文摘
在许多年里,构建基因和表型稳定行神经干细胞(NSC)的临床用途,目的是恢复不可逆损失函数神经组织的多个研究小组的主要目标之一。干细胞的独特的能力来维持自己的多能性状态甚至在成人的身体让他们选择研究对象。与诱导多能干细胞技术的发展(万能)和直接体细胞的分化转化为所需的细胞类型,最初的研究方法的基础上,使用同种异体nsc从胚胎或胎儿神经组织逐渐成为过去的事。本文处理基本分子机制维持多能胚胎的状态/诱导干细胞和体细胞重新编程,以及目前现有重组策略。重点是执行直接重新编程而绕过阶段则以遗传不稳定,增加肿瘤发生的风险。各种协议的详细描述获得重组神经细胞用于治疗神经系统病理。
1。介绍
最初,恢复多潜能分化细胞的技术是在1952年由r·布里格斯和T.J.国王用核移植的方法(1]。然而,第一个真正的多能细胞胚胎干细胞分离在1981年由两个独立的团体从早期小鼠胚胎1]。同时,建议刺激增殖和分化的抑制可能是由于某些因素在细胞培养基(2]。这种思想继续发展积极逐渐演变成定向细胞“重编程”的假说。然后,赫尔曼et al。3]报道一篇论文包括六个协议的重新编程来源于人类的骨骼间充质干细胞(msc)神经干细胞通过增加细胞培养基的鸡尾酒的因素。特别,各种生长因子如脑源性神经营养因子(BDNF)、血小板源生长因子(PDGF)、表皮生长因子(EGF)、纤维母细胞生长因子2 (FGF-2)和视黄酸,维生素a的代谢所必需的支持细胞生长,。培养细胞的协议在飞机上涂上poly-L-lysine和neurospheres中形成low-adhesive涂料开发培养。山中,高桥和(4]报道这项技术产生多能性细胞分化的体细胞通过retrovirus-mediated异位表达octamer-binding等四种基因的转录因子4 (Oct4)决定性别的地区Y-box 2 (Sox2) Kruppel-like因子4 (Klf4),禽流感病毒致癌基因myelocytomatosis同族体(原癌基因)。这四个基因是现在被称为“山中因素”或OSKM因素。从这个事件开始,遗传细胞“重编程”的时代,而无需使用核移植已经开始。
除了iPSC技术,第一个报道的可能性直接转分化的体细胞(包括中胚层起源的)神经干细胞/祖细胞出现(5,6]。在本文中,我们将关注关键信号级联的获取和维护多能性和分析当前协议由万能干细胞获得神经干细胞以及通过直接分化转移。
2。Pluripotency-Maintaining机制
真的,多能细胞是胚胎干细胞(ESCs)源自囊胚的内细胞团。ESCs的多能性状态的特点是缺乏细胞分化和增殖活性高。ESCs的偏见细胞周期g1期缩短和延长s阶段已经被观察到,这可能是由于减少的细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs) [7]。端粒酶活性增加也是典型的ESCs [8]。这被认为是由于原癌基因表达的转录因子(9]。此外,大量的转录和染色质重塑因素参与维护的ESCs的多能性,也就是说,Oct4、Sox2, Klf4, Nanog [10,11)以及demethylases和组蛋白去乙酰酶抑制剂(12- - - - - -16]。在成人干细胞,同样的因素是参与维持多能性。多能性的形成和维护需要多个信号通路的激活或抑制。下面的关键信号机制被认为是。
2.1。信号通路
2.1.1。Jak / Stat信号通路
这是一个主要途径的信号受体I型干扰素等细胞因子,粒细胞集落刺激因子(g - csf)和白细胞介素(2、IL-3 il - 4、il - 6、il - 10 il - 12,和IL-13) (17]。在这个信号,一个家庭的杰纳斯蛋白激酶(激酶)和信号传感器和转录激活蛋白(统计)扮演了一个关键的细胞内信使的角色。最广为人知的因素触发这个级联是白血病抑制因子(生活),属于白介素家族(18]。似乎生活影响的高亲和性受体介导通过复杂组成的低亲和力LIF-binding链(生活受体)和高亲和性转换器单元,gp130。木菠萝然后激活受体磷酸化酪氨酸的氨基酸残基。STAT转录因子反过来可以加入他们的行列。JAK激酶磷酸化STAT加上受体导致其离解的受体和进一步的二聚作用。STAT二聚体把原子核和激活的表达一种基因控制网络,包括编码转录因子的基因Klf4 [1和原癌基因19]。
2.1.2。MAPK / ERK信号通路(MEK)
MEK prodifferential信号通路。在回应刺激激活酪氨酸激酶受体和受体与g有关。一个复杂的分子组装的胞质域激活受体,激活的Ras GTPase。顺序反过来,它激活皇家空军和MEK。这些激酶激活MAPK激酶,通过ERK的磷酸化调节转录因子的表达,例如,通过磷酸化转录因子Nanog,从而减少其transactivation [20.]。此外,由于ERK的磷酸化,c-Fos protooncogene转录激活促进epithelial-mesenchymal过渡和违反多能状态(21]。因此,一方面,抑制这种途径提供了保存的多能性(22]。另一方面,这个途径移植原癌基因活性,促进更积极积累细胞周期蛋白D / Cdk4/6情结;因此,完整的敲出Erk1和Erk2基因导致端粒功能中断,过早启动细胞凋亡系统,消极地影响细胞周期(23- - - - - -25]。
2.1.3。PI3K / Akt信号通路
PI3K / Akt通路密切相关MAPK / ERK信号通路(MEK) [26),因为它是通过的影响间接激活GTPase Ras在phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) [27]。这是一个普遍的下游信号通路与瀑布,其中一个磷酸化,激活蛋白激酶B,也称为Akt1和维持多能性中扮演着重要的角色28),主要是由于通过抑制细胞凋亡的抑制坏的蛋白质和细胞凋亡蛋白酶9 (29日,30.]。此外,它间接提供的细胞周期G1转向s阶段由于GSK-3抑制蛋白激酶和随后形成的细胞周期素D / CDK复杂31日]。Akt也能直接调节细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)的抑制剂p21 Cip1和p27 Kip1,影响细胞周期(32]。有趣的是,尽管MAPK / ERK通路促进PI3K通过GTPase Ras激活,Akt块通过抑制MAPK / ERK通路Raf蛋白激酶(33]。
2.1.4。Wnt /β连环蛋白信号通路
Wnt信号通路是必要的适当的胚胎发育和内稳态的成人组织。在下行级联途径,强调规范化途径基于细胞质的稳定β连环蛋白的蛋白质。在缺乏从Wnt信号受体,β连环蛋白磷酸化是一个复杂的腺瘤息肉病杆菌(APC)之间,Axin-1,蛋白激酶GSK-3,酪蛋白激酶(对照)。绑定Wnt受体配体的提升者抑制这个复杂的一连串的事件,导致的积累β连环蛋白在细胞质中34]。如果过度堆积在细胞质中,β连环蛋白进入细胞核,它激活转录监管机构如t细胞因子(TCF)和淋巴enhancer-binding因子1 (LEF1)和导致proproliferative基因的转录,如原癌基因和细胞周期蛋白D1 (35,36]。此外,β连环蛋白失去活性转录因子3 (Tcf3),抑制Oct3/4, Sox2, Nanog与Oct4从而增加其活动。
2.1.5节讨论。刺猬(Hh)和信号通路
刺猬(Hh)信号通路参与了许多发展过程,如细胞增殖和分化包括神经干细胞的调控。在脊椎动物中,通过这个途径信号感应是由三个主要配体:声波刺猬(嘘),印度刺猬(本次)(参与颈板开发),和沙漠刺猬(DHH) [37]。通过Hh信号转导通路是由PTC1之间的相互作用,蛋白质磷酸酶和波动性(SMO)的蛋白质。假设PTC1徒通过催化机理,及其没有不利影响SMO活动(38]。在非活动状态,PTC1压制SMO,在细胞质中形成一个不活动的复杂装配2肋(Cos2),融合(Fu),抑制富(SuFu),和前臂中断(Ci),所有与微管相关。复杂的稳定性是由蛋白激酶A (PKA),酪蛋白激酶Iα(长江基建α),糖原合成酶激酶3β(Gsk3β)。PTC1-mediated磷酸化SMO的差别导致了对这些基因,所以,SMO是被磷酸化激活。这有助于Cos2的顺序激活和傅随后释放Ci的复杂和随后的激活。接下来,Ci把原子核,它充当一个转录因子(39]。这种途径是最强烈参与胚胎发育。在成年人的生物,这个途径通常不是激活组织regeneration-triggering情况下除外。
Notch信号通路是细胞间相互作用的重要调节器在胚胎发生过程中,细胞增殖,分化和细胞凋亡39]。Notch通路是一个相对较短的;它包括的四个膜受体切口(1 - 4),当绑定到配体的细胞外的一部分经历蛋白水解解理与ADAM-type metalloprotease,及其胞内裂解的一部分γ分泌酶。切口蛋白的细胞内部分剩余解理把原子核后,形成一个复杂的转录RBPJ蛋白质(CBF1)和作为转录因子(40]。激活这个途径是必要的维护人类的ESCs的扩散和多能性和成年细胞的正常功能。
2.1.6。TGF -β信号通路
TGF -β信号通路中发挥着重要作用的发展。TGF -β可以通过激活诱导细胞死亡的两个信号通路如SMAD或DAXX。TGF -β二聚体结合第二个类型受体(TGFBR2),然后组装与第一类受体(TGFBR1)其次是其磷酸化。此外,信号事件涉及和磷酸化R-SMAD受体SMAD3互动。SMAD3形式和SMAD4 heterodimeric复杂,进入细胞核,充当一个转录因子等各种基因proapoptotic基因(41]。SMAD通路被细分为Smad1/5/8 Smad2/3-dependent分支。Smad1/5/8分支包括骨形成蛋白(bmp),特别是BMP4,被认为发挥重要作用在维护LIF-STAT3通路的活动(42]。Smad1/5/8通路受到抑制的upregulation Smad2/3通路,进行信号激活素,刺激的表达多能性因素,如Nanog Oct4、FGF-2/8和节点。同时,Smad3独立形成一个复杂和Oct4直接调节它的许多目标(43]。TGF -β还与DAXX触发凋亡(死亡率蛋白质6),主要在淋巴细胞和肝细胞。
2.1.7。FGF信号通路
纤维母细胞生长因子家族的大多数蛋白质通过中的autophosphorylated交互和传递信号通过四个主要途径:RAS-RAF-MARK (ERK), PLCγpkc、PI3K-AKT和JAK / STAT,进而导致各种转录因子的激活。例如,FGF2主要纤维母细胞生长因子,通过Smad2/3通路激活素A,一起刺激Nanog[的表达44]。
显然,上述信号通路都不能够独立维持多能性的状态;然而,对他们可能允许一个复杂的影响,虽然不完全,控制增殖,分化,细胞的发展。正如上面提到的,这些信号机制通常导致多种转录因子的激活包括Oct3/4 Sox2, Nanog Klf4,原癌基因。此外,一些染色质调节器、矩阵和小分子核糖核酸(大鹏)为多能性的维护,以及在实验的体细胞重编程的情况下,重组蛋白和小分子。
2.2。转录因子
转录因子Oct3/4 (Pou5f1)、Sox2 Nanog多能性被认为是主要的形式。除了这些,还有其他因素,如Sall4 Klf4, Stat3以及所代表的一个重要multiprotein复杂Myc癌蛋白。
2.2.1。Oct4
普Oct4属于家庭Pou5f1 homeodomain蛋白质和编码的基因。最初,其表达决心ESCs和细胞癌(45]。Oct4的研究表明,抑制小鼠的ESCs导致分化为滋养外胚层细胞,增加表达Oct4转型为原始内胚层、中胚层,引起的可能的差别可能是由于Oct4-mediated对这些CDX2的表达(46]。一些已知Oct4目标包括FGF4 Utf1, OPN, Rex1 / Zfp42 Fbx15, Sox2,都是多能转录因子(47- - - - - -49]。Oct4与这些因素控制多能性基因的表达水平例如Nanog等。然而,调节Sox17可能取代Sox2 Oct4作为合作伙伴,导致开关从一个多能性内胚层的分化(50]。Oct4可能调节靶基因的表达与Sox2异质二聚体(47以及单体的和homodimeric形式,例如,OPN的[51]。
2.2.2。Sox2
Sox2 (SRY基因-性别决定地区(Y)框2)属于转录因子家族中的SOXB1子群与一个高机动dna结合域(52]。Sox2在成年细胞表达和囊胚的内细胞团53]。Sox2目标基因的一部分与Oct4目标基因重叠,特别是基因如Fgf4 Utf1, Fbx15, Nanog [47,54- - - - - -56]。Sox2-deficient鼠ESCs分化为滋养外胚层,但增加Oct4支持细胞多能性的表达即使在Sox2基因的敲除,显然由于Sox2和Oct4协同表达。然而,过度的Sox2 ESCs可能影响扩散的维护(57),但这种影响的机制还不清楚。
Sox2股票一个表达式与Oct4网络,形成一个复杂之后,它调节目标基因的工作。最初,Sox2结合靶基因的启动子或增强子序列,和heteromerization Oct4稳定这个绑定(58]。Oct4 / Sox2复杂相互作用与目标DNA序列在一个时尚的两倍。连续的复杂可以绑定到“规范”网站也没有休息,加入主题相隔几双基地(59]。
2.2.3。Nanog
Nanog是homeodomain转录因子参与无差别的ESC的自我更新。它作为生活的催化剂(60),但是当中,这个因素能够维持细胞增殖没有生活(61年]。ESCs Nanog-deficient小鼠,有趣的是,虽然容易分化,仍然可以保留多能性(61年]。Nanog是调节扩散通过抑制特定基因的表达,例如,Gata4 Gata6,促进分化成原始内胚层[61年),以及通过激活等Rex1 [62年]。此外,Rex1也是一个目标为Oct4基因/ Sox2复杂。
作为目标Oct4、Sox2 Nanog反过来可能相互地刺激这双的协同活动,尤其是通过激活Oct4基因的启动子63年]。事实上,这三个因素形成一个动态监管网络,支持细胞增殖(64年]。Nanog基因的启动子,有一个结合位点Oct4 / Sox2 heterodimeric复杂(65年]。Oct4 / Sox2刺激Nanog表达式,但当Nanog是过度繁殖异质二聚体抑制其表达(63年]。这三个因素的相互影响是一个大型网络的一部分,负责维持多能性。优惠目标STAT3基因编码、ZIC3 Oct4, Sox2, Nanog本身。这表明活动的一种自动调整的模式控制这些因素,以及基因信号通路的组件。一起三个因素上调teratocarcinoma-derived生长因子1 (TDGF1),左右确定因子2 (LEFTY2) dickkopf-related蛋白1 (DKK1), GSK-3-binding蛋白质。TDGF1和LEFTY2 TGF -的组件β信号而DKK1和FRAT2参与Wnt信号机制(66年]。除了积极的调控这些基因是重要的维持增殖,Oct4、Sox2,和Nanog抑制许多prodifferentiation转录因子的活动活跃在胚胎时期,例如,ESX1I, HOXB1, MEIS1, LHX5, LBX1, MYF5, ONECUT1 [66年]。Oct4、Sox2 Nanog也调节表达一些微rna(大鹏)包括mir - 296, mir - 302, mir - 137, mir - 124 a,对神经组织的正常发育至关重要(66年,67年]。
Propluripotent转录因子能够直接相互作用形成蛋白复合物。例如,Nanog可以绑定到一个SMAD1然后抑制骨形成蛋白4 - (BMP4)介导的分化途径(68年]。Nanog也与转录监管机构如Oct4、DAX1、母,ZFP281, SALL4 [69年链接),从而形成通过他们与其他调控蛋白,包括蛋白质Polycomb集团(69年]。Oct4与Nanog分享一些常见的伴侣蛋白,例如,SALL4, ZFP281和DAX1。此外,Oct4与转录因子交互,如KLF4 SOX2, TCFCP2L1并形成复合物和表观遗传机制的组件如卑微的人,瑞士/ SNF PRC1, MYST2, DNMT3A [70年,71年]。因此,维持多能性的主要因素具有交互的复杂性。
2.2.4。Klf4
Klf4属于Kruppel-like因素的家庭,这是“锌指转录因子参与控制细胞分化和增殖的基因的表达。因此,利用RNA干扰(RNAi)抑制Klf4诱导分化的ESCs的72年)而增加表达Klf4停止分化,提高Oct4表达式(73年]。同时,Klf4结合Oct4和Sox2增强Nanog[的表达74年]。如前所述,Klf4直接有针对性的STAT3信号通路和Nanog [75年]。然而,Klf4增加水平的消极的细胞周期调节p21 [65年),增加细胞的分化还会使p53、proapoptotic监管机构(76年]。同时,Klf4配合Oct4和Sox2在抑制p21-encoding Ink4轨迹,从而促进增殖的维护(77年]。
2.2.5。Myc
Myc家族,包括原癌基因、N-Myc L-Myc,是独特的因为其成员行为不仅是古典转录因子也可以影响染色质的结构通过激活组蛋白乙酰转移酶(78年]。Myc是通过激活许多信号通路包括生活/ STAT3 Wnt,嘘,MAPK / ERK。Myc在扩散中扮演着重要角色,分化和细胞凋亡。作为一个典型的prooncogene,它为细胞提供了一个选项来维持多能性。有趣的是,虽然单独的原癌基因失活和N-Myc多能性没有任何影响,同时抑制导致分化成原始内胚层、中胚层(79年]。然而,结果表明,Myc抑制MAPK信号传导机制,因此,抑制分化(80年]。移位的G1-S过渡细胞周期的多能性,促进增殖率的特征。这可能归因于CDKs[的控制活动81年),可能由于Myc蛋白质的活动包括原癌基因,以应对STAT-dependent途径激活(19]。靠Klf4和原癌基因,诱导细胞重新编程,但多能的结合至少一个因素如Oct4、Sox2, Nanog可能增加重组的效率(82年]。
总之,应该强调Oct4 Nanog, Sox2 Klf4, Myc起到至关重要的作用,在维护多能性的细胞。所有这些因素也强烈prooncogenes因为他们刺激增殖和分化。通常情况下,这些因素都严重参与胚胎发生的控制。然而,过度的多能性转录因子可能增加恶性化的风险和致肿瘤性,事实时应该考虑iPSC技术是临床实施。
2.3。表观遗传因素
2.3.1。小分子核糖核酸
大鹏是小非编码rna参与表观遗传调控细胞周期、细胞凋亡、增殖、迁移和分化83年]。帽子和Dgcr8基因的突变,都是米尔生物起源的关键元素,导致细胞周期的破坏和损失控制的增殖和分化(84年,85年]。某些大鹏调节和维护ESCs的多能性状态。例如,mir - 302和mir - 290规范的表达Oct4、Sox2, Nanog;这些大鹏不分化细胞中发现86年- - - - - -88年]。相反,另一个大鹏展翅的人口仅在成年人的体细胞,他们保持分化状态(84年]。例如,mir - 134执行这个通过抑制Nanog [89年]。的功能Oct4、Sox2 Nanog,大鹏是相互地相互关联的。例如,mir - 134, mir - 296,和mir - 470可以抑制Oct4的活动,Nanog, Sox2 [90年]。mir - 200 c, mir - 203,和mir - 183抑制Sox2 Klf4 [91年]。另一方面,Lin28转录监管机构会使let7米尔家族的表达,一个健壮的肿瘤抑制,触发细胞分化[92年]。目前,研究人员开发人工多能细胞使用米尔转染代替传统的转录重组因子,特别是miR - 200 c, miR - 291 - 3 - p, miR - 294, miR - 295 (93年),mir - 200 c, mir - 302年代,mir - 369 (94年),mir - 302和mir - 367 (95年]。
2.3.2。染色质的修改
染色质的表观遗传修饰调控发挥关键作用的基因表达。表观遗传机制影响转录监管机构的可访问性基因启动子和增强子,包括基因在维持多能性状态。染色质的修改包括DNA甲基化/脱甲基、组蛋白修饰、染色质的结构拓扑变化。
DNA甲基化是一个可逆的表观遗传修饰,由DNA甲基转移酶,酶催化甲基化的胞嘧啶的家庭形式5-methylcytosine (5 mc)。在哺乳动物中,最研究DNA甲基转移酶家族的成员(DNMT) DNMT1,种能阻碍DNMT3b DNMT3a,。DNMT1负责复制的DNA甲基化,而种能阻碍DNMT3b DNMT3a和参与从头甲基化(96年]。在全能的受精卵,染色体DNA几乎unmethylated,但在分化[甲基化率逐渐增加97年,98年]。相比之下,全能的受精卵,ESCs的基因组甲基化(99年),这显然表明从全能性过渡到多能性。然而,在终末分化细胞的基因组甲基化水平急剧减少(98年]。分化的细胞变得越强,Oct4和Nanog是启动子区域的甲基化在这些细胞(99年]。
DNA甲基化着丝粒和precentromeric地区对正确的异染色质的形成很重要。CpG岛位于启动子或增强子等监管区域的优先目标甲基化(One hundred.]。最近,一个春节methylcytosine加双氧酶家族酶被发现。春节酶催化的氧化5-methylcytosine (5 mc) 5-hydroxymethylcytosine (5 hmc),所以他们可以作为demethylases通过执行氧化脱甲基作用。哺乳动物春节家庭由三个成员组成:TET1 TET2, TET3。ESCs TET1是高表达TET2所需脱甲基的基因负责多能性。在分化表达TET1和TET2减少。TET3是诱导生殖细胞在胚胎发生的发生101年]。通常,5 mc是本地化在染色体的着丝粒和precentromeric地区5 hmc位于CpG小岛的染色体的肩膀102年,103年]。
一般来说,染色质的修改涉及DNA甲基化和组蛋白的转译后的修改(104年]。后者包括组蛋白乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化,生物素酰化,citrullination求和。我们只提到一些。酶组蛋白修饰符包括多种因素,如组蛋白甲基转移酶(hmt),蛋白质Polycomb集团demethylases (hdm),组蛋白乙酰转移酶(帽子),而组蛋白去乙酰酶抑制剂(hdac)。组蛋白3 (H3)是一个典型的目标epigenetically修改。最常见的修改是赖氨酸的甲基化4 (H3K4me),赖氨酸9 (H3K9me),赖氨酸27 (H3K27me)和赖氨酸36 (H3K36me3)、以及赖氨酸乙酰化的27 (H3K27ac)。修改H3K4me3, H3K9ac、H3K27ac H3K36me3可以优先满足常染色质的地区而H3K9me3和H3K27me3异色的区域主要分布在(105年]。
Polycomb小组的成员(PCG),组蛋白甲基转移酶的活动,最重要的是参与染色质重塑和基因的表观遗传沉默。有两个PGS-related蛋白复合物,如1 (PRC1)和PRC2 Polycomb压抑的复杂。一般来说,形成的配合物催化压抑的表观遗传标记在3组蛋白如H3K27 H3K9,异色的地区的一个标志,和宽容H3K4马克与常染色质的形成(104年]。PCG蛋白质参与表达Oct4的规定,Sox2, Nanog [106年]。在修改后的组蛋白,有二价领域可作为抑制H3K27的存在或活化剂的H3K4 [One hundred.]。这些基因组区域通常与一个贫穷的转录因子的表达有关。
转录因子的活性和染色质的状态是紧密相关的。另一方面,不仅当地的染色质结构影响基因的转录因子的活动可以相互地触发染色质的修改。例如,Oct4、Sox2 Nanog共同调节的表达基因编码组蛋白修饰符是等MYS3, (66年]。此外,他们还直接或间接地与组蛋白去乙酰酶抑制剂等histone-modifying酶卑微的人和PCG因此激活基因表达(69年]。
异染色质和常染色质是非常动态的平衡。一般来说,在多能细胞,平衡是转向常染色质(107年]。多能干细胞是一种独特的高阶基因组结构由多能性因素(108年]。
如将进一步显示,小分子可以诱导重组“模”,与释放的因素能够启动染色质的修改。
2.3.3。小分子
表观遗传重编程可能执行的帮助下小的化学药物。监测的技术提供了许多优点像一个选项重新编程的所有阶段,可逆性,低成本和相对较高的效率。小分子申请重组涉及到表观遗传修饰符,信号调节器、代谢监管机构、控制器的细胞凋亡,以及物质影响染色质的状态和组蛋白(图1)。
小化学药物包括各种低分子量化合物可能会影响重编程效率,突出的例子如丙戊酸(hdac抑制剂),azacytidine和RG108(两者都是DNA甲基化抑制剂)和forskolin(腺苷酸环化酶的活化剂)[109年,110年]。其他小分子可能间接影响多能的多能性影响表达式/活动等因素purmorphamine(嘘受体激动剂),CHIR99021 (GSK3β抑制剂)和a - 83 - 01 (TGF -β抑制剂)[111年,112年]。值得注意的是,GSK3β和TGF -β通路抑制剂被证明是成功地用于诱导npc (113年- - - - - -115年]。
有趣的是,一些研究表明潜在的小分子代替OSKM因素在nsc重组,虽然大多数研究者倾向于把转录因子与小分子增加获得神经从体细胞克隆的效率114年]。另外,小分子的作用后生监管机构,调节DNA甲基化和染色质修饰的过程应该强调。例如,春节的化学模拟酶是孤立的,如DNA甲基转移酶抑制剂5阿扎胞苷和RG108114年]。小分子中,有几种物质作为抑制剂组蛋白去乙酰酶抑制剂:suberoylanilide异羟肟酸(萨哈)trichostatin (TSA),丙戊酸(VPA) [114年]。BIX01294是一种抑制剂G9a的组蛋白甲基转移酶甲基化组蛋白H3的位置的赖氨酸9 (H3K9) [115年)(图1)。
3所示。方法交付多能因素进入细胞
3.1。基因改造
交付干细胞重组因子可能刺激重新编程的性能。在第一个实验中产生的万能,Oct3/4的鸡尾酒,Sox2, Klf4,原癌基因,(通常称为“OSKM”)因素被送到小鼠成纤维细胞的转染Moloney小鼠白血病病毒(MMLV) [4]。随后,逆转录病毒转导是有效地用于小鼠和人成纤维细胞重新编程,神经干细胞,角质细胞,脂肪细胞和其他细胞。重组的效率,这种方法已经相对较低,但高于当使用质粒向量(116年]。此外,逆转录病毒转导等:细胞是完全无效的神经元。慢病毒载体显示出更多的力量传递遗传结构慢慢分裂细胞,如神经细胞(117年]。viral-associated交付的主要劣势因素细胞基因组的基因组不稳定性的出现,突变,导致的细胞的恶性转化的概率大病毒结构的整合到基因组包括protumorigenic交付转录因子的性质。
逃离这个陷阱,integration-defective逆转录病毒,可能更少的有害的了。兴奋的极大的兴趣,但效率极低的技术没有提供一个很好的希望建设临床有效的万能(118年]。
交替病毒转导,OSKM因素的方法多顺反子的磁带交付PiggyBac (PB),这样的转座子转座因子,也是探索119年]。PB转座酶识别序列的末端逆重复(也是)13个基点左右两端的转座子和整合这些序列TTAA网站。这种技术的效率与逆转录病毒的方法。然而,它是不可能完全去除手术后转座子,因为多个副本的117年]。等转座子被用于重组睡美人(某人),其效率高于铅,但其后续去除从细胞也会引起巨大的困难,这也可以是危险的不稳定基因组(120年]。
另一种方法是使用复制的不称职的运载体表达OSKM因素(121年]。尽管这些向量不整合到细胞的基因组,表达式可以持续好几天了。虽然这样的向量是明显高于安全的逆转录病毒载体,其转导效率低得多(121年]。病毒的向量,miniring DNA包含实现了基因的转录因子(122年]。虽然这种方法也不涉及整合到基因组中,其有效性明显低于逆转录病毒技术(123年]。
除了整合和nonintegrating向量,使用单链RNA的方法由仙台病毒转导(SV)开发(124年]。SV不致病的人类,因为它并没有集成到基因组和很容易被负面的抗体。此外,这种方法的效率与慢病毒转导。然而,这种方法也有其自身的限制由于病毒复制是很容易转移的本质因素。向量作为替代,一些研究人员使用在体外电穿孔,但其效率相当低(95年]。
3.2。信使rna和重组蛋白的使用
使用信使rna的想法代替直接遗传效应细胞“重编程”的过程是有前途的,有两个原因:它是安全的,因为细胞则是由信使rna(以及直接重新编程细胞),它显示了减少免疫原性的细胞。尽管的安全方法和它的效率高,它仍然是非常昂贵和耗时的125年]。
细胞重新编程,纯化OSKM转录因子可以送到细胞在一个复杂的反式激活因子转录-(乙)蛋白质或其他cell-penetrating肽(126年]。这似乎是最有效的解决方案,重组没有任何基因插入(包括瞬时转染质粒DNA)。在这样一个时尚,一种文化的稳定则维持在35处获得了从成纤维细胞127年]。细胞蛋白质交付的效率可以提升的实现壳聚糖纳米粒子(128年]这就增加了内部化的复杂细胞核膜和转让。尽管这种方法的明显的吸引力,应该注意的是,重组蛋白的帮助下重编程效率非常低,和功能活性重组蛋白的生产劳动广泛而且很昂贵。
关于使用信使rna或重组蛋白直接重新编程,需要注意的是,只有一个技术描述110年),但是我们没有发现任何出版物证实这样一个重组的结果。
4所示。协议的神经干细胞重新编程
我们当前的协议特征等的重编程体细胞为神经包括获得万能的阶段和iPSC-deficient阶段直接重新编程。下面,我们就来展示一些例子OSKM和其他因素诱发摘要和相关的细胞类型(表1)。
4.1。协议由万能干细胞获得NSC
获得NSC分化细胞,如成纤维细胞或骨髓单核细胞,研究人员强调,需要开发则在中间阶段(表1)。显然,一些实验室利用古典OTKM协议使用病毒转导和几个转录因子诱导重编程体细胞(129年,155年,156年)或单独Oct4、Sox2 Nanog [155年]。一些组织使用额外的因素,如FGF-2,低浓度的大脑和视黄酸。这些协议提供一个机会来获得成熟的髓磷脂碱性蛋白(MBP)积极的少突胶质细胞和双极GFAP-positive星形胶质细胞(156年]。
治疗创伤性脑损伤(TBI),逆转录病毒双重盒式向量coexpressing古典“OKSM”队列结合eGFP管理附近的创伤性脑损伤的大脑病变重点(129年]。人类OKSM和eGFP的表达主要发生在小胶质细胞的细胞和NG2-positive寡树突胶质细胞(神经/胶质抗原2),在一个小得多的程度上,在GFAP-positive反应性星形胶质细胞。生成的池GFP-positive细胞可能被视为万能干细胞由于coexpression eGFP, Nanog,和stage-specific胚胎antigen-4 (SSEA4),进一步表达胚胎胚芽层包括所有三个胚层的标记(SOX2),中胚层(brachyury)和内胚层(Gata4),主要表达的。然后,标记的神经胶质的血统如巢蛋白和doublecortin(克莱斯勒),以及neuronal-specific标记NeuN MAP2,发现在相同的细胞,甚至神经电生理记录模式。这项技术可能会宣布革命要不是teratomаs的形成皮层的半球受损,这是可以预见的是实验的最后129年]。
其他组织主要使用模因素。例如,Yaqubi等人的团队分析了许多和主要模因素诱导小鼠成纤维细胞转换成神经细胞通过细胞则阶段(130年]。这个复杂的包括Ezh2, Jarid2 Mtf2, Nanog, Pou5f1, Sall4, Smarca4, Sox2 Suz12, Tcf3。
越来越多的证据报道称,重组的主要因素神经上皮的方向通过万能的或多或少明显阶段Oct4和Sox257,131年,138年,157年]。Coexpression细胞,这些因素的神经分化可以引发的变化在中neuro-basal,适当的补充。特别是,增加氮气介质成为可能获得从Oct4 Sox2积极iPSC神经元和神经胶质TUJ1阳性的数量,GFAP、GALC, MAP2, TH, synaptophysin [131年]。一些研究人员坚持Oct4和Sox2 [157年),其他人否认这种组合的基本重要性和仅适用于其中的一个因素,但最新协议不再包含万能的明显的阶段,将在下一节进行分析。
一般来说,大多数研究人员坚持“经典方案”的重组遵循协议的通用方案:在第一阶段,转录因子的OSKM(或所有四个或两个)用于创建万能,第二,获取NSC和神经祖细胞,文化转移到基本神经媒体结合其他因素,例如,FGF-2, EGF和‘诺金’,在许多协议,小的化学分子,例如VPA。在第三阶段,进行分化的神经和神经胶质方向使用neurobasic媒体和相关分子的帮助下,在这个阶段所属forskolin, BDNF, GDNF, IGF1, NT3等等110年]。
最近,越来越多的出版物出现,,除了遗传因素或代替,前面提到的小分子被用来获得万能。完全取代实验因素,选择下面的小分子由一个科学小组:SB431542(及)抑制剂,PD0325901 (MEK抑制剂),thiazovivin, VPA,抗坏血酸的抗氧化,DNMT (5-aza-20-deoxycytidine抑制剂)(132年]。他们还报告说,小分子能够抑制染色体畸变在iPSC阶段。另一个研究小组,目的是开发一种技术治疗脊柱创伤,获得iPSC-activating V2a中间神经元使用小分子(133年,134年]。是假设是这种类型的细胞,可以最有效地纳入受损的传入和传出神经电路,从而恢复受损的脊髓。
4.2。协议在NSC体细胞重编程的,不要使用万能
在出版物致力于体细胞的直接分化转化成神经上皮的,与协议的生产iPSC适当,随着古典转录因子,“模”重组混合物更常见(表1,图2)。直接重编程的主要区别是没有意义的iPSC阶段和NSC直接的获取,通过重组增殖细胞,例如,成纤维细胞或星形胶质细胞。因此,凯伦·l .环团队使用Sox2因素,才能够获得Sox2,巢蛋白- Pax6, Zbtb16,或Msi1-positive NSC从小鼠成纤维细胞和Sox2 Nestin-positive NSC MAP2-positive神经元,GFAP-positive星形胶质细胞和O4, OLIG2-positive寡树突胶质细胞从人类成纤维细胞(5]。,额外的因素被添加到手机中:EGF, FGF2,视黄酸,forskolin。与协议由万能干细胞获得NSC,没有致癌潜能获得的神经上皮细胞中观察到。
(一)
(b)
另一组,使用直接重新编程,获得人体运动神经元从人类成纤维细胞,使用组合因素Ascl1 Brn2, Myt1l, Lhx3, Hb9, Isl1, Ngn2, NEUROD1 [135年]。因此,诱导运动神经元表达β3-tubulins (Tubb2a和Tubb2b)、Map2 synapsins (Syn1和Syn2), synaptophysin (Syp)和synaptotagmins (Syt1, Syt4、Syt13 Syt16),休息等正常的运动神经元的电生理特征的潜力−49.5 mV (SEM 5.6, ),存在活跃Na-K渠道被河豚毒素,并且能够生成一个神经元动作电位特征。与前面的情况下,额外的因素添加到介质,如氮气、B27, GDNF, BDNF,据,被用在这个实验。
荷兰外商投资局对Caiazzo等人只用三个转录因子,NFIB, Sox9,成纤维细胞转化为功能性星形胶质细胞(136年]。结果,他们收到了一个稳定的人口功能星形胶质细胞阳性S100B, GLT1 ALDOC, CD44。为首的一群科学家卡萨迪等人进行了肝细胞和淋巴细胞直接重编程NSC的因素Brn2的鸡尾酒,Hes1, Hes3, Klf4, Myc, Notch1,镍镉,PLAGL1, Rfx4 [137年]。培养在培养基含有胰岛素,转铁蛋白,尸体,和纤连蛋白(ITSFn), nsc巢蛋白阳性,和随后的额外的EGF、FGF因子替代BDNF, NT3,和抗坏血酸分化成TUJ1 MAP2阳性神经元,GFAP-positive星形胶质细胞,O1和O4阳性少突胶质细胞。此外,细胞培养时,盘子涂上polyornithine和层粘连蛋白被使用,也,从作者的角度看,导致了神经源性细胞的再分化。
作为在iPSC协议上面所提到的,一些研究人员认为没有必要使用过于大量的关键因素,它可能是足够的专注于一个或两个最有效的。例如,一些研究人员考虑的一个因素,Oct4 [138年,158年),满足重编程。应该注意,cd34多脐带血造血细胞被选择作为重组原始细胞培养,在自己拥有更大的可塑性比成纤维细胞和肝细胞和干细胞水平能力。在几乎所有其他协议,额外的因素包括在神经干细胞媒体EGF, bFGF以及声波刺猬(嘘),AA血小板因子,甲状腺激素T3 FGF-8, GDNF在分化阶段。因此,巢蛋白和Musashi-1-positive神经胶质祖细胞,标记阳性的神经元分化的细胞亚(酪氨酸羟化酶(TH),β三世微管蛋白(Tuj1),和神经胶质)(GFAP +, 2 ,3环核苷酸3磷酸二酯酶+ (CNPase)),获得造血细胞。
另一组只用转录因子Oct4 [139年nsc]因为人类成纤维细胞的重组也增加了额外的细胞外环境因素:bFGF, IGF2, N2, B27, forskolin和抗坏血酸和涂有层粘连蛋白表面的文化板块。因此,有可能形成文化的CD133-positive祖细胞神经胶质(O4, GFAP-positive oligodendrogliocytes和星形胶质细胞,分别地。)β三世神经元微管蛋白和MAP2正拥有一个稳定的神经动作电位。
其他研究人员认为神经上皮的重组的主要角色Sox2因素(57,140年,141年,159年),在某些情况下,结合其他因素如Klf4和原癌基因,假设,然而,只有Sox2主要因素(142年]。同时,Sox2在proneogenic分化的情况下,使用因素Brn2或Brn4,导致神经祖细胞和成熟神经元阳性Sox2,巢蛋白,Msi1, CD133, N-CAM,克莱斯勒,Tuj1, MAP2 [143年- - - - - -145年]。同时使用Sox2和FoxG1 [145年),得到了神经祖细胞分化成Tuj1 MAP2阳性神经元和GFAP-positive星形胶质细胞。在这些实验中,其他因素的主要再分化成纤维细胞在NSC EGF、FGF成熟神经元的分化因素,如果这个问题被研究人员需要解决,N2, B27,视黄酸,GDNF,在某些情况下,板的表面是涂有L-ornithine /层粘连蛋白。
螺旋器等。146年]只用个人表达因素Oct4、Sox2,或Nanog在他们的工作,但是作为成功的重新编程的基础,被认为是大自然的原始细胞。因此,他们用CD44 +星形胶质细胞,重组NSC,没有万能的阶段,由于更大的遏制潜在的星形胶质细胞及其功能可塑性大。结果,生成的nsc Sox2阳性,PAX6, CD133,巢蛋白和随后被成功分化成成熟的神经元。相同功能的成人使用星形胶质细胞妞妞等人在他们的实验140年],考虑,然而,充分暴露在他们Sox2和VPA因素。获得的结果,他们人口的老鼠神经元阳性克莱斯勒和Sox2, VPA暴露后,神经元分化成更多的成熟和功能活跃,积极Sox2, calretinin, NeuN。
在另一项研究[141年),研究人员使用只有Sox2在成纤维细胞的重编程的主要因素为神经干细胞,主要的重点是放在实验进行的三维微环境。它已经表明,这样的三维微环境在琼脂糖凝胶的基础上创建的,当细胞增长,允许保留或增强干细胞的潜力。此外,研究人员使用辅助因子在细胞环境:EGF、FGF, B27;和分化:PDGF、bFGF forskolin和抗坏血酸。因此,nsc获得成功地分化成成熟的神经元,星形胶质细胞,少突胶质细胞,阳性Sox2, Olig2, Pax6, Tuj1, GFAP、NeuN,巢蛋白。一个平行研究二维单层培养显示较低的神经分化的结果。同时,在这个工作中,需要基础上更上一层的成纤维细胞再分化的胎牛血清的边后卫,没有他们未能诱导重编程。同时,绝大多数上面提到的研究人员认为,胎儿血清的存在并不导致神经上皮的分化转移。
一些研究已经发表在一个或两个模转录因子被认为是独家和足够的重组因子,例如,Ascl1 Nurr1,因素,可以重组小鼠成纤维细胞为神经祖细胞巢蛋白阳性,Sox1, Msi1,积极Tuj1 MAP2神经元,积极和多巴胺能神经元染色TH和Tuj1 EGF的附加因素,FGF, N2, B27,其,嘘147年]或致癌基因SYT-SSX2(致癌基因的滑膜肉瘤(SS)) (160年]。
佩雷拉等人使用了三个类似模因素,Ascl1, Lmx1a,和Nurr1 (ALN),喜欢的《忍者外传2》神经胶细胞重新编程为各种类型的神经元在活的有机体内和在体外(148年]。由此产生的神经元表现出的性质fast-spiking (FS)和小清蛋白(PV) +中间神经元(IntNs)。值得注意的是,作者提到,不同类型的神经元可能获得的结果在活的有机体内和在体外重新编程。特别是,由在活的有机体内重新编程,没有检测的TH阳性细胞出现在体外是指出。这种差异可能是由于地区影响力和异质性对神经胶质细胞的表观遗传因素在活的有机体内。表达式的非均质性的各种因素,在神经管形成的过程,以及梯度对各种因素的存在,决定了个体发育神经元分化的特性(审查,看到Masserdotti等的工作。161年])。因此,原点,解剖位置和表观遗传重编程细胞可能会强烈影响其控制倾向分化和分化转移到某些亚型的神经元。相同的审查详细描述了Ascl1转录的作用因素,Neurog1 (Ngn1) Neurog2 (Ngn2) Pax6,和其他人,都在控制胚胎发育的大脑和重组的潜在用途。同时,Ascl1、Pax6 Neurog2指出作为主要的转录因子的基础上更上一层分化转移,下行触发其他因素。
正如已经指出的那样,最近越来越多的研究出现在小分子化学作为重组的主要因素。例如,在郑等人的研究。149年),小分子的结合- 83 - 01(及)抑制剂,thiazovivin(岩石抑制剂),purmorphamine(嘘受体激动剂)和丙戊酸(VPA:抑制剂组蛋白脱乙酰酶(HDAC))被选中,导致生产NSC Sox2阳性,Pax6, PLZF, Dach1, Fam70a, Nr2f1,和Zic1小鼠成纤维细胞,然后分化成功能性神经元,星形胶质细胞,少突胶质细胞和阳性Tuj1, GFAP和Olig2分别。
在另一个工作,结合六分子用于生产glutamatergic和gaba ergic神经元从人类成纤维细胞:VPA, CHIR99021 (GSK-3激酶抑制剂),Repsox (TGF -抑制剂β通路),SP600125物抑制剂),GO6983 (PKC抑制剂)和y - 27632(岩石抑制剂)150年]。另一组成功的活动增加内源性Sox2诱导代NSC使用只有三个化学分子的结合:VPA, CHIR99021, Repsox [113年]。他们也显示出类似的其他两个组合的功效:NAB的结合,氯化锂,SB431542 TSA的结合,Li2CO3, tranilast。全功能glutamatergic神经元被顺序从星形胶质细胞暴露于九化学药剂:LDN193189, SB431542, TTNPB, thiazovivin, CHIR99021, VPA,榫眼,凹陷,purmorphamine [151年]。
在其他的研究中,使用小分子在细胞分化成所需的族群的阶段,也就是说,生产CHX10 + V2a中间神经元治疗脊柱创伤,麦克德维特T.C.组purmorphamine使用,RA和榫眼[133年]。在所有情况下,由此产生的细胞或多或少的表型分化的神经细胞,这取决于特定的实验任务。值得注意的是,在这样的协议使用额外的因素,包括上面提到的(EGF、FGF BDNF等等)。这表明他们非常重要的重编程过程的稳定,而不是满足自诱导的细胞再分化。一般来说,与其他重组因子,所以应该尽量减少小分子的数量在最后的组合,为了最大限度地降低风险的负面影响细胞重新编程。要做到这一点,研究发现最有效的和普遍的化学因素。
4.3。直接重组协议的一般模式
总结非常多样的协议直接与获取神经上皮的细胞重新编程,可以区分(图三个主要阶段1)。在第一个“准备”阶段,主要作用因素很小的化学分子,增加“可塑性”/破坏转化细胞的基因组,例如,移除de-acetylation的组蛋白(VPA)和DNA甲基化(RG108),抑制TGF -β通路(- 83 - 01),防止MMSC的中胚层的分化和重组细胞的细胞骨架(thiazovivin)。在第二个主要阶段,怎么可能NSC的结果,要么是转录因子确定基础上更上一层楼再分化(例如,Ascl1 Brn2, Ngn2)或小分子取代这些重组因子使用。例如,GSK3 CHIR99021抑制β然后激活Wnt信号通路;甲醇BIX 01294 G9a抑制组蛋白甲基转移酶H3K9的可能激活Oct4因素,PDO 325901块MEK信号通路防止分化。在这两种情况下,其他因素EGF、FGF,等等也使用在主要阶段。在第三个和最后一个阶段,分化成所需的细胞类型,例如,在神经元使用小分子化学(purmorphamine(嘘受体激动剂),视黄酸,和forskolin (AMP激活),和其他因素的神经分化,也就是说,BDNF和GDNF。
5。重编程方法的优点和缺点
5.1。万能干细胞技术
第一个障碍临床使用则是缺乏有效和完整的不成熟的万能干细胞分化成熟的体细胞。多能的潜在致瘤性因素和优惠使用逆转录病毒和慢病毒转导可能导致插入突变的发展,激活的基因表达,基因组不稳定性和染色体畸变162年]。此外,尽管自体则被认为是nonimmunogenic,移植后能诱导免疫反应的诱导遗传和表观遗传不稳定(163年]。
尽管最初的吸引力,临床使用则可以大概代表了风险。交货方法以及多功能的本质因素和建设的每个阶段应严格控制多能性的细胞逃避扭曲的恶性转化。
5.2。直接重新编程
直接重编程的优点是显而易见的:首先,这种技术比万能更快、更便宜,而且,可以说,从经济可行性的角度来看,为获得自体神经干细胞提供了现实的可能性,至少在iPSC的银行单完全形成。其次,这种技术似乎比万能更安全,因为即使通过跳过整合阶段病毒基因组的DNA重组细胞,活化致癌多能性因素可能导致肿瘤的形成。
直接重编程的缺点,降低了可预见性可能提到;因为,在这种情况下,可以同时获得细胞分化的不同阶段,也就是说,NSC,氮磷钾,晚期神经和神经胶质祖细胞终末分化细胞。同一特定功能的直接重组协议表明,他们的再现性和敏感性实验的条件是明显不如iPSC的协议。
6。结论
干细胞的独特性及其潜在的用于科学和治疗应用是基于他们的自我更新和多潜能的能力。多能性的状态,形成自然和有效控制在ESC,由于信号通路以及转录和其他表观遗传因素。它已经明显,所有这些因素形成一个复杂的自动调节的多层次系统。确实,获得和维持多能性是根本不同的可能性在ESC和成年体细胞。与ESC prooncogenic多能性因子的激活框架的体细胞重编程的发展几乎总是导致畸胎瘤的分子信号通路的控制不足。因此,严重缺乏重组因子和细胞方法的交付到迫使研究人员寻找方法来优化重组协议和减少攻击性的影响。问题的不稳定状态,则启动替代技术的发展直接重编程体细胞,绕过控制不佳的危险阶段激活prooncogens OSKM。另一个原因直接重编程的需要开发一个成功的策略是经济效益。由于其高scost,则非常昂贵的治疗,尤其是个性化医疗的框架内。另外一个策略直接重编程允许更少的努力获得多功能,祖,和分化细胞来解决特定的临床和科学问题与致瘤性的风险要低得多,因为他们减少遗传不稳定。 However, the problem of the lack of molecular control of differentiation in direct reprogramming has not yet been solved, and, therefore, there are no generally accepted effective and reproducible methods for direct reprogramming of somatic cells in the NSC.
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
俄罗斯科学基金会支持的工作是财务,批准号16-15-10432。作者感谢斯维特拉娜博士Kotova的手稿准备提供帮助。作者也感激他的亚历克斯·彼托夫图设计非常宝贵的帮助。