抑制在MSC ( 与 CFSE任意扩散单位的存在和缺乏MSC,职责)。因此,早期γ干扰素释放激活T淋巴细胞足以激活被罩在MSC到了这样一种程度,损耗的tryp文化的被罩激活生成的环境,对T淋巴细胞增殖抑制。

3.2。MSC在胶原膜和收缩蛋白表达

3 d文化启动后的四天,膜的外观播种与MSC修改:扩展影响胶原纤维明显的光学显微镜细胞播种前不再检测。一个半透明的涂层纤维间的缝隙和平滑的表面膜(图2(一个)左和右面板上部)。文化,19天后膜固定,切片,染色与戈德纳的污渍。这表明,胶原蛋白支架MSC-laden膜的压缩比空膜(图2(一个)、中间板)。此外,MSC殖民的内部体积支持并建立了一个多细胞层表面(图2(一个)较低的面板)。膜表面,取平均值 在播种之前,下降到 经过21天的文化( 两个时间点)。膜不断减少的规模之后,直到实验结束(> 100天),尽管速度较低(图2 (b))。

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图2
胶原蛋白膜的殖民MSC。胶原蛋白膜被播种在RPMI MSC从通道1和维护中补充了HPL长达119天,与媒介改变了每2 - 3天。(a)膜的光学显微镜观察文化船只(上面板,比例尺是500μ固定和染色后光镜m),或者与戈德纳的污点(中下游电池板,酒吧是500和100μ米,职责)。左面板上:空膜;右上角面板:MSC-loaded膜经过9天的文化。中间左面板:空膜部分;中间右面板:MSC-laden膜部分培养了19天。较低的面板:高放大率MSC-laden膜的部分在其中心(左),或在外围(右)。(b)近似膜表面用毫米表示的2在文化时间的函数。实验数据的(一个)是一个代表5 (b)和数据的均值±SD 19实验,直到天21的文化,和至少3的实验。原始的放大(a):高板10 x,中间板5 x,和较低的面板20 x。

染色膜与反横截面αSMA、anti-SMMHCs anti-NMMHCIIA抗体显示细胞构成表层和居住在膜的内部空间表达αSMA和NMMHCIIA(图3(一个),上左和右面板、职责),但不是SMMHCs(图3(一个)左下方面板)。共焦显微镜分析表明αSMA和NMMHCIIA与在相同的应力纤维MSC生长在胶原膜(图3 (b))。电子显微镜确定应力纤维细胞(图中3 (c))。

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图3
收缩蛋白的表达在膜的MSC播种。(一)彩色与反膜部分αSMA、anti-NMMHCIIA anti-SMMHCs和控制抗体,或他。(b) MSC-laden膜沾anti-NMMHCIIA(左面板),反αSMA(中央面板),合并图片(右面板)后获得了共焦激光扫描显微镜的石蜡切片。应力纤维NMMHCIIA和阳性αSMA出现黄色图片合并。(c)电子显微图越来越放大的一个MSC坐落在胶原膜,和细胞质的细节。规模的酒吧是100μm (a), 10μm (b), 2μm, 1μ米(c)的右侧和底部面板,分别。这些数据来自文化后膜播种收获19天,代表3实验(a), 2 (b),和2 (c)。
3.3。生物硕士培养三维胶原膜的性质

MSC-laden膜阻止T淋巴细胞增殖而空膜没有(图4(一))。此外,MSC播种在支架和暴露3周多家媒体迫使分化向脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞分化以及这三个途径(图4 (b))。

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(一)
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(d)
图4
生物3 d MSC的胶原蛋白膜的性质。(一)监管MSC-laden膜的T淋巴细胞增殖。T淋巴细胞与CFSE标记文化之前,评估和扩散是CSFE荧光下降。左面板:T淋巴细胞增殖在缺乏膜和MSC:白色简介:静止T淋巴细胞;与a3-28灰色简介:T细胞刺激。右面板:T细胞的增殖与a3-28刺激细胞膜的存在:灰色简介:空膜;简介:白膜含有MSC。这些数据代表5实验。在胶原膜(b)在体外分化:左面板:控制文化的HPL;右上角:adipocytic(油红O染色);中位数吧:chondrocytic(戈德纳的染色);右下:成骨细胞的分化(茜素R污点)。原始的放大10倍、20 x和20 x adipocytic, chondrocytic,分别和成骨细胞的分化。这些数据代表3实验。(c)的生物活性MSC-laden膜后存储在4°c 0 - 5天。左:XTT减低:空膜(上)和一个MSC-laden膜(底部)存储在4°C为5天,随后暴露XTT 2小时37°C所示。佩特里网由2×2毫米的正方形。正确的:MSC cocultured效果与活化T淋巴细胞在tryp退化和T淋巴细胞增殖:“tryp”:残余tryp各上层清液浓度,“Prolif”: T淋巴细胞增殖。“没有MSC”:文化的T细胞刺激a3-28 MSC的缺失;“MBR 37°C”和“MBR 4°C”: cocultures T淋巴细胞和膜与MSC播种,没有后者的或与前一个存储在4°C测定前,分别。纵轴是指要么tryp浓度在微摩尔的表达,或者表达的T细胞增殖CFSE荧光中值的倒数。这些数据代表2实验。(d)流式细胞仪分析表面分子膜后MSC与胶原酶二世解散。分析的7日aad-negative活细胞。流式细胞仪数据从一个实验中,代表6。

MSC拉登膜被储存在4°C长达5天。能力减少四唑盐(XTT试验),降解tryp在激活T细胞,并防止T淋巴细胞增殖检测并与膜仍在常规文化在37°C。MSC-laden膜储存在4°C成为橙暴露在XTT,表明他们新陈代谢活跃,而空膜还是白色(图4 (c)(左)。的甲瓒文化上层清液的浓度恢复MSC-laden膜被储存在4°C XTT前试验取平均值 (OD450年)(平均一天1 - 5的存储在4°C, ),这是类似于控制文化的价值在上层清液保持在37°C (0.972 (OD450年))。此外,存储在4°C没有损害的能力MSC-laden膜代谢tryp激活T淋巴细胞的存在,并降低T细胞增殖(图4 (c),对吧)。

住MSC被释放从膜暴露在胶原酶II。细胞的数量平均中恢复过来 7天( )和文化没有显著不同时间(没有显示)。这些细胞表达CD44、CD54 CD73, CD90、CD105, CD140b, CD146,并对HLA-DR不利,CD31、CD45、CD56(图4 (d)),CD34(没有显示)。这种表型相似的MSC种植同样的时间在2 d文化(见图1 (b))。Membrane-derived MSC可以播种后在2 d文化扩散和表面标记表达类似于细胞不断生长在塑料盘子(数据未显示)。

3.4。胶原蛋白膜的机械性能

膜的基本物理特性,观察到的属性没有电的应用或离子刺激呈现在表1。不同组之间没有显著差异确定膜直径、横截面积(CSA),体重,和基底休息语气(BT)。相反的意思是杨氏模量空膜( 帕斯卡(Pa))被发现的小得多的MSC-laden膜( ,意味着±SD 23和25测量,分别 )(数据5(一个)和5 (b))。
破伤风 氯化钾
没有MSC
( )		 MSC
( )		 没有MSC
( )		 MSC
( )
直径(毫米) 0.09
CSA(毫米2) 0.96
体重(毫克) 0.33
基底的语气(mN /毫米2) 0.51
直径的平均值±SD,横截面积的膜(CSA),体重,和基底的语气。没有MSC:空胶原蛋白膜;MSC: MSC-laden膜; : 价值得到方差分析进行4类型的膜。没有观察到显著差异4参数的分析。
表1
细胞膜的基本物理性质。
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(一)
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(b)
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(c)
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(d)
图5
行数据的膜收缩性。膜张力表达mN /毫米2;李在休息基底膜长度基调;时间是用秒表示。(a)膜长度和张力变化注册后连续增量0.1 mN加载步骤,和作为时间的函数所示。上面板:长度增加(注意,规模是倒在垂直轴)。较低的面板:张力增加。(b)计算杨氏模量的使用数据中生成的膜(a)。这个例子是一个空的膜,其杨氏模量是450 Pa。(c) 50 mM氯化钾对MSC-laden膜的影响。上面板规模:膜缩短(注意,是倒在垂直轴上这样的情节:如果膜缩短增加,膜长度减少)。较低的面板:紧张的一代。垂直向下箭头标识的时间点张力突然增加,系统从等张模式转向等距模式。主动张力振幅等于总张力由灰色虚线-基底的语气,这是降低固体黑色水平剖面生成在等张模式。(d)膜的放松之前刺激由氯化钾ISDN(没有捐赠)。上面板:膜延长;较低的面板:张力接触lSDN后观察。类似的收缩膜参数观察MSC-laden刺激电动破伤风。这些数据代表的23个实验空膜和25实验MSC-laden膜的杨氏模量测定,9和17氯化钾和破伤风的刺激,分别为ISDN放松和9和10年来放松(见表2)。

参数表中给出收缩和放松2。膜没有MSC被暴露于电动破伤风因为胶原蛋白逆压电特性。压电效应可以是直接或交谈。直接影响由内部产生的电荷产生的机械应力的应用。逆压电效应产生的一代机械应变一旦材料暴露于电场。都观察到固体材料,如晶体、陶瓷、胶原蛋白、骨,DNA、蛋白质和各种37,38]。施加电场MSC诱导的膜没有疲软的缩短和弱膜的张力,这是逆压电效应(表2(一个))。空膜暴露在氯化钾,因为溶解过程也可能导致胶原蛋白分子机械张力。溶剂化作用是一个过程的吸引力和溶剂分子协会(氯化钾)的分子或离子溶质(胶原蛋白)。溶剂化作用包括氢键、ion-dipole和取向景点或范德华力和诱导时溶剂的离子成分被修改(39]。氯化钾,如破伤风、诱导弱缩短和疲软的空(表膜的张力2(一个))。一旦MSC-laden膜受到破伤风或氯化钾缩短和发达后积极紧张刺激与空膜相比明显高(表2(一个)),并显示一个非常缓慢的动力学(图5 (c))。此外,MSC-laden膜刺激与氯化钾放松后添加硝酸异山梨酯(ISDN)或2,3-butanedione单肟(BDM)(图5 (d))。最大等张延长(maxVr),负峰等距力导数(−maxdF),和总时间弛豫引起的ISDN和BDM是相同的(表级2 (b))。MSC-laden膜电流刺激的自然放松,一旦刺激已经停止和休息10分钟后再次回应。因此,电刺激允许发生的几个周期contraction-relaxation(数据没有显示)。

(一)收缩
破伤风 氯化钾
没有MSC
( )		 MSC
( )		 没有MSC
( )		 MSC
( )
ΔLmax (%) < 0.001 < 0.05
活跃的张力(mN /毫米2) < 0.001 < 0.05
(b)放松
ISDN
( )		 BDM
( )
马克斯Vr(毫米/秒) 0.35
Isot。放松。时间(年代) 0.98
−马克斯dF (mN / s) 0.64
引爆。放松。时间(年代) 0.45
(一)最大振幅等张缩短(ΔLmax)和 值比较膜有无MSC暴露于破伤风或氯化钾。(b)最大松弛速度(Max Vr),等张弛豫时间(Isot。放松。等距弛豫时间),负峰(−max dF),和等距放松启动时间。放松。显示时间)。无显著统计学差异观察ISDN和BDM的4参数之间放松。( )是指数量的副本。
表2
膜的收缩和松弛参数。

4所示。讨论

在这项研究中,我们评估了来自人类骨髓MSC的表型是否兼容外膜细胞的起源,因为一些研究报道,myofibroblasts也可能源自周(11,12),如果MSC可以分化成收缩myofibroblast体外。我们的调查由显性流式细胞仪分析和各种生物分析包括细胞分化,分析MSC-induced T淋巴细胞抑制,MSC收缩性的监控。首先,我们在2 d显示BM-derived MSC放大文化表达CD44, CD76, CD90、CD105, CD140b / PDGF受体-βCD146,αSMA,不利于CD45和CD56而表现出防止T淋巴细胞增殖的能力。这种表型,以及强有力的抑制T淋巴细胞增殖,一直观察体外扩增后的周来源于骨骼肌(7,8),因此强烈建议我们的细胞来自周。此外,细胞生长在2 d文化myofibroblast-associated标记如NMMHCIIA和表达αSMA (40,41]。人会认为任何细胞同时表达NMMHCIIA和αSMA可以合同,但不能进行2 d细胞收缩性文化由于刚度的塑料支持基质。第二,我们表明,MSC长时间存活胶原膜,保持强大的代谢活动记录的XTT化验。然而,代谢活动的直接比较了细胞生长在2 d和3 d文化不能建立使用XTT化验,因为甲瓒盐代谢细胞部分被困在发布的膜在橙色(着色),和不能定量恢复光密度分析因而阻碍一个公正与2 d的文化。额外的生物(见下文)证实,MSC是功能齐全的居住在膜的时候,即使在4°C扩展存储。所表达的一系列生物标记细胞在三维文化,包括NMMHCIIA和αSMA是相同的2 d的文化。很明显这些收缩分子功能就是明证,MSC-laden膜接触的经典模式sarcomeric nonsarcomeric肌肉刺激容易感染。第三,尽管大多数如果不是全部的细胞培养与HPL表达αSMA(见图1 (b)),我们的调查显示,MSC拉登在膜同时具有能够分化为软骨细胞,成骨细胞,脂肪细胞,预防同种异体的T淋巴细胞增殖。因此,我们的数据表明,全球BM-derived MSC与HPL最有可能起源于周放大,自发分化,在胶原膜播种时,进入功能myofibroblasts而保护传统归因于MSC表型和功能特性。

体内,如果myofibroblasts展示这些功能的完整性,不仅会帮助受伤的决议通过矩阵合成和细胞收缩(22)也直接组织重建作出贡献,并通过防止慢性炎症通过延迟T细胞激活的沉默。这个假说是一致的工作③et al。23),这表明结肠myofibroblasts人类内脏的有效抑制T细胞增殖,可能扮演重要角色的建立和维持肠粘膜宽容。因此它可能是有趣的重新评估的总体贡献myofibroblasts系统性免疫耐受。

一些研究间接评估的收缩的性质MSC分化成myofibroblasts(审查[22])。BM-derived MSC表达αSMA已报告在胶原凝胶收缩决定通过比较凝胶大小与TGF -孵化之前和之后β或PDGF使用照片(42)或显微镜测微计43]。然而为了声称组织收缩有合同表明它可以刺激的作用下,一般电或化学(生物),而且它可以放松当暴露于适当的药物,比如BDM目标actin-myosin桥梁或ISDN,降低细胞内钙。这种双重contraction-relaxation过程是可逆的,也就是说,它可以应用几次同样的准备。此外,必须提供数据关于开发的强度/紧张准备在博览会经济刺激使用传感器实时监控整个过程。尽管上述研究引用(42,43]表明,细胞收回,他们没有量化细胞机械功率发展过程中收缩,衡量目前的工作。

其他研究量化的力由myofibroblasts(但不是MSC)被困在凝胶,或使用基质定义合规建立支持刚度之间的关系和myofibroblast成熟(44- - - - - -47),但没有测量之前和之后的杨氏模量矩阵细胞殖民,也没有评估的经典模式的影响sarcomeric nonsarcomeric肌肉刺激,如电动破伤风和氯化钾在MSC / myofibroblast收缩。

在这项研究中,我们表明,胶原蛋白膜的杨氏模量显著增加,当结构与MSC渗透。这表明细胞胶原膜牢牢的束缚住,确认的必要性从脚手架使用胶原酶释放他们。TGF -β、现在在生物活性浓度HPL [3已知)和增强细胞对胶原蛋白(28,48,49),当然是参与这个过程。此外,膜大小期间观察到文化的显著下降(见图2 (b)TGF -)可能会引起在一起β和膜刚度的增加膜殖民。都喜欢myofibroblast收缩(44- - - - - -46]。

来验证我们的研究,我们必须确定活性膜的机械性能缺乏MSC。这些逆压电和溶剂化作用,它可以发生在空膜提交电场,或分别浸泡在盐浓度高,(37,38]。希望足够,对空膜的机械张力诱导电场或溶解过程明显低于观察到当MSC-loaded膜受到刺激。这些发现,再加上BDM的观察和ISDN诱导膜松弛,进一步证实MSC-laden膜收缩是由细胞新陈代谢活跃,没有结果从化学或物理构件。

生物系统的优良力学nonmuscular收缩已经调查了在人类胎盘(36,50,51]。胎盘myofibroblasts位于茎绒毛(52),展览等长张力较低(49- - - - - -51],缩短速度缓慢。他们还表现出较低的肌球蛋白atp酶活性(53- - - - - -55]。这是连贯的观察胎盘的主要分子马达myofibroblasts是nonmuscle肌凝蛋白花絮”(40,41)的分子动力学显著慢(36,55]。MSC-laden膜刺激导致同样缩短速度缓慢,这是与观测一致,nonmuscle肌凝蛋白活动花絮,但不是平滑肌肌球蛋白,在膜的细胞探测到拉登。

5。结论

这项工作表明,MSC源自人类BM和培养在胶原膜补充HPL表达了兼容外膜细胞起源的表型。此外,MSC胶原支架为收缩myofibroblasts自发分化,同时能够控制T淋巴细胞增殖和分化成各种mesenchymatous血统。我们的数据表明,myofibroblasts并不像最初只参与组织愈合,还参与炎症关机,或许,由于它们在体内广泛分布,系统自我耐受性。除了MSC-laden胶原膜,由于延长生存MSC在这些结构,可以运往遥远的目的地在不改变细胞的生物效价,因此代表了一个多才多艺的和有前途的治疗工具,控制炎症或损伤后忙各种组织的重建。

的利益冲突

所有的合作者声明无利益冲突有关的出版这篇文章。

作者的贡献

Marie-Luce Bochaton-Piallat和文森特Kindler同样这项工作。

确认

这项工作一直在支持部分博士Dubois-Ferriere Dinu Lipatti基金会,Genevoise靠le癌症CANSEARCH基金会和瑞士国家科学基金会批准号310030 _166357/1 (MLBP),瑞士。优秀的技术工作的n .这太太和先生的博士Henchoz很大程度上是承认。特别要感谢博士d . Hochstrasser没有他们这项工作已经完成。作者还要感谢博士Ch。洛克,总统的“联邦de la矫揉造作的倩碧du医院大是Francilien”。

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