文摘
药理方法是部分有效地限制梗死大小。细胞疗法使用的细胞群富含内皮祖细胞(epc) CD133+开辟了新的视角治疗缺血性梗塞后区域。这个临床研究评估的影响心肌内的移植纯化或扩大人类脐带血液CD133+细胞复苏后大鼠急性心肌梗死(AMI)。组织学研究、心电图和荧光原位杂交(FISH)被用来评估心脏复苏。纯化CD133+在内皮祖细胞,细胞,丰富扩大在体外获得一个endothelial-like细胞表型表达CD31和血管性血友病因子(vWF)。梗塞的老鼠接受集团扩大CD133+细胞有一个更重要的心脏重构恢复收缩性能和低于收到纯化CD133的集团+细胞。CD133纯化或扩大+细胞能诱导心肌梗塞的新血管形成一个等价的方式。一些人类细胞中发现的心肌梗塞大鼠移植后28天表明观察可能相关的主要影响旁分泌活动。尽管细胞群体改善梗塞的心脏和血管系统的适用于再生,CD133扩大+细胞更有益的和有前途的候选人为血管再生。
1。介绍
尽管进步在急性心肌梗死(AMI)的诊断和治疗,这心血管疾病继续对公众健康产生重大影响(1]。尽管死亡率已经下降了大约30%在最近几十年,AMI发生率仍然是一个致命的事件大约三分之一的病人。绝大多数情况下是由于冠状动脉粥样硬化和叠加血栓形成。裂缝和顺向目前被认为是动脉粥样硬化斑块破裂的共同病理生理基础出现症状(2]。
后冠状动脉闭塞,周围心肌肌区域进入缺血级联,失去收缩功能。补偿机制是激活恢复心室功能和心脏输出。然而,心肌纤维化和心室壁的厚度的变化导致心脏重构和心室腔扩张的损失函数(3]。
当前药理方法是部分有效地限制梗死大小(4]。恢复心肌灌注是一种血液循环正常化和氧气需求。静脉溶栓与溶栓药物治疗AMI中扮演一个重要的角色。这种疗法是有效的使改道由血栓(冠状动脉闭塞5]。然而,经皮冠状动脉血管成形术是目前黄金标准治疗急性心肌梗死(6),而只适合手术治疗[选定的情况下7]。
最近,一个新的疗法正在研究在临床层面,旨在治疗心肌梗塞患者和以弥补失去的时间前血管再生。使用CD133细胞疗法+细胞群富含内皮祖细胞(epc)的治疗开辟了新的视角后缺血区梗死[8- - - - - -13]。
在先前的研究中,我们的特点和评估CD133的血管生成潜力+CD133细胞和推测,扩大+在纯化CD133细胞可能有临床优势+细胞治疗AMI (14]。在这项工作中,我们进行了深入的研究和证明事实上梗塞的老鼠接受CD133扩大+细胞死亡率减少,显著提高射血分数,大大减少心室重构,更成熟比处理纯化CD133血管化+细胞。人类CD133的数量少+细胞中发现心脏经过28天的治疗建议的改进主要是由于观察到这些细胞的旁分泌效应器分泌。
2。材料和方法
这种动物研究和程序详细综述了本和当地伦理委员会批准的动物研究,身份证号码180。签署知情同意了从每个母亲之前人类脐带血(HUCB)集合。
2.1。内皮祖细胞(epc)的净化和扩张
样品的实验人类脐带血在医院获得维克多费雷拉Amaral从母亲同意参与这项研究。在无菌条件下,HUCB收集从新鲜胎盘与脐带仍然附呈。穿刺进行60和20毫升注射器使用抗凝剂柠檬酸酸葡萄糖(ACD) (JP工业Farmaceutica S.A.暂停后,小溪Preto、巴西)胎盘。
单核细胞的隔离(跨国公司)根据Boyum[的方法执行15)修改使用Histopaque™1.077密度梯度(Sigma-Aldrich,圣保罗,巴西)。内皮祖细胞(CD133+配(微)选择使用CD133-coupled磁Miltenyi研究,Bergisch格拉德巴赫,德国)根据制造商的指示。的纯度MACS-separated亚种群与单克隆抗体经流式细胞术(CD34、CD45和CD133)。隔离后,CD133+细胞被Senegaglia扩大其他地方描述et al。14]。简单地说,孤立的CD133+细胞被镀在25厘米2烧瓶Iscove修改的杜尔贝科的媒体(IMDM)(美国纽约表达载体,大岛屿)补充50 ng / ml血管内皮生长因子(VEGF) (Sigma-Aldrich,圣保罗,巴西),1 ng / ml碱性纤维母细胞生长因子(b-FGF) (Sigma-Aldrich,圣保罗,巴西),2 ng / ml胰岛素样生长因子(IGF)我(Gibco表达载体,卡尔斯巴德,美国),10%胎牛血清(的边后卫)(Gibco表达载体,卡尔斯巴德,美国),和1% penicillin-streptomycin (Gibco表达载体,卡尔斯巴德,美国)。所有的文化都维持在37°C公司为5%2在湿润的气氛中。mac排序后,CD133的数量+细胞获得很低(平均6.6×105细胞)和大约20天的培养是必要的实现融合。之后,细胞通过每3 - 4天。获得足够的细胞数量在活的有机体内实验中,他们使用通道4或5。同时,这种扩张是细胞获取足够endothelial-like表型(14),但保持一个年轻的和高度增殖细胞群没有改变它们的属性或细胞的遗传稳定性。心肌内的注入,细胞准备在1毫升注射器,2×105细胞被稀释在0.3毫升等渗盐水(0.9%氯化钠)(JP工业Farmaceutica S.A.,小溪Preto、巴西)。在对照组,包含只有0.3毫升注射器等渗盐水(0.9%氯化钠)。
2.2。描述的细胞
Immunophenotypic分析是由染色2×105跨国公司、纯化和CD133扩大+每管细胞。分析了跨国公司和纯化细胞后隔离,而扩大细胞分析在3或4。Anti-mouse IgG1抗体共轭和藻红蛋白(PE),异硫氰酸荧光素(FITC) allophycocyanin (APC),和peridinin叶绿素蛋白质(PerCP)(从BD Pharmingen™圣何塞,CA,美国)被用作同形像控制。这些细胞被孵化与单克隆抗体后,以确定他们的典型的细胞表面抗原决定基概要:anti-CD14, anti-CD31, anti-CD34,和anti-CD45(从BD Pharmingen™圣何塞,CA,美国),anti-CD105 (eBioscience Inc .)、圣地亚哥、钙、美国),和anti-CD133 (Miltenyi研究,Bergisch格拉德巴赫,德国)。vWF的细胞内检测,细胞permeabilized使用修复&烫细胞透化作用试剂(美国Caltag,卡尔斯巴德,CA)和进一步孵化isotype-specific FITC-conjugated山羊anti-rabbit抗体(Sigma-Aldrich,圣保罗,巴西)。他们的生存能力是评估7-AAD (BD Pharmingen)染色。细胞染色的数据是使用FACSCalibur流式细胞分析仪(美国加利福尼亚州圣何塞,正欲)和分析与FlowJo软件(美国或树明星,亚什兰)。
2.3。大鼠AMI的实验模型
这项研究包括38岁男性100天的白化病Wistar鼠(鼠形)(平均重量342克)。雄性动物被用来避免雌性老鼠的激素周期。激素周期对我们的研究将添加一个变量。老鼠被安置在敞篷的聚丙烯笼子(41厘米×34厘米×16厘米(高度))组的三个或四个老鼠/笼在温度- (21°C)和湿度(相对湿度55 - 65%)环境下12小时光照周期和随意进入一个标准的啮齿动物食物(NUVITAL®,科伦坡,巴拉那河、巴西)和水。床上用品(松木屑、Inbrasfama圣Jose dos Pinhais巴拉那河、巴西)每天在每个笼子里了。
这个动物模型是根据Capriglione描述的方法进行et al。16]。首次premedicated麻醉的大鼠腹腔内注射(IP)的1.25毫克/公斤安定(安定®5毫克/毫升,Teuto Anapolis,戈亚斯,巴西)和12.5毫克/公斤氯胺酮(Vetanarcol®, 50毫克/毫升,laboratorio康尼锡S.A.、阿、阿根廷)和一个5毫克/公斤肌肉内(IM)注射哌替啶(Dolosal®, 50毫克/毫升,Cristalia,圣保罗,巴西)和40微克/公斤阿托品(SANTROPINA®, Santisa,巴西,0.25毫克/毫升)。注射后5分钟,麻醉诱导使用氟烷(Tanohalo®, Cristalia,圣保罗,巴西)。每个大鼠气管内插管,仍然坚持氟烷麻醉蒸发100%氧气(~ 150毫升/分钟)在一个半封闭的呼吸电路。氟烷麻醉大鼠没有连续交付:这是停在左冠状动脉阻塞的时间或当老鼠在所需的麻醉深度。每个老鼠机械通风使用呼吸机(哈佛模型683小动物呼吸机,哈佛装置,妈,美国),这是设置为70 - 80次/分钟,一分钟175 - 200毫升/分钟的体积。
手术的动物放在背卧位的位置,和一个侧开胸了在左边第四肋间隙,分离背阔肌和胸肌。肋间隙使用开放7厘米AlM self-retaining牵开器可视化跳动的心脏。心包是然后打开使用无菌灵活cotton-tipped杆。冠状动脉左前降枝(LADCA)是首次发现,然后从它的起源阻挡2毫米和左心室边缘之间的肺动脉沟使用以聚丙烯线程(缝线®,Ethicon Inc .,萨默维尔市,美国)。梗塞的面积是立即验证色差和损失的收缩功能。简单的胸腔被封闭在两层打断了4 - 0尼龙单丝缝合线。每个老鼠都回到国内笼从麻醉和手术后完全恢复,一直在实验室标准条件下(见前)。手术后,老鼠接受氟尼辛葡甲胺抗炎(Banamin®,圣保罗,巴西)2.5毫克/公斤/ SC连续2天每天两次和enrofloxacin抗生素(上边5%®,圣保罗,巴西)10毫克/公斤/我每天一次2天。手术伤口用等渗生理盐水清洗(氯化钠0.9%)每天一次,直到完全愈合,缝合是7 - 10天后删除。
2.4。超声心动图评价
经胸廓的超声心动图(TTE)进行七天AMI后28天细胞移植后由一位经验丰富的专业没有知识的实验小组。
TTE,老鼠镇静50毫克/公斤的IM注射氯胺酮和甲苯噻嗪5毫克/公斤(KENSOL®康尼锡,巴西,20毫克/毫升)。当镇静,他们被安置在背卧位的位置与身体稍微向左倾斜。使用多频二维TTE进行线性阵列超声换能器(15 MHz带宽,15个月16日飞利浦超声、美国)的输出被记录在惠普Sonos 5500超声系统。射血分数(LVEF)、收缩末期容积(ESV),舒张末期容积(类别),收缩末期面积(ESA),左心室的舒张区(EDA)测定使用辛普森从图像的方法17]。这些大鼠的心率(HR)是衡量一个心电图仪,同时纳入超声系统。所有超声心动图测量进行了使用相同的设备和被同一考官重复三次。结果表示为三个独立测量的意思。
老鼠与射血分数小于40%,心室功能障碍,包括进一步的实验。
2.5。细胞移植
在AMI后的第九天,老鼠相同的麻醉协议之前和细节描述(见实验模型大鼠AMI的)。防腐前胸部的地区后,老鼠放在一个背卧位位置和平均开胸。左心室的效果地区被染色的不同可视化和疤痕。纯化细胞移植(或扩大)或等渗盐水注射(是)是由一个单一的注入AMI的中央区域。细胞移植手术使用1毫升胰岛素注射器针(13毫米×0.38毫米)包含2×105干细胞稀释0.3毫升。在对照组,曾经使用过的注射器针只包含0.3毫升。胸腔壁通过简单缝合关闭使用肠线4.0肋间肌和皮肤与尼龙单丝4.0。从麻醉复苏后,老鼠相同的抗炎治疗和抗生素使用之前(见实验模型大鼠AMI的),然后回到家里的笼子里,他们一直在28天的实验模型中描述的条件下大鼠AMI。老鼠也跟进日常临床疾病和行为问题的迹象,如侵略或刻板行为。28天后,第二TTE执行安乐死紧随其后。老鼠人道不存在其他老鼠死于过量的氟烷后放置在玻璃感应室用于诱导麻醉。确认死后,每只老鼠尸体剖检。
2.6。组织病理学的心
安乐死之后,每个老鼠尸体剖检和心脏的每一个被组织病理学分析。心被固定在10%中性缓冲福尔马林溶液(研究、Pinhais、巴西)24小时。短暂,formalin-maintained样本在自来水清洗,使用一个提升酒精系列脱水,然后嵌入在石蜡块。部分(5μ米厚)被削减,安装在玻璃幻灯片,水化使用蒸馏水,然后染色。苏木精和伊红染色的心脏组织进行定位梗塞和评估新毛细血管的形成梗塞的面积,然后新血管形成三组比较的结果。分析估计量化的毛细血管,幻灯片是一个奥林巴斯CX41显微镜下检查相机(模型DP25)(奥林匹斯,圣保罗,巴西)连接到显微镜。捕获的图像使用getIT分析程序(软件安装在Windows)。我们使用的100年μ米的放大20 x。心被提交给三横截面,AMI的选择最重要的区域。10倍的客观,梗塞的三个区域,包括一个中心(大的梗塞大小)和两个外围设备(梗塞之间的过渡区和健康的地区)地区,被选中。在三种选择地区,6个随机领域20 x客观选择,然后是毛细血管数。毛细管被定义为一个管状组织结构和至少一个内皮细胞的细胞核和细胞质包含至少一个圆形和血红细胞内部,没有中间层肌肉。
我们计算每个幻灯片的毛细血管在18个领域。分析了20张幻灯片每组。三个调查员进行计数,结果表示为毛细血管周围每个字段的均值,中央,总地区所有三组。同样的组织学幻灯片用于计数毛细血管被用来确定纤维化的相对量通过半定量的分析心脏梗塞的地区使用我们命名为纤维化的值(F.V.)。四的最大值(F.V. = 4)被分配到的糟糕情况下纤维化的观察分析,和一个值为0 (F.V. = 0)代表缺席的情况下纤维化(健康的心脏肌肉)。更具体地说,规模的定义如下:0-preserved心脏组织没有组织学变化;1-thinning心室壁的纤维化沉积在局部地区;3-thinning心室壁的纤维化在扩散区域沉积,但存在一些保存心脏组织;4非常减少心室壁厚度,强烈的胶原蛋白沉积在梗塞的地区。所有的分析都进行这样实验者对样品的身份也不清楚。
2.7。原位移植细胞的分析
石蜡包埋组织切片的鱼准备根据Henegariu [18]。短暂,心脏组织部分保持一小时60°C,放置在二甲苯(默克公司,达姆施塔特,德国)10 - 15分钟,放入二甲苯/乙醇(默克公司,达姆施塔特,德国)解决方案(1:1)10分钟,最后,放置在100%乙醇为十分钟。部分被蛋白酶K的解决方案(20毫升磷酸盐处理(PBS) + 100(美国卡尔斯巴德表达载体)μl 10%十二烷基硫酸钠(SDS) + 200 (Sigma-Aldrich, Steinheim,德国)μl蛋白酶K(美国卡尔斯巴德英杰公司)20毫克/毫升)8 - 25分钟45°C,然后用PBS 3分钟洗净,最后用乙醇脱水五分钟每个解决方案的70%和100%。准备的幻灯片再次脱水乙醇序列的70%,85%和100%两分钟。组织部分被放置在每个幻灯片为人类所有的着丝粒探针(AHC)所示红色(Kreatech诊断,阿姆斯特丹,荷兰)和大鼠Y染色体探针所示绿色(ID实验室Inc .,伦敦,加拿大)。Codenaturation、杂交、清洗根据制造商的说明进行。显示信号,DAPI (Kreatech诊断,阿姆斯特丹,荷兰)用作复染色,遗传物质的亲和力。捕获的图像使用LAS系统(徕卡微系统,曼海姆,德国),绿色,红色,蓝色,和重叠的过滤器。
2.8。统计分析
单向方差分析(方差分析)是用于比较的组对定量变量的超声心动图评估pretransplantation参数。非参数克鲁斯卡尔-沃利斯检验是用来比较的百分比胶原蛋白和组织中毛细血管的数量。学生的t以及配对样本的预处理和posttransplantation用来比较超声心动图参数。获得的结果表示为均值±SD或中值,最小和最大值。值< 0.05被认为是具有统计学意义。所有统计分析使用SPSS 20.0软件。
3所示。结果
3.1。扩大CD133+细胞获得Endothelial-Like表型
的平均体积收集到的11个人类脐带血液样本是93±40毫升。单核细胞获得的平均数量是70±78×106和CD133的平均数量+细胞为0.66±0.62×106人口约占总数的0.95%,单核细胞。在培养CD133+细胞3 - 4通道IMDM包含b-FGF / igf - 1 / VEGF,扩大了细胞的平均数量为1.99±0.89×106(表S1);因此,平均提高3倍观察细胞的数量扩大到纯化细胞进行比较。采集血液体积之间的相关系数和单核细胞的数量,单核细胞的数量和CD133的数量+细胞,CD133的数量+CD133细胞的数量与扩大+细胞分别为0.69,0.84,和0.32,分别。因为它已经被我们组之前显示(14,19)的表型丰富CD133+由表面标记的细胞群,改变大大扩张后,收购一个endothelial-like表型。隔离后,细胞的平均百分比如下:CD133 81%, 82% CD34、CD45 12%, 5% CD14, 8% CD105, vWF CD31的1%和6%。扩大CD133的表型+CD133细胞群平均如下:3%,12% CD34、CD45 2%, 1% CD14, 6% CD105、CD31 85%, 64% vWF(图1(一))。
(一)
(b)
3.2。扩大CD133+细胞改善心脏梗塞的心脏功能,防止重大心脏重塑比纯化CD133更有效+细胞单独
老鼠与AMI包含在本研究被分为三组:对照组(C)接受生理盐水( 与纯化CD133),一组移植+细胞(P, ),一组移植扩大CD133+细胞(E, )。在对照组,33% 15(5)的死亡率在28天的随访观察手术后。在收到纯化CD133的集团+细胞,17% 12(2)的大鼠治疗期间死亡,而在收到扩大CD133的集团+细胞死亡率下降到只有9% 11(1)与对照组相比(图1 (b))。然而,死亡率中观察组无显著差异。评估心脏功能和重塑,几个心血管参数决定建立统计相似性或差异组。值与心率(HR)下降后28天posttransplantation三组,但无统计差异中观察到或组间(表S2)。左心室收缩末期容量(LVESV)预处理和posttransplantation三组进行了分析。在对照组,大鼠表现出收缩扩张的趋势( )。平均交易量pretransplantation和28天posttransplantation 0.53毫升和0.70毫升,分别。另一方面,有一个明确的保护LVESV其他治疗组。集团获得了纯化的LVESV CD133+从0.46毫升细胞波动到0.51毫升( ),与扩大细胞移植组的范围从0.53毫升0.48毫升( )。没有观察到显著差异之间的具有重要老鼠LVESV组P、E ( ),而P和C(之间的差异 )和E和C之间( )(图2(一个)和表S3)是显著的。左心室舒张末期容积(LVEDV), C组显示显著增加LVEDV比较预处理和具有重要大鼠从0.73毫升0.99毫升值为0.015。组P还显示从0.67毫升显著增加到0.83毫升( ),显示左心室的扩张在C和P组。相反,E组不显示LVEDV显著增加,从0.73到0.80毫升( ),因此保存(图左心室2 (b)和表S4)。
(一)
(b)
(c)
(d)
平均值的左心室的收缩末期区域(LVESA)预处理和具有重要老鼠相比,而且没有观察到显著差异在每个组(图2 (c)和表S5)。此外,末尾的28天的随访中,没有观察到显著差异在LVESA值组。相比之下,左心室舒张末期的数据区域(LVEDA)预处理和具有重要老鼠明显不同团体之间C(预处理= 1.21厘米2和后处理= 1.43厘米2; )和P(预处理= 1.16厘米2和后处理= 1.30厘米2; )。在E组,值从1.22厘米不等2- 1.26厘米2与 。因此,有一个显著增加舒张区组C和P,而E组(图没有明显不同2 (d)和表S6)。
最暴露的心脏功能参数之一是LVEF。均值LVEF的健康Wistar鼠已经完善,大约是80%20.- - - - - -22]。在我们的研究中,我们包含了老鼠在EF < 40%梗塞后,代表切断损伤心脏功能由于noncontractile纤维组织的相当大的地区。LVEF百分比的对照组和显示轻微的但不具有重要的显著增加从27.4%降至29.9%(Δ= 2.5%), 。在纯化CD133的集团+细胞,有一个趋势改善射血分数从31.1%到38.3%(Δ= 7.2%, ),尽管并没有显著的差异。值得注意的是,该组织移植和扩展CD133+细胞表现出显著提高LVEF从28.6%到40.0%(Δ= 11.4%, )(图3(一个)和表S7)。重要的是要注意,没有观察到的差异在移植前组( ,图3 (b));然而,posttransplantation组收到CD133扩大+细胞与对照组相比明显不同( ,图3 (c)和表S7)。
(一)
(b)
(c)
3.3。扩展或纯化CD133的移植+细胞减少纤维化和显著增加血管化在梗死后心肌组织
来确定心肌组织纤维化的程度,进行了半定量的显微分析(更多细节,请参阅材料和方法)。在没有收到细胞疗法的对照组,心肌组织保持着典型的AMI模式与大面积心肌组织纤维化之间的岛屿(F.V. = 2.8;SD = 1.03)。此外,可以观察毛细血管减少比移植组和对照组没有证据表明新的vascular-like结构(圆形或网络)表明毛细管(数据形成4(一)和4 (d))。P组更大的地区的岛屿被确定和心肌组织纤维化区域与C组相比(F.V. = 1.8;SD = 0.89)。无数毛细血管的血管床的形式安排移植区域观察。与此同时,结构类似于毛细血管形成的不同阶段组织很明显都有或没有红细胞内(数字4 (b)和4 (d))。值得注意的是,E组的心显示更少的地区的纤维化(F.V. = 1.53;SD比组P = 0.53),但差异无统计学意义。与对照组相比,在E组纤维化明显减少。此外,许多成熟的血管和几个结构相似的存在没有观察红细胞最近成立的毛细血管。毛细血管显示布局模式,与更成熟的网络比观察组P(数字4 (c)和4 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
评估缺血组织的血管再生的程度进行了定量分析,识别和计数梗塞的毛细血管和peri-infarcted地区三组。毛细血管的平均数量的中部地区在C组梗塞面积是22.5,38.7,P组,和38.2在E组的外围区域,C组毛细血管的平均数是25.0,47.8,P,和37.5组E .当评估总包括梗塞和周边地区,毛细血管C组的平均单位面积为23.7,43.2,P, E组和37.8,表明有益血管生成的影响CD133细胞移植与纯化或扩大+细胞(数据4(一)- - - - - -4 (c)和4 (e))。获得信息毛细管成熟、比较形态学分析纯化和扩大CD133+组织执行,建议不同模式之间的群体。具体来说,毛细血管E组中观察到有一个更发达的形态与毛细血管组相比p组中的毛细血管,获得纯化CD133+细胞有一个较小的口径和通常是由一个包含一个红血球细胞的内皮细胞。在E组毛细血管规模较大,多由内皮细胞(2 - 4细胞),并包含许多红细胞(> 5)(图4 (e))。
3.4。一些移植CD133+细胞28天后仍在梗塞的心肌组织
来确定人类净化或扩大CD133+细胞移植到AMI通过单一的中心区域心肌内的注射移植后仍出现在该地区28天,鱼使用人类pancentromere-specific进行分析调查。移植细胞被发现在两个细胞组,P, e .对照组8老鼠测试并没有观察到FISH-positive细胞(图S1九个测试的),在五组的老鼠P(图S1B)和五的八大鼠组E(图S1C),观察人类细胞。在所有情况下,积极的人类细胞稀少,因此样本处理鱼的分析,不可能辨别如果人类细胞整合到血管。
4所示。讨论
虽然在某种程度上有争议的(23- - - - - -25),纯化CD133+细胞富含内皮祖细胞与原单核细胞的人口相比,此外,CD133扩大+细胞标记CD31的表达增加+和vWF+典型的endothelial-like细胞(14,19]。大多数使用CD133的报告+细胞群(11,26- - - - - -28内皮祖细胞[]或扩大12,19,29日)治疗心脏梗塞动物模型显示某种类型的改进对心脏功能和血管化与变化由于差异研究。移植细胞来源、细胞纯化、细胞,移植,路线和时间的治疗梗塞后可能影响治疗的有效性。单核细胞总数甚至只包含1.5%的内皮祖细胞(9,30.)被证明在梗死后心脏功能起到有益的作用。没有之前的研究分析了几种并行心脏参数,纤维化水平,新血管形成,移植比较内皮祖(CD133高CD31低)细胞和endothelial-like (CD133低CD31高)细胞来自同一来源。超声心动图结果显示更有效和重要的左心室功能的恢复成人endothelial-like治疗组细胞祖细胞治疗组。最梗塞的老鼠组左心室功能恢复。
尽管所有的老鼠LVEF < 40%的移植前,梗塞模型用于这项工作导致大变化的射血分数。动物的范围从大约25%到40%在所有组。值得注意的是,即使在这样的变化实验组织移植前,收到扩大CD133的老鼠+细胞显示不仅强劲提高LVEF也舒张维度的保护,防止膨胀和重构。关于收缩末期容积和区域,观察重塑的预防治疗组。因此,考虑的整个结果集,提出的假设在我们之前出版14CD133]说明扩大+细胞会比候选人纯化细胞对心肌梗塞的治疗在目前的研究证实。
按照以前的出版物(9,12,14,19,28,31日,32),我们的组织学分析证实了新血管形成的诱导的两组细胞与对照组相比。然而,扩大CD133+细胞显然形成了发达的毛细血管纯化CD133相比+细胞,观察不成熟的血管化的迹象。类似的结果Schuh et al。31日)使用培养成熟的内皮祖细胞表达标记细胞。新血管形成也证实在胡锦涛的研究(9,12]。组织学分析和毛细血管密度结果显示更高层次的毛细管内皮祖细胞培养组的形成源于HUCB和移植到大鼠AMI。在我们的研究中,扩大CD133+细胞被维护在更长一段时间文化;然而,细胞剂量较小的五倍。这可能表明,种植可能导致最有效的关于心脏修复的细胞类型。
Asahara et al。33,34)在急性缺血性心肌病大鼠模型显示,内皮祖细胞参与新生血管形成过程的迁移和合并到缺血,导致组织补救行动。然而,在我们的研究中,CD133+细胞来源于HUCB被确定在大鼠的心肌梗塞在极端低的数字。因此,它是合理的推测,人类细胞移植到大鼠行为主要以旁分泌的方式诱导血管生成。此外,功能和组织学结果似乎表明,从扩大CD133旁分泌信号+比纯化CD133细胞更有效+细胞。它已经表明,CD133+分泌细胞表达血管新生因子如vWF [35]。最近,我们已经表明,从扩大CD133细胞外囊泡+细胞含有蛋白(36)和微rna(未发表的数据)参与各种angiogenesis-related功能。CD133的扩张+细胞的结果在一个更成熟的内皮细胞表型14,32),这可能改变的分泌因子和细胞外囊泡的内容支持更快速和有效的血管化组织的损害。按照这个,扩大但不是纯化CD133+细胞表达VEGF mRNA水平由rt - pcr检测(14]。除了临床前研究,一些近期的临床研究也进行了使用CD133+细胞。这些研究已经开始显示,自体CD133的使用+细胞似乎是安全的,有小37)到中度(38)积极作用治疗受伤的心。Kurbonov et al。38)最近表明,自体单内注入纯化CD133+细胞从骨髓中分离的净积极响应,减少梗塞大小的病人。我们的发现可能呼吁CD133的进一步扩张+细胞在体外移植前。
5。结论
尽管细胞群体改善梗塞的心脏和血管系统的适用于再生,CD133扩大+细胞更有益的和有前途的候选人对心脏和血管再生。根据可用的临床前和临床结果和本文提供的结果,我们强烈相信CD133低CD31高(扩大CD133+)细胞是一种很有前途的候选人为将来的临床试验。
伦理批准
这个手稿的作者注册,他们遵守道德原则发布的干细胞国际。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
Alejandro科雷亚和加布里埃尔萨勒斯Ottoboni贡献同样这项工作。
确认
这项工作是支持的银行Nacional de Desenvolvimento期中e Social-BNDESMCT / FINEP /女士/ SCTIE /十进数字(09.2.0591.1)和CNPq (457344/2013-0)。作者感谢伊莱恩·马丁斯社论援助和Fabiane Barchiki行政支持。
补充材料
补充1。表S1:体积的血液和细胞的数量从11个样本的收集/净化/扩展人类脐带。
补充2。表S2:心率数据。
补充3。表S3:左心室收缩末期容量的统计数据。
补充4。表S4:左心室舒张末期容积的统计数据。
补充5。表S5:左心室收缩末期面积的统计数据。
补充6。表S6:左心室的舒张区域的统计信息。
补充7。表S7:左心室射血分数的统计数据。
补充8。图S1:一些移植人类细胞中发现了老鼠的心脏梗塞的地区经过28天的治疗。梗塞的核心部分是鱼加工染色使用人类pancentromeric探测器(红色)。核与DAPI染色(蓝色)。代表三组的显微照片:控制/车辆(A),与纯化CD133移植+CD133细胞(B),扩大+细胞(C)。规模酒吧:7.5μm。