文摘

人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)优于其它来源的间充质干细胞/基质细胞(msc),并使用它们作为小说以细胞为基础的癌症治疗的工具。然而,潜在hUCMSC-induced癌症细胞死亡的机制不清楚。在目前的研究中,我们旨在评估分泌的影响因素在乳腺癌细胞系MCF7 hUCMSCs暴露的条件培养基hUCMSCs (CM)。我们评估了形态学变化,细胞活力、细胞周期、细胞凋亡、DNA碎片,interleukin-1β(il - 1β)的分泌CM-exposed MCF7细胞。结果表明,分泌的因素hUCMSCs可以通过诱导pyroptosis MCF7细胞死亡原因。我们还总RNA,测序和差异表达基因(度)受到基因和基因组的京都百科全书(KEGG)路径分析。2597(1822调节和775下调)基因识别和14途径明显富集。结果表明,pyroptosis-related基因的表达NLRP1和CASP4和炎症相关的通路显著改变MCF7细胞暴露在厘米。我们所知,本研究是第一个报告,hUCMSCs的分泌因素会导致pyroptosis MCF7细胞。此外,它是第一个研究全球基因表达MCF7细胞暴露在厘米。这些结果将为进一步的研究提供有价值的信息的机制MCF7细胞分泌因子的诱导下,pyroptosis hUCMSCs。它也将有助于理解hUCMSCs在乳腺癌细胞疗法的效果。

1。介绍

在全球范围内,乳腺癌是女性癌症的主要类型,影响大约210万名妇女(1),并在2015年导致533600人死亡(2]。在中国,乳腺癌的发病率的增加,它预计将占新癌症病例的15% (3]。包括放射治疗和手术治疗乳腺癌,紧随其后的是激素阻滞剂管理代理,化疗,和使用单克隆抗体(4]。然而,随着乳腺癌是由几个分级分类系统,以及每一个会影响预后和治疗反应,一个新的有效治疗乳腺癌是必要的。

Pyroptosis是一种程序性细胞死亡,是不同于免疫沉默凋亡细胞死亡,这是caspase-1依赖(5]。caspase-1的活动可能导致il - 1的成熟β和地震裂开gasdermin D诱导孔开放和pyroptosis [6]。此外,inflammasomes caspase-1活动(很重要7),是由AIM2-like受体,三方motif-containing蛋白质,或nucleotide-binding域的成员,包含(NLR)家庭富亮氨酸。pyroptosis过程中形态的变化,包括质膜破裂,水涌入,细胞肿胀,渗透溶菌作用和促炎细胞内容发布(8]。此外,pyroptosis不同于细胞凋亡的DNA乳沟,核凝结和核的完整性(8,9]。

间充质干细胞(msc)得到了广泛的关注作为癌症治疗的新工具。人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)隔绝人类脐带沃顿的果冻。对癌症的影响hUCMSCs都已经被广泛地研究过了。汉et al。10)报道,在前列腺癌细胞曲泽hUCMSCs可以诱导细胞凋亡。愣et al。11]发现hUCMSCs可以抑制乳腺癌的进展通过诱导肿瘤细胞死亡和抑制血管生成在老鼠身上。然而,潜在hUCMSC-induced癌症细胞死亡的机制不清楚。hUCMCSs可以抑制癌症恶化的分泌因素诱导肿瘤细胞死亡(12,13),在目前的研究中,我们旨在评估hUCMSCs分泌的影响因素在乳腺癌MCF7细胞行,我们执行RNA-sequencing (RNA-Seq)探索基因和通路参与这个过程。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

乳腺癌细胞系MCF7本研究中使用的是经中国科学院昆明细胞库。在杜尔贝科的修改维护鹰介质(DMEM)(含4.5 g / L的葡萄糖、谷酰胺和110 mg / L丙酮酸钠(Gibco热费希尔科学™,苏州、中国)]补充10%胎牛血清(™的边后卫,Gibco生活技术,澳大利亚),100 mg / L青霉素,100 mg / L链霉素(Gibco被生活科技™,纽约,美国)在37°C公司为5%2。

hUCMSCs取自人类脐带沃顿的果冻组织外植体技术(14]。脐带被告知病人同意后捐赠的研究和伦理批准云南大学医学院的医学伦理委员会。

hUCMSCs是最低基本培养基培养α修改(αMEM, Hyclone热科学™,中国北京)补充10 ng / mL纤维母细胞生长因子基本蛋白质(bFGF;默克密理博,达姆施塔特,德国),100 mg / L青霉素,100 mg / L链霉素在37°C公司为5%2。的身份证实了hUCMSCs间充质细胞表面标记CD105的表达,CD90, CD44, CK18和CD45的nonexpression HLA-DR和CD31(附加文件1)。第八段前hUCMSCs被使用。

2.2。暴露MCF7细胞hUCMSC-Conditioned媒介

hUCMSCs培养在塑料水瓶(25厘米2美国纽约,康宁)。48 h后(当细胞汇合的大约90%),hUCMSCs培养介质收集和filter-sterilized使用0.22μm Millex-GP过滤装置(微孔,Carrigtwohill、Tullagreen、爱尔兰)。MCF7细胞密度为105细胞/ mL被播种在6-well板块(美国纽约康宁)包含正常培养基和培养过夜。随后,媒介是hUCMSC-conditioned介质(hUCMSC-CM)所取代。hUCMSC-CM是由逐渐增加的比率hUCMSC中长期新鲜培养基培养(10% hUCMSC-cultured培养基+ 90%新鲜培养基,20% hUCMSC-cultured培养基+ 80%新鲜培养基,40% hUCMSC-cultured培养基+ 60%新鲜培养基,60% hUCMSC-cultured培养基+ 40%新鲜培养基,80% hUCMSC-cultured培养基+ 20%新鲜培养基,和100% hUCMSC-cultured介质)。MCF7细胞形态学的变化都被记录下来,然后拍到天1,2,3,4,5用倒置相差光学(徕卡DFC420C)。hUCMSC-cultured介质的比例80%和20%新鲜培养基被选为进一步分析MCF7细胞表现出明显的形态学变化,这些变化是最同步在这个媒介。

2.3。MTS分析细胞的可行性

MCF7细胞被播种,播种密度5×103细胞/在96 -孔板(美国纽约康宁)包含正常培养基和培养过夜。随后,媒介是取代hUCMSC-CM(治疗)和新鲜培养基(控制)。细胞生存能力率评估使用CellTiter 96水一个解细胞增殖试验装备(美国Promega)天1,2,3,4,5介质替换后根据制造商的协议。简而言之,在测定之前,20μL CellTiter 96水一个解试剂添加到每个的96 - 100年试验板包含样本μL培养基,然后板是孵化在37°C公司为5%2。3 h后,吸光度被记录在490海里。

2.4。流仪分析细胞周期

控制和MCF7细胞暴露于hUCMSC-CM 48 h后收集胰蛋白酶消化没有EDTA (Solarbio,北京)和固定在一夜之间冰冷的70%的乙醇。固定细胞被沾染了50μg /毫升propidium碘(π,CWBIAO,北京)磷酸盐(PBS)含0.1% Triton x - 100和50μg / mL核糖核酸酶,然后分析了使用CyFlow空间(Partec)和FloMax 2.82软件。

2.5。膜联蛋白V-FITC /π分析

凋亡细胞的百分比确定使用膜联蛋白V-FITC /π凋亡检测设备(CWBIO,北京)。简单,控制和MCF7细胞暴露于hUCMSC-CM 48或72 h后收集胰蛋白酶消化没有EDTA,然后用冷洗PBS和resuspended绑定缓冲的浓度为106细胞/毫升。这些细胞被孵化与5 37°CμL的膜联蛋白V-fluorescein异硫氰酸酯(FITC)和10μL的碘化propidium 10分钟和分析与CyFlow空间(Partec)和FloMax 2.82软件。

2.6。末端转移酶的dUTP缺口末端标记(TUNEL)测定

使用无出路的碎片的DNA进行了分析荧光TUNEL分析工具(南京凯基生物生物技术,中国)根据制造商的协议。控制和MCF7细胞暴露于hUCMSC-CM 72 h methanol-free固定在4%甲醛溶液在PBS 30分钟在4°C和蛋白酶K处理30分钟在37°C。随后,细胞治疗晚期deoxyribonucleotidyl转移酶(TdT)包含biotin-11-dUTP 1 h在37°C在黑暗中然后streptavidin-fluorescein处理30分钟在37°C在黑暗中。最后,这些细胞被添加到包含4中 ,6-diamidino-2-phenylindole和倒相衬下可视化光学(徕卡DFC420C)后10分钟。

2.7。量化的分泌il - 1β通过ELISA

il - 1的量化β由MCF7细胞分泌人类il - 1进行使用β/ IL-1f2 Valukine™酶联免疫试剂盒(罗福斯、台湾、中国)根据制造商的指示。媒体控制MCF7和MCF7暴露hUCMSC-CM收集天0,1,2,3,4,5,储存在−80°C的酶联免疫吸附试验(ELISA)。

2.8。RNA序列

控制和MCF7细胞暴露于hUCMSC-CM (106细胞/毫升)收获(三个生物复制)和总RNA提取使用试剂盒™试剂(美国卡尔斯巴德表达载体)。使用RNA RNA质量和数量是决定纳米6000装备安捷伦2100生物分析仪系统,和样本存储在−80°C,直到进一步的使用。总RNA (10μg)每个样本被用来构建互补脱氧核糖核酸数据库。总共6个样本测序使用bgiseq - 500平台。

2.9。生物信息学分析

原始读取使用内部过滤软件SOAPnuke获得干净的读取(15]。清洁阅读与参考基因组被映射使用HISAT [16]。计算基因表达独特的映射读取每千碱基数量每百万可映射读取(FPKM)外显子片段RSEM [17]。基因表达的基础上,分析了差异表达基因(度)使用DEGseq算法[18]。为分析, 值≤0.001和日志的绝对值2比≥1被用来验证基因表达差异的重要性。度的基础上,使用clusterProfiler包的路径进行功能分析(19]。富集分析是由超几何检验阈值为0.05基于KEGG数据库。

2.10。验证基因表达的定量实时聚合酶链反应

在hUCMSC-CM MCF7细胞培养,48 h后,从细胞总RNA提取使用试剂盒™试剂(美国卡尔斯巴德表达载体)。RNA的质量和数量是决定使用nano - 300 (Allsheng)。所有样本然后对待PrimeScript™RT试剂盒与gDNA橡皮擦(豆类,中国)合成first-stand互补脱氧核糖核酸。引物序列设计使用PrimerQuest工具(http://www.idtdna.com/primerquest/Home/Index),表中给出的序列1。定量实时聚合酶链反应(q-PCR)都使用了BIO-RAD CFX96™实时系统使用由于“快速上手”项目普遍SYBR绿色大师(罗氏,曼海姆,德国)。相对量化是由比较Ct (2- - - - - -△△Ct)方法。

表1
引物序列定量实时聚合酶链反应。
2.11。统计分析

统计分析使用Microsoft excel 2007和R 3.5.1,使用GraphPad棱镜5和图绘制软件和R 3.5.1。 值<0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。hUCMSC-CM对MCF7形态学的影响

我们不同比率的hUCMSC-cultured MCF7细胞培养基培养新鲜培养基(附加文件2)。我们发现即使10% hUCMSC-cultured介质和90%新鲜媒介会导致MCF7细胞pore-induced质膜内陷,然后死亡。然而,死亡细胞的数量是非常小的,不超过50%。hUCMSC-cultured介质的比例增加,pore-induced质膜内陷现象更加明显,死细胞的数量增加。在中80% hUCMSC-cultured介质和20%新鲜培养基,MCF7细胞表现出明显的形态学变化,这些变化是最同步的。虽然在100% hUCMSC-cultured MCF7细胞培养中有相同的形态变化和同步的细胞死得太快。因此,我们选择的比率80% hUCMSC-cultured介质和20%新鲜培养基进行进一步分析。

我们观察到一个显著的区别的形状MCF7细胞暴露于hUCMSC-CM和控制MCF7细胞(图1)。控制MCF7细胞生长很好,继续保持他们的典型形态,也就是说,细胞膜完整,细胞核不明显,细胞多边形,排列有序。然而,MCF7细胞暴露于hUCMSC-CM逐渐死亡,也就是说,细胞表现出pore-induced质膜内陷,但仍主要是完整的24 h后更换培养基,然后细胞表现出肿胀48 h,然后质膜显示明显的破裂,但细胞核仍凝结核的完整性并没有妥协在72 h。


图1
比较分析的形态变化MCF7细胞暴露于hUCMSC-CM和控制细胞。图像得到天1,2,3,4,5。代表显微图显示至少有三个独立的实验。所有图片都获得20 x放大。
3.2。分泌因素引起的hUCMSCs MCF7细胞死亡,但没有显著改变细胞周期

我们决定细胞生存能力每天5 d后治疗。相比与控制细胞MCF7细胞的生存能力受到hUCMSC-CM小幅下降,然后第一天减少不断在接下来的日子里(图2(一个))。来验证是否减少细胞生存能力是由细胞周期阻滞,MCF7细胞的细胞周期在48 h后接触hUCMSC-CM评估。hUCMSC-CM-treated细胞显示降低边际G0 / G1 (51.14±7.27%), S (9.10±5.01%), G2 / M期(10.45±2.80%)相比与控制细胞(55.96±11.69%、14.01±4.58%和21.73±8.90%,分别)(图2 (b));这些细胞周期的变化并不显著(图2 (c))。因此,细胞生存能力下降是由于死亡细胞的数量增加而不是由于细胞周期阻滞。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图2
细胞生存能力和细胞周期分析MCF7细胞暴露于hUCMSC-CM (a) hUCMSC-CM对细胞MCF7细胞的可行性。x设在代表天MCF7细胞暴露于hUCMSC-CM。y设在代表细胞的可行性。细胞生存能力率=(治疗组的平均OD /对照组的平均OD) 100%。结果用MTS扩散的方法。实验进行了一式三份,重复3次。 。(b)流仪分析细胞周期MCF7细胞暴露于hUCMSC-CM。治疗细胞收集后48 h,在hUCMSC-CM培养,沾染了π。(c)定量分析细胞周期。数据提出了三个独立实验的平均数±标准差。hUCMSCs:人类脐带间充质干细胞。
3.3。分泌的因素hUCMSCs通过Pyroptosis MCF7细胞死亡通路引起的

阐明如何的分泌因素hUCMSCs MCF7细胞死亡引起的,我们进行了膜联蛋白V-FITC /π分析。结果表明,在控制细胞,有增加凋亡早期和晚期凋亡细胞的数量随时间( )。hUCMSC-CM-treated细胞,结果表明,没有明显的变化的FITC + /π−象限,但增加FITC + / PI +象限,从24小时1.96%到9.26%在72 h ( )。然而,明显增加发生在FITC−/ PI +象限。只有2.31%在24 h后更换介质,增加到13.76%在48 h和71.12%在72 h(图3)。因此,我们得出这样的结论:死亡MCF7细胞暴露于hUCMSC-CM并非主要由细胞凋亡,并增加发生在FITC−/ PI +象限由于质膜破裂。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
使用膜联蛋白流仪分析V-FITC /π。膜联蛋白(a)流式细胞术结果V-FITC / PI染色。细胞被收集在天1、2和3接触hUCMSC-CM后,分别沾5μL每个膜联蛋白V-FITC和10μLπ。(b)为膜联蛋白定量分析V-FITC /π的结果。数据提出了三个独立实验的平均数±标准差。

随着形态的变化在MCF7细胞暴露于hUCMSC-CM类似pyroptotic细胞中描述文学和pyroptotic细胞可以通过PI染色(8),我们进一步执行TUNEL染色,量化分泌il - 1β验证通过pyroptosis MCF7细胞死亡通路。TUNEL染色标签DNA片段。像凋亡细胞,pyroptotic细胞进行DNA碎片,与TUNEL染色积极20.]。结果表明,控制细胞TUNEL染色呈阴性,但MCF7细胞暴露于hUCMSC-CM TUNEL阳性(图4(一))。ELISA结果显示只有一个微不足道的il - 1β在中控制细胞(不超过5 pg / mL),逐渐减少。然而,在hUCMSC-CM-treated细胞的培养基,il - 1的初始浓度β(25 pg / mL)高于对照组。随后,il - 1的浓度β逐渐增加,即在5天(图翻了一番4 (b))。这些结果表明,正常MCF7细胞分泌il - 1β,但MCF7细胞暴露于hUCMSC-CM分泌il - 1β,它的特点是pyroptotic细胞(21]。因此,我们得出这样的结论:分泌因素hUCMSCs通过pyroptosis MCF7细胞死亡通路引起的。

(一)
(一)
(b)
(b)
图4
MCF7细胞评估使用TUNEL染色和分泌摘要意思β化验。(a)为MCF7细胞TUNEL分析接触hUCMSC-CM后72 h。(b)分泌摘要意思的浓度β从MCF7细胞天0,1,2,3,4,5 hUCMSC-CM敞口。实验重复三次。 。
3.4。度进行了分析,发现RNA-Seq数据显示重要的途径

RNA样本MCF7细胞,控制和治疗细胞(数据来源于三个生物复制),使用bgiseq - 500测序平台。平均来说,大约23.99 Mb每样例生成和读取18174个基因被检测到。此外,23.93 Mb清洁后读取得到过滤数据。清洁的平均映射比读取关于人类基因组是94.63%,并为每个样本的映射结果的一致性表明,样本具有可比性。

为了找到度,计算每个样本的基因表达与RSEM FPKM和度确定使用DEGseq算法。1822 - 775表达下调的基因被确定(|日志2(褶皱变化)| > 1, 值≤0.001)。的基因NLRP1,CASP4,TLR2,TLR6,NFκB,HIF1A,BIRC3显著的调节,Bcl2基因显著下调(表2)。验证基因表达,我们随机选择了调节基因HIF-1A,NF-κB,BIRC3和表达下调的基因Bcl2q-PCR。q-PCR引物的特异性是证实了常规PCR(附加文件3)。低氧factor1-alpha (HIF-1A)是一个主细胞和发育的转录监管机构应对缺氧(22]。核转录因子激活B细胞(NF - kappa-light-chain-enhancerκB)是一种蛋白质的复杂控制转录DNA,细胞因子的生产,和细胞生存。它参与细胞反应的刺激和调节免疫应答中发挥着关键作用感染(23]。Baculoviral IAP repeat-containing蛋白3 (BIRC3)是一种抑制剂抑制细胞凋亡的细胞凋亡家族的成员通过干扰还存在的激活(24]。的Bcl2基因的一员Bcl2家庭的调节蛋白调节细胞死亡,通过诱导(proapoptotic)或抑制细胞死亡(凋亡)(25]。q-PCR结果表明微分基因表达与RNA-Seq结果(图是相一致的5(一个))。

表2
的差异表达基因列表MCF7细胞暴露于hUCMSC-CM。
(一)
(一)
(b)
(b)
图5
基因表达和KEGG途径分析。(一)从q-PCR度验证选择基因。数据提出了Ct (2- - - - - -△△Ct相对于控制)。数据意味着±s.d 。 , ,和 。C:对照组;T:治疗组。(b)的重大KEGG通路( )。 x设在代表数量的基因。y设在代表通路。

识别相关的生物功能,度受到KEGG途径分析。通路功能富集结果(图5 (b))显示,有14个主要途径( ),包括酗酒、系统性红斑狼疮、雌激素信号通路,金黄色葡萄球菌感染,AGE-RAGE信号通路在糖尿病并发症,补充凝血级联,阿米巴病、疟疾、松弛素信号通路、转录misregulation在癌症、安非他命上瘾,可卡因成瘾,胰岛素信号通路,glutamatergic突触。

4所示。讨论

msc是多功能基质细胞,可以从骨髓获得(26),脂肪组织(27),脐带组织,脐血(28]。在治疗方面应用,hUCMSCs相比有一些有益的属性与其他msc。这些属性包括大细胞数量在收获、低免疫原性,传播没有支线细胞,存储在出生后没有对捐赠的重要风险,和缺乏道德争议。体内,msc展览面向迁移网站的肿瘤,抑制肿瘤的生长和转移(11,29日,30.]。因此,msc被认为是潜在的治疗基因生物tumor-targeted交割的车辆(31日- - - - - -33]。体外,msc对癌症细胞的影响研究了通过与msc coculturing癌细胞或培养癌细胞在CM,准备使用新鲜的媒介和媒介msc在培养了好几天。在目前的研究中,我们培养hUCMSC-CM MCF7细胞研究的影响。我们所知,我们首次报告hUCMSCs的分泌因素可以引起pyroptosis MCF7细胞。我们还研究了基因表达在RNA-Seq MCF7细胞暴露于CM。

MCF7细胞的形态学变化暴露hUCMSC-CM透露pyroptosis的特点,也就是说,他们最初的渗透膜完整,其次是细胞肿胀,迅速扩张,最后破裂(34]。在这个过程中,细胞核MCF7细胞暴露于hUCMSC-CM浓缩和DNA片段。质膜破裂,细胞被检测到PI染色(8]。凋亡细胞,pyroptosis细胞TUNEL阳性(20.]。而且,我们发现il - 1的含量明显增加β在中MCF7细胞暴露于hUCMSC-CM。总而言之,我们认为MCF7细胞暴露于hUCMSC-CM接受pyroptosis [21]。在目前的研究中,MCF7细胞暴露于hUCMSC-CM显示肿胀破裂在48 h和72 h。因此,MCF7细胞的生存能力降低48 h后更换培养基。治疗细胞显示没有明显的细胞周期的变化。这表明hUCMSC-CM不能逮捕MCF7细胞的细胞周期。

RNA-Seq结果显示,1822年和775年,表达下调基因在MCF7细胞暴露于hUCMSC-CM,分别与控制MCF7细胞。根据KEGG分析,我们确定了14个重要途径。我们进一步分类这些途径根据KEGG数据库路径(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)。我们发现主要与免疫系统、内分泌系统,神经系统,和与这些系统相关的疾病。结果表明,某些物质hUCMSC-CM可能导致炎症反应和免疫反应MCF7细胞。然而,一些物质会引起内分泌系统紊乱,这主要是由雌激素,松弛素,或糖代谢,和一些其他物质会引起行为反应MCF7细胞接触成瘾物质。

有趣的是,我们发现NLRP1基因显著调节。Nucleotide-binding,富亮氨酸重复pyrin domain-containing蛋白1 (NLRP1)是nod样受体(NLR)家族的一员并在细胞pyroptosis起着重要的作用。作为一种重要的天然免疫分子,其为病原体NLRP1可以识别的分子模式和风险分子模型作为一种模式识别受体(35]。在人类中,NLRP1有能力激活吗caspase-1直接与procaspase-1交互或通过招募适配器蛋白质ASC然后招募procaspase-1形成一个复杂的称为inflammasome [36]。激活caspase-1可以帮助pro-IL-1的成熟吗β和pro-IL-1837),导致炎症促进pyroptosis [38]。根据RNA-Seq结果,caspase-1既不,也不表达下调。这表明caspase-1可能影响pyroptosis通过激活procaspase-1而不是通过增加转录产物。然而,caspase-4半胱氨酸蛋白酶家族成员还存在,明显调节。在人类中,caspase-4功能的受体脂多糖(LPS) [39),这是革兰氏阴性细菌的外膜和能引起pyroptosis [6]。当LPS结合caspase-4, caspase-4进行齐聚反应,导致caspase-1-induced il - 1的成熟β和地震,从而调节pyroptosis [40]。的重要upregulationcaspase-4显示,caspase-4可能发挥重要作用在MCF7细胞诱导的炎症和pyroptosis hUCMSC-CM。从KEGG分析,我们发现系统性红斑狼疮(SLE)是第二个重要的途径。它是一种自身免疫性疾病,确认与NLR家庭成员有关,如NLRP1和NLRP3。我们还发现装配inflammasomes NLR引起的(41,42]。过度inflammasome激活可以促进过度释放il - 1β和地震,造成autoinflammatory障碍和后续发展的自身免疫性疾病,如系统性红斑狼疮(42]。因此,这个通路的浓缩证实hUCMSC-CM MCF7细胞培养时,他们受到炎症。

TLR2、初始相关受体免疫显著调节。TLR2是toll样受体(TLR)家族的一员。某些细胞表面表达,其为病原体识别的分子模式和调节细胞因子的生产开发所必要的有效的免疫(43]。TLR2可以绑定到一个广泛的外源性配体,包括脂蛋白,lipoteichoic酸,肽聚糖、酵母聚糖,lipoarabinomannan, glycosylphosphatidylinositol, phenol-soluble modulin,和糖脂44对革兰氏阳性细菌),从而调节宿主免疫反应(45]。这个函数的TLR2的独特之处在于它能够形成TLR2 / TLR1或TLR2 / TLR6异质二聚体(46]。TLR2-ligand交互激活MyD88信号,然后激活促炎的转录因子,如NF -κB和PI3K / AKT通路(47]。NF -κB把到细胞核调节炎症细胞因子的生产,如il - 1β、il - 6、引发和il - 1244]。仅靠TLR2-ligands刺激没有第二个信号能促进il - 1β释放,但不能诱导细胞死亡(48]。从RNA-Seq的结果,我们还发现,TLR6和NF -的表达κB显著调节。这表明TLR2不是引起的炎症诱发的主要途径MCF7细胞pyroptosis但可能发挥重要作用的刺激分泌的因素hUCMSCs并协助MCF7细胞死亡。从KEGG分析,金黄色葡萄球菌感染被发现第四重要的途径。金黄色葡萄球菌是一种革兰氏阳性细菌,可以认可吗TLR2,这表明TLR2确实是一个重要基因暴露于hUCMSC-CM MCF7细胞的死亡。

低氧factor1-alpha (HIF-1A)是一个主细胞和发育的转录监管机构应对缺氧(22]。HIF-1A的活动直接由细胞氧含量(49,在缺氧条件下,HIF-1A常显著调节转录(50,51]。根据RNA-Seq结果的表达HIF-1A是调节。这表明在hUCMSC-CM MCF7细胞培养时,细胞内低氧环境中创建。约根森et al。34)发现线粒体嵴pyroptotic细胞中倒塌了。线粒体是生产活性氧的主要网站。但是结构,ROS生成主要发生在电子传递链(等)位于内线粒体膜,向内折叠形成脊状形状和叫做嵴,氧化磷酸化过程中(OXPHOS) [52]。因此,倒塌的嵴可能导致减少活性氧的生产(53),从而导致细胞缺氧。事实上,缺氧导致pyroptosis。吴等人发现hypoxia-reoxygenation损伤能诱导pyroptosis HK2细胞(54]。此外,秋等人表明,刺激H9C2高葡萄糖和心肌细胞缺氧/复氧增加NLRP3 inflammasome激活和pyroptosis [55]。此外,自噬抑制活性氧可以限制ROS-modulated caspase-1激活抑制inflammasome活动(56),缺氧也可能是一个负面的反馈机制在应对高MCF7细胞内炎症。最近的研究表明,的表达HIF-1A受NF -κB (57),而HIF-1A限制了NF -κB转录活性,从而防止炎症和控制先天免疫反应(58,59]。这表明upregulationHIF-1AMCF7细胞暴露于hUCMSC-CM可能是一个负面的反馈机制在应对高炎症激活MCF7细胞。

这项研究有一些局限性。我们选择只有一个乳腺癌细胞系验证关键基因的表达。使用MCF7细胞开始于1973年,他们被广泛使用由于其精湛的激素敏感性[60]。然而,乳腺癌细胞系有不同的亚型,其中应验证关键基因的表达。此外,我们只研究基因表达在pyroptotic RNA-Seq MCF7细胞。进一步分析应该进行了更深层次的理解。

5。结论

目前的研究表明hUCMSCs的分泌因素可以促进炎症反应和pyroptosis MCF7细胞。因此,炎症和hypoxia-related基因和通路在细胞MCF7 pyroptosis方面发挥重要作用。虽然需要进一步的研究来描述这些基因之间的相互作用和途径,我们的数据在这个方向上为进一步的研究提供有价值的数据。

数据可用性

生成的数据集和分析在当前的研究中都包含在这篇文章。RNA-Seq分析的原始数据将由相应的作者的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突,关于这篇文章的出版。

作者的贡献

杨娇,赵宏博,成国栋陈了同样工作。

确认

我们感谢美国妇产科昆明呈贡分公司的延安医院帮助人类脐带的集合中。同时,我们要感谢Editage (http://www.editage.com)英语编辑。这项工作得到了云南省重大科技项目(批准号2018 zf007-05),中国国家自然科学基金(批准号81560043),云南省的对外合作项目(批准号2018 ia045)和联合科技部专项资金的云南Province-Kunming医科大学(批准号2017 fe468 (-011))。

补充材料

补充1。额外的文件1:对间充质干细胞表面标记流式细胞术分析。流式细胞仪分析显示CD105的表达,CD90, CD44, CK18和nonexpression CD 45, HLA-DR和CD31 hUCMSC表面。

补充2。额外的文件2:确认表型使用逐渐增加hUCMSC-medium比新鲜培养基。控制:100%新鲜培养基,治疗1:10% hUCMSC-medium + 90%新鲜培养基,治疗2:20% hUCMSC-medium + 80%新鲜培养基,治疗3:40% hUCMSC-medium + 60%新鲜培养基,治疗4:60% hUCMSC-medium + 40%新鲜培养基,治疗5:80% hUCMSC-medium + 20%新鲜培养基,hUCMSC-medium治疗6:100%。

补充3。额外的文件3:使用常规PCR证实q-PCR引物的特异性。DNA标记:DL2000。