Guanylate-Binding蛋白质1促进人牙周韧带干细胞的迁移和入侵

文摘

间充质干细胞/基质细胞(msc)能够迁移到网站在应对各种损伤和炎症细胞因子来改善组织修复。先前的研究显示移行细胞(IFN -γ)促进迁移的V54/2细胞系和牙髓干细胞(DPSCs),但潜在的机制在很大程度上仍未知。在这项研究中,我们发现干扰素-γ诱导牙周韧带的迁移和入侵干细胞(PDLSCs)剂量依赖性的方式在体外。虽然击倒guanylate-binding蛋白1(1英镑)抑制干扰素-γ全身的迁移和入侵,1英镑的异位表达强干扰素-γ全身的迁移和入侵PDLSCs。此外,我们证明了干扰素-所需1英镑γ全身处理矩阵在PDLSCs metallopeptidase 2 (MMP2)。我们的发现表明1英镑促进干扰素-γ全身的迁移和入侵PDLSCs MMP2, 5月1日英镑作为新目标促进MSC自导和迁移。

1。介绍

间充质干细胞/基质细胞(msc)是一个异构的细胞能够自我更新和分化成特定sublineages,包括成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞(1,2]。除了有前途的潜力在骨头和软骨再生,msc目前正在调查在不同免疫障碍的研究和临床试验,如移植物抗宿主病(GVHD)、克罗恩病、类风湿性关节炎(3,4]。尽管政府局部和全身给药的外生msc可以msc的迁移活动受伤的网站对疗效[至关重要5,6]。从骨髓msc经典是孤立的,它们可以在多个胎儿和成人组织,包括脐带血,胎儿肺,和脂肪组织,以及牙科组织(7,8]。在牙科组织内,发现了msc在牙髓,牙周韧带,顶端乳头9- - - - - -11]。牙周韧带干细胞(PDLSCs),一种牙齿干细胞,具有可比性来源于msc的增殖率和骨(BM-MSCs) [10,12]。关于分化能力,PDLSCs还可以引起成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞(10,12]。

移行细胞(IFN -γ)中扮演一个重要的角色在先天和适应性免疫反应对各种病毒和细菌的感染(13]。干扰素-γ还显示关键监管对MSC的多个生物行为的影响,包括增殖、迁移和成骨分化。他等人报道,治疗干扰素浓度较低的-γ0.05 ng / ml可以显著促进牙髓干细胞的增殖但抑制成骨分化(DPSCs)在体外(14]。用干扰素治疗,γ在100国际单位/毫升(约5 ng / ml)抑制增殖和成骨分化潜力的人类BM-MSCs [15]。在MSC移植方面,干扰素-γ促进迁移V54/2细胞系和DPSCs,尽管这种现象的潜在机制仍不完全清楚(14,16]。除了连续暴露于干扰素-γ干扰素-γ也用于预处理的msc。有趣的是,干扰素,γprestimulation msc增加他们的迁移可能发炎网站和减少粘膜损伤实验结肠炎(17]。

Guanylate-binding蛋白1(1英镑)是一种细胞因子诱导的鸟苷三磷酸酶和干扰素-γ响应因子(18- - - - - -20.]。1英镑在调解中扮演着重要的角色的抗菌和抗病毒活动干扰素-γ(21,22]。我们以前英镑1所示是表达水平最高的7人类BM-MSCs GBPs,以及需要1英镑IFN -γ全身的处理吲哚胺2,3加双氧酶(被罩),白介素- 6(il - 6)和引发(23]。鉴于干扰素- 1英镑的至关重要的作用γ信号,我们假设1英镑也可能扮演重要的角色在迁移msc对干扰素-γ治疗。为了解决这个问题,我们调查了迁移和入侵能力1-depleted英镑,英镑1-overexpressed PDLSCs干扰素-的反应γ分别处理。我们进一步发现干扰素-所需1英镑γ全身upregulation PDLSCs基质金属蛋白酶2 (MMP2)表达的。

2。方法和材料

2.1。主题和细胞培养

无病影响表示提取第三臼齿都来自病人,精神分裂症一般在20岁,在重庆医科大学的口腔医院。从每个病人得到书面知情同意。PDLSCs分离(如前所述)(10]。所有程序依法进行指导方针和法规批准重庆医科大学。heat-inactivated PDLSCs在DMEM维护,包含15%胎牛血清,100 U /毫升K-Penicillin G和100毫克/毫升的硫酸链霉素(所有从热费希尔科学)在37°C在湿润的气氛中5%的有限公司₂。PDLSCs段落4到10内4捐助者被用于这项研究。重组人干扰素-γ(研发系统)是用于治疗PDLSCs表示。

2.2。核的沉默和超表达1英镑

3有针对性的池19-25 nt siRNAs针对人类1英镑和炒siRNAs (siSCR)购买的圣克鲁斯生物技术。小干扰rna转染PDLSCs镀在一夜之间,进行使用Lipofectamine RNAiMAX试剂(热费希尔科学)根据制造商的指示。异位表达1英镑,慢病毒基因表达人类1英镑买来Fulengen Inc .(广州)。PDLSCs被感染的8μ克/毫升的聚凝胺(σ)2天然后选择2μg / ml嘌呤霉素为3天。PDLSCs转染空向量被用作控制。

2.3。单层细胞伤口愈合试验

100%汇合的单层PDLSCs刮了无菌200μl吸管技巧。细胞被洗去除细胞碎片和允许迁移24小时。代表图像的初始时间点(0 h)和孵化后(24小时)是使用一个倒置显微镜(奥林巴斯)评估迁移距离如前所述[24]。

2.4。Transwell化验

1×10⁵200年PDLSCsμl DMEM没有的边后卫被播种到基底膜基质入侵钱伯斯(纽约康宁)。Transwell众议院充满了500μl(完整的生长介质。48小时后,入侵细胞沾HEMA-3工具包(费舍尔)和光学显微镜下计数(奥林巴斯)。

2.5。RNA隔离和RT-qPCR

从细胞中提取总RNA使用试剂盒试剂按照制造商的指示(热费希尔科学)和处理RQ1 DNase (Promega)。2μg整除的总RNA是用于生成第一链互补DNA。定量聚合酶链反应(qPCR)进行使用SYBR预混料交货Taq工具包(豆类)使用各种特定的引物(表1)。

2.6。免疫印迹

蛋白质分离使用缓冲区里帕(圣克鲁斯生物技术)含1%蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏)根据制造商的指示。批准μg整除的溶解产物分离10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶。解析后的蛋白质被转移到硝酸纤维素(Bio-Rad)和孵化与抗体在一夜之间在4°C。蛋白质乐队被发现使用一个增强化学发光免疫印迹检测设备(热费希尔科学)。抗体用于这项研究包括兔多克隆抗体反1英镑(表达载体)和兔多克隆抗体反MMP2的(细胞信号技术)。

2.7。统计分析

学生的t以及用于单一的比较。单向方差分析(方差分析)和双向方差分析与因果图基的测试执行多个比较使用GraphPad棱镜6软件。数据被表示为平均数±标准差从至少三个独立的实验。 被认为是重要的。 ; ; 。

3所示。结果

3.1。干扰素-γ1英镑的治疗促进迁移和入侵和表达在PDLSCs剂量依赖性的方式

调查的影响干扰素-γ伤口愈合PDLSCSs迁移,单层细胞试验。如数据所示1(一)和1 (b),迁移距离PDLSCs在应对干扰素-显著增加γ治疗1和10 ng / ml但不是0.1 ng / ml。一致,PDLSCs的入侵能力也增强了干扰素-γ治疗1和10 ng / ml但不是0.1 ng / ml(数字1 (c)和1 (d))。我们进一步证实,1英镑的表达水平的干扰素-γ响应基因,诱导干扰素-γ治疗剂量依赖性的方式在PDLSCs(图1 (e))。10 ng / ml的最优浓度干扰素-γ全身的迁移和入侵和表达1英镑在PDLSCs,这个浓度选择的研究。

3.2。1抑制干扰素-英镑siRNA-Mediated枯竭γ全身的迁移和入侵PDLSCs

接下来,我们试图调查是否所需IFN - 1英镑γ全身的迁移和入侵。池siRNAs针对1英镑用于可拆卸的1英镑的表达式,并证实了可拆卸的效率RT-qPCR分析和免疫印迹(数字2(一个)和2 (b))。转染细胞被播种到six-well盘子和允许生长汇合的。有趣的是,1显著抑制干扰素-英镑的损耗γ全身upregulation迁移活动,虽然它并不影响迁移的PDLSCs缺乏干扰素-γ(数据2 (c)和2 (d))。消耗1英镑也抑制入侵干扰素引起的细胞数量的增加γ治疗10 ng / ml的浓度(数字2 (e)和2 (f))。

3.3。超表达1强IFN -英镑γ全身的迁移和入侵PDLSCs

接下来,PDLSCs感染了慢病毒表达1英镑,英镑1的超表达RT-qPCR证实了分析和免疫印迹(数字3(一个)和3 (b))。如数据所示3 (c)和3 (d)的异位表达1英镑没有促进PDLSCs的迁移,但它进一步加强PDLSCs迁移活动的干扰素-的存在γ在一个10 ng / ml的浓度。干扰素的入侵能力-γ对待PDLSCs也提升了1英镑(数据的异位表达3 (e)和3 (f))。最重要的是,这些发现表明1英镑upregulation至关重要的迁移和入侵PDLSCs诱导干扰素-γ治疗。

3.4。干扰素-所需1英镑γ全身PDLSCs MMP2的处理

先前的研究已经报道,基质金属蛋白酶发挥重要作用在调节msc的迁徙活动25,26]。我们筛选几种基质金属蛋白酶的表达水平在PDLSCs RT-qPCR应对干扰素-γ治疗48小时。有趣的是,干扰素,γ专门治疗诱导MMP2在PDLSCs表达式,而不是MMP1,MMP9,MMP14(数据4(一)- - - - - -4 (d))。我们也调查了干扰素的效果γ治疗癌胚antigen-related表达的细胞粘附分子1 (CEACAM1)和细胞间粘附分子1 (ICAM1),我们发现干扰素-γ治疗并不影响mRNA的表达CEACAM1或ICAM1在PDLSCs(补充图1(a和b))。然后我们确认MMP2的upregulation干扰素-γ治疗PDLSCs免疫印迹(图4 (e))。此外,我们发现1显著抑制干扰素-英镑的损耗γMMP2的全身的处理(数据4 (f)和4 (g))。综上所述,我们的研究结果建议1需要IFN -英镑γ全身处理MMP2从而促进迁移和入侵PDLSCs诱导干扰素-γ治疗。

4所示。讨论

在这项研究中,我们发现用干扰素治疗γ促进迁移和入侵PDLSCs MMP2和增强的表达水平。虽然消耗1英镑并不影响PDLSCs的迁移和入侵能力,显著抑制upregulation迁移和入侵诱导干扰素-γ治疗。此外,异位表达PDLSCs进一步提高干扰素- 1英镑γ全身的迁移和入侵PDLSCs。最后,我们需要显示1英镑MMP2的处理诱导干扰素-γ,它可能促进干扰素-γ全身的迁移和入侵PDLSCs。

骨髓间充质受伤的网站的迁移活动的功能,促进组织修复至关重要。先前的研究显示干扰素-γ可以促进迁移的msc,这取决于治疗浓度和msc的来源。治疗干扰素-γ0.05、0.5和5 ng / ml增强迁移活动DPSCs [14),并与干扰素治疗γ在1000 U /毫升(约50 ng / mL)提升V54/2细胞系的迁移活动。然而,与干扰素治疗γ在1000国际单位/毫升(约50 ng / ml)仅略有增加BM-MSCs的迁移,但只有一个浓度水平的干扰素-γ测试的研究(16]。在这项研究中,我们发现迁移和入侵PDLSCs在应对干扰素-显著增加γ治疗1和10 ng / ml。更重要的是,我们的研究结果表明1英镑的关键中介干扰素-γ全身PDLSCs迁移。由于干扰素-的最佳浓度γ可能会随个人,可能是针对1英镑更可行的临床应用。此外,msc的免疫特性归航后组织修复受伤的网站也很重要。尽管最近的研究表明休息msc可能没有显著的免疫调节活性,但与干扰素治疗γ能够提高msc的免疫抑制特性。例如,msc与干扰素γ被发现更有效地预防移植物抗宿主病的发展,而如果msc (27,28]。因为1英镑对干扰素-至关重要γ信号1英镑可能在干扰素-也扮演了一定的角色γ全身的细胞因子的生产和免疫调节活动msc (16,23]。

基质金属蛋白酶是一个家族的zinc-dependent蛋白水解酶,参与细胞外基质(ECM)的降解。以前有研究指出MMP1的角色,MMP2、MMP9, MMP14监管MSC移植的25,26,29日]。MMP2和MMP9的表达被干扰素-升高γ治疗人类唾液腺细胞系(HSG),但干扰素-γ抑制本构MMP-2表达人类astroglioma细胞(30.,31日]。在这项研究中,我们发现干扰素-γ专门治疗诱导的表达MMP2,而不是MMP1,MMP9,MMP14在PDLSCs干扰素-所需1英镑γ全身MMP2的处理就是明证RT-qPCR和免疫印迹。此外,他等人报道干扰素-γ调节细胞的行为DPSCs通过NF -κB和MAPK信号。仍需要更多的努力调查1英镑是如何整合到下游信号在干扰素-γ对msc。Duijvesteinet al。有显示CEACAM1表达与干扰素调节经过6天的治疗γ在人类BM-MSCs [17]。然而,在这项研究中,我们发现干扰素- 2天γ治疗并不影响mRNA的表达CEACAM1或ICAM1在PDLSCs。它是可能的CEACAM1不是直接的目标干扰素-γ信号,但它可以通过激活诱导NF-κB和/或MAPK信号。

总之,我们的研究结果表明1介导IFN -英镑γ通过MMP2全身PDLSCs迁移。和1英镑可能是一个新的治疗目标促进MSC移植能促进干扰素治疗γ影射msc。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持中国博士后科学基金会(2017 m622981)和重庆的基础研究和前沿技术研究项目(cstc2017jcyjAX0376)。

补充材料

干扰素的作用γ治疗的表达CEACAM1或ICAM1在PDLSCs。补充图1:干扰素-γ治疗并不影响在PDLSCs CEACAM1或ICAM1表达的。RT-qPCR分析CEACAM1干扰素- 48小时后表达γ治疗PDLSCs和控制细胞(a), RT-qPCR分析ICAM1干扰素- 48小时后表达γ治疗PDLSCs和控制细胞(b)。(补充材料)

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