文摘
发展研究和3 d在体外模型系统表明,细胞外基质(ECM)的生产和参与往往先于干细胞分化。然而,不清楚是ECM触发信号事件序列,以适应多步过程分化的特征。在这里,我们使用的特异性转录组分析和先进的成像技术来描绘ECM接触特定的分化途径,确定特异性在这种情况下是否长期ECM重塑的一个函数。为此,人类间充质干细胞(hMSCs)培养的3 d打印的棱镜从ECM蛋白质和创建相关的控制。我们发现外生ECM提供的三维微环境在早期的时间点在之后的时间点影响微环境的构成,每个发展的三维微环境独特准备促进干细胞分化。此外,2 d文化经历最少的ECM重塑和缺乏刺激途径与发展有关。
1。介绍
虽然可溶性因素支持干细胞分化的研究,我们了解蛋白质细胞外基质(ECM)的调节分化是不完整的。知道ECM的机械贡献干细胞状态的动态变化是相关的在体外药物筛选平台,毒性测试,和疾病建模和是至关重要的在活的有机体内治疗策略涉及组织和器官再生,ECM接触是不可避免的。越来越多的文献支持干细胞特定ECM的联系接触类型和特定分化的结果。例如,格鲁等人发现hMSCs生长在二维的I型胶原蛋白和fibronectin-coated表面分化向成骨的血统(1]。此外,陆等人的工作显示,非细胞生成的ECM msc或软骨细胞能诱导chondrogenic分化(2]。类似的研究已经扩展到3 d环境(3,4荣格等人表现出互补),但增强,分化效果的3 d ECM暴露相对于2 d ECM (5,6]。同样,Becerra-Bayona等人研究了小鼠间充质干细胞(mMSC)行为聚(乙二醇)(挂钩)水凝胶共轭与纤连蛋白、层粘连蛋白和纤维蛋白原指出,增加成骨分化盯住水凝胶包含后者两种蛋白质(7]。更进一步,我们实验室已经表明,ECM配方可以优化通过使用一个“设计实验”统计方法促进分化的特定细胞类型(8]。
ECM在干细胞分化的影响在体外或许并不令人意外,因为在活的有机体内发展研究早就证明了ECM的生产和参与往往先于分化事件。例如,纤连蛋白已被证明的中胚层,神经,血管发展(9,10]。同样的,质量和克隆老鼠头和鹌鹑躯干神经嵴的文化分析和发现纤连蛋白促进分化的平滑肌细胞11]。效果非常特定的分化相关的神经胶细胞,观察神经元,黑色素细胞。此外,效果与大量细胞死亡或平滑肌细胞的增殖11]。但令人惊讶的是,大多数分化“程序”(无论是多能或多功能细胞)需要多个信号序列达到完全成熟(12- - - - - -14]。这是否意味着ECM提供了一个第一,中间,或结束的信号,需要额外的可溶性因子或信息信号完成序列?或者,可以ECM重塑或“进化”为分化提供必要的刺激序列?后者场景需要干细胞或支持间质细胞类型研究所重构。这是重要的ECM重塑和随后的变化在细胞活动中已被证明是重要的过程,如血管和骨骼发展,伤口愈合和癌症发展和进展(15,16)以及细胞分化。
确定ECM的演变与分化,我们设计了一个在体外三维模型在multiphoton-excited (MPE)光化学被用来打印3 d矩形棱镜组成的完整的I型胶原蛋白(Col1),纤连蛋白(FN),或层粘连蛋白- 111 (LN)蛋白质和包含人类间充质干细胞。制造的棱镜时没有添加人工合成聚合物,额外的胶原蛋白I型,或其他生物活性材料通常添加到支持FN、LN不形成自发的水凝胶体外。制造方法类似于多光子激光扫描显微镜(MPLSM)激发,因此,光化学仅限于震源体积(17]。我们证明了迈普制造技术可以交联可溶和结构蛋白,一层一层地,成3 d的蛋白质矩阵和光纤模式> 85%的空间富达(18]。我们有很多脚手架的材料属性特征以及研究干细胞cell-ECM相互作用[19]。我们有进一步表明,细胞粘附、迁移和表达焦点粘连在多光子激发——(MPE)交联ECM支架。在这里,我们使用这个3 d模型系统研究机械的基础将ECM接触和重构与干细胞分化。(一个早期版本的这项工作提出了一个抽象的生物医学工程学会年会,2017)。
2。材料和方法
2.1。制造仪器和光化学
多光子制造仪器已经详细描述之前,只是这里描述短暂(18]。ti:蓝宝石飞秒激光耦合到一个正直的显微镜站(Thornewood Axioskop 2,蔡司,纽约),执行和扫描通过结合激光扫描检流计(剑桥技术、贝德福德MA)和机动阶段(x y z, Ludl电子产品有限公司,霍桑,纽约)虚拟仪器控制和现场可编程门阵列(FPGA)的董事会(Virtex-II pci - 7831 r,民族乐器,奥斯汀,TX)作为数据采集功能元素(数据收集)18]。加工参数如功率、扫描,扫描检流计,和重复扫描模式(#扫描/层)内设置图形用户界面(GUI)。
制造系统的FPGA成立利用并行性的命令执行(80 MHz时钟频率),避免瓶颈之间的通信通过中央处理单元(CPU)和硬件的四个先入先出(FIFO)通道。前两个FIFO渠道传递信息的主要虚拟仪器程序FPGA控制检流计的镜子和快速电光调制器(加工)快门,而另两个记录信息的光电倍增管(PMT)来创建一个活的形象制造使附近的CPU和硬件之间的通信。仪器控制软件的源代码是免费的:http://campagnola.molbio.wisc.edu/。
玫瑰红的双光子激发photoactivator诱导了飞秒钛蓝宝石激光器(米拉,连贯,圣克拉拉,CA)操作在780海里。光化学流经一代的单线态氧然后攻击残留包含芳香组和自由胺(20.]。由此产生的激进的蛋白质又链接到第二个蛋白质分子,生成共价键。0.75 20 x,数值孔径物镜是使用。
2.2。结构制造
三维支架被捏造的解决方案包含纯BSA (Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼),BSA和小鼠层粘连蛋白- 111 (LN) (Engelbreth-Holm-Swarm小鼠肉瘤隔绝,EMD微孔,达姆施塔特,德国),BSA和纤连蛋白(FN)(牛血浆隔绝,σ),或BSA和胶原蛋白I型(Col1)(孤立通过醋酸消化从老鼠尾巴,σ),BSA是50毫克/毫升的浓度添加了ECM支架和支架,ECM浓度为0.5毫克/毫升为每个单独的ECM蛋白质。BSA是单独使用作为ECM的负控制曝光和包含ECM蛋白质样品,提供增强的结构稳定性(19]。支架尺寸设定在350×350×100μ米,以确保完整的封装msc和保持结构的完整性。
支架和一个非特异性BSA自组装单层萨姆(SAM)与另一个有机硅烷在载玻片。幻灯片被(我)等离子体清洗准备,沉浸在octadecyltrichlorosilane(定单计划)(Morrisville凝胶Inc ., PA), (ii)与无水甲苯洗涤,除去任何残留ODTS,(3)与N干燥2,(iv)加热30分钟在120°C完成Si的形成−自组装有机硅烷的债券单层。使硅烷化的幻灯片被浸泡在一个10毫克/毫升溶液BSA形成背景自组装单层然后冲洗。
蛋白质溶液和玫瑰红photoactivator(2毫米)是局限在一个小圆形橡胶室(Grace Bio-Labs sa8r - 0.5)坐在BSA单层。加工参数如结构大小、激光功率大小轴步骤和扫描速度没有photodamage被优化以达到最大程度的交联。制造后,支架被暴露于高激光功率photobleach剩余玫瑰红,确保细胞生存能力与长时间的成像。幻灯片当时沉浸在1 x PBS pH值7.4 (GIBCO)含有400μ青霉素g / mL和400年μg / mL链霉素对细胞镀在无菌条件下,保持水分。
2.3。荧光寿命成像显微镜
荧光寿命成像显微镜(这部电影)被用于图像msc在各自的3 d结构对比的DAPI染色细胞核和残余裹入玫瑰红。这部电影图像是定制的,多光子显微镜位于光学实验室和计算仪器(位点)使用time-correlated单光子计数(TCSPC;贝克尔和Hickl SPC830,柏林,德国)。图像是用一个40 ~ 1.15 NA水浸目标,其中每个光学部分有一个领域512 ~ 512像素和64箱每像素和所需的60年代的收购。z堆栈是100年由光学部分1μm轴步长。使用的所有电影的测量双光子激发在890 nm,和DAPI排放收集520/35 nm过滤器(色技术,为Rockingham市增加,VT),而玫瑰红荧光收集620/35 nm过滤器(浓度技术)。这部电影图片是安装使用hardware-bundled分析软件(SPCImage Becker-Hickl)单指数衰减模型。分析了图像颜色映射根据荧光寿命,使用伊万里瓷器软件出口,3 d重建(Bitplane、苏黎世、瑞士)。
2.4。BSA的物理特性,BSA / FN, BSA / Col1和BSA / LN支架
2.4.1。体积膨胀率测定
描述的相对交联结构,体积膨胀率的测量,这是定义为脱水的水化体积的比率(19]。前者是由获得两个photon-excited荧光(TPEF)图像(890 nm激励)在生理介质结构的1μm轴步大小0.8 NA物镜,对比从剩余的玫瑰红。结构被浸泡在100%的乙醇中,然后脱水干完全和成像在相同条件下的水化。和高度的地区(和产生的卷)测定使用免费的斐济图像分析软件(http://fiji.sc/wiki/index.php/Fiji)。
2.5。分形维数测定
扫描电子显微镜(SEM)是用来确定结构装配在更高的分辨率比光学显微镜,我们专门确定分形维数,而不是孔隙大小及其分布。扫描之前,结构固定过夜(4°C)使用0.1米磷酸缓冲包含1.5%的戊二醛和1%的丹宁酸,然后使用一系列的乙醇洗涤和脱水临界点干燥步骤(Samdri 780临界点干燥,Tousimis,研究公司,罗克维尔市,马里兰州)。最后,金/钯(60:40)沉积到结构,厚度为30 nm,使用直流溅射涂布机(汽车Conductavac IV, Seevac Inc .,匹兹堡,PA)。SEM图像获得使用日立s - 570显微镜(日立,东京,日本)。意思是分形维数计算使用斐济FracLac插件。
2.6。细胞培养
胚胎干细胞间充质干细胞(21,22)是培养α谷酰胺MEM, 10%胎牛血清,1%,1%不重要的氨基酸,1%青霉素和链霉素。hMSCs镀在10000细胞/毫米2日常媒体改变了28天。hMSCs用于支架修改分析被播种的浓度5000细胞/厘米2和培养14天。hMSCs用于MMP的整合素和ECM分析被播种在10000个细胞/厘米2并为28天的培养。
2.7。BSA的跟踪,BSA / FN, BSA / FN, BSA / LN物理结构的修改
跟踪结构的物理改性,相衬结构的图像被每天14天。图像得到一个Axiovert 40摄氏度显微镜(蔡司)使用10倍目标0.25 NA。使用免费的斐济结构尺寸测量软件(http://fiji.sc/wiki/index.php/Fiji补充表1)。
2.8。使用RNA序列基因表达分析
hMSCs专门结构内切除和RNA提取根据RNeasy迷你包(试剂盒,日耳曼敦,MD)。互补脱氧核糖核酸是使用智能生成超低RNA工具包(Clontech山景,CA)。mRNA图书馆是根据Illumina公司Nextera XT准备装备的生产协议(Illumina公司,圣地亚哥,CA)。核糖核酸测序使用Illumina公司MiSeq sequencher与配对读取结束,75个基点的长度,深度2000万。执行这项工作,除了RNA提取,明尼苏达大学基因组学中心。
基因表达进行了分析使用星系软件(明尼苏达州超级计算研究所(MSI)、明尼苏达大学,MN),和所有在GEO数据库上生成的数据可以发现,加入GSE102737数量,OGLE30评论家标记。RNA序列读取人类基因组(hg19对齐。fa和hg19_genes_2012 - 03 - 09. gtf)使用大礼帽软件(版本2.0.09,开源软件,http://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml)。大礼帽结果进一步分析使用袖扣(2.2.1版本,开源软件,http://cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/)软件组装基因转录和估计基因丰度。阅读数量规范化获得FPKM(每千碱基片段记录每百万映射读取,补充表1)。差异基因表达决心使用单细胞微分表达式(SCDE)工具集23,24]。基因与值小于0.05被认为是“差异表达。“Gene-annotation浓缩分析与数据库进行注释,可视化和综合发现的6.7(大卫)信息资源国家过敏症和传染病研究所(NIAID)和美国国家卫生研究院(NIH)(补充表3和4)。
2.9。定量聚合酶链反应
的互补脱氧核糖核酸测序验证从互补脱氧核糖核酸RNA序列用于放大。引物为COL1 SGPL1, MAGED2购买试剂盒,和GAPDH(转发:TTAAAAGCAGCCCTGGTGAC相反:CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC)作为内部控制。定量聚合酶链反应(PCR)进行使用SYBR绿色主人试剂(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)和运行在一个应用生物系统公司StepOne +机器。使用ΔΔ基因褶皱改变决心Ct每个基因方法规范化GAPDH和3 d / FN规范化BSA的结构。
2.10。统计分析
体积膨胀率,意味着分形维数和ECM的变化,分析了整合素,MMP的表达使用方差分析有统计学意义图基事后分析用JMP软件(SAS,卡里,NC)。层次聚类和主成分分析进行了使用R软件。
3所示。结果
3.1。物理特性的3 d ECM-Based打印的棱镜
跟踪3 d ECM暴露之间的相互作用和hMSC分化,我们选择为我们的3 d ECM蛋白质在体外中发现的ECM模型代表的主要类基质环境,即纤维胶原蛋白,基底膜和小适配器蛋白质。因此,3 d打印的棱镜从ECM的蛋白质胶原蛋白I型(Col1)、层粘连蛋白- 111 (LN),或纤连蛋白(FN)与牛血清白蛋白(BSA)补充,提高交联效率和随后与hMSCs播种。3 d生物打印是通过多光子激励制造完成,利用这里hMSCs可能接触到ECM蛋白质3 d,甚至ECM蛋白质不自发形成水凝胶在体外(数字1(一)和1 (b))。打印的棱镜包含不同ECM蛋白质是身体特征的孔隙大小和相对交联密度。我们发现ECM类型略受影响的地形结构的分形维数,但相关的交联密度之间保持一致的结构(数据1 (c)和1 (d))。出于这个原因,改变分化的结果后文化3 d打印的棱镜将在很大程度上反映了生化差异的棱镜,而且地形上的细微之处。3 d打印的棱镜hMSCs被播种,播种后不久,hMSCs渗透棱镜的棱镜和维护生存数周(19)(图1 (e))。
(一)
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(d)
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3.2。转录的3 d hMSCs ECM-Based打印的棱镜
鉴于hMSCs的无数分化的结果,我们决定采用RNAseq hMSCs转录的结果,以确保全球评估的ECM暴露在我们的3 d在体外模型。因此,文化后28天,RNAseq hMSCs上进行3 d打印的棱镜(称为3 d / Col1, 3 d / LN,和3 d / FN)以及控制包括前hMSCs矩阵播种(2 d / D0), hMSCs培养为28天组织培养聚苯乙烯(2 d / D28),和hMSCs浸润3 d印刷棱镜组成的牛血清白蛋白(3 d / BSA) 28天。3 d / BSA是用来控制BSA添加打印的棱镜的结构稳定性和ECM区分结果与BSA以来参与受体整合素家族的不整合蛋白结合。整体基因表达谱进行了分析通过分层聚类和主成分分析(PCA)来确定实验团体之间的相似/不同的程度根据每个样本总体mRNA表达谱。层次聚类组样本是基于mRNA表达谱在各种尺度通过创建一个集群树或dendogram样品在某种程度上也加入了集群的集群在第二级别,允许一个确定集群的规模或协会细胞暴露于不同的ECM在3 d。PCA使用一组正交变换将每个样本的mRNA表达数据可能关联为一组线性无关的变量叫做主成分。这样定义的转换,第一主成分代表尽可能最大方差和第二主成分的方差最高可能的约束下,是正交的主成分1。由此产生的向量是一组不相关的正交基,当绘制x- - - - - -y网格,可以揭示无偏mRNA表达水平之间的关联的两个或多个样本(在本例中,3 d细胞暴露于不同的ECM支架)基于距离的阴谋。层次聚类和主成分分析分析包括所有基因的每个样本FPKM值大于1。分析表明,初始hMSC人口(2 d / D0, 数量由三个独立的实验,但同样的通道)和hMSCs 28天后在标准2 d文化(2 d / D28, 相同的数量由三个独立的实验,但通道)集群相互远离(数字2(一个)和2 (c))建议延长持续时间在文化没有使改变了转录组,这与先前的报道是一致的(25]。在3 d打印的棱镜hMSCs培养( 棱镜每个ECM类型从三个独立的实验,但同一集群通道)远离那些在2 d 28天,建议从2 d到3 d的转变对转录组hMSC文化也有很大影响。集群3 d棱镜之间的差异不同的ECM成分更微妙、更容易想象相比,独立于2 d控制。以这种方式,我们观察到一个分离的3 d / BSA和3 d / LN或3 d / FN表明FN、LN的出现大大改变了基因表达的hMSCs 28天后的3 d文化(数字2 (d)- - - - - -2 (f))。然而,PCA分析显示,3 d / Col1结构不因组织而异,建议提供外生,全身的胶原蛋白类型我没有增加或改变hMSC转录表达相对于3 d白蛋白基地。RNA序列数据验证了使用定量PCR,事实上,这一趋势在FPKM COL1A1水平(α1的I型胶原链),SGPL1 (sphingosine-1-phosphate裂合酶1),和MAGED2(法师家人D2)基因与定量PCR结果(图2 (b))。因此,基因表达谱之间的hMSCs 2 d标准文化和3 d结构变化明显,重要但更微妙的差异之间的新兴三维结构是由不同的ECM蛋白质类型。
(一)
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3.3。蛋白质降解、分化和发展途径改变与特定ECM蛋白质
基因本体论(去)分析差异表达基因识别由3 d通路显著改变文化和多种外源性ECM的3 d棱镜。3 d文化最显著改变的两个途径是(1)蛋白质降解和(2)发展和分化(补充表2)。这些过程甚至超过了扩散、迁移和细胞骨架激活,表明环境生成的在这个时间点(28天)有利于规范矩阵重构和细胞。因此,我们开始探索细胞施加的作用改造3 d打印的环境。
3.4。量化矩阵重构的
为了了解hMSCs改造他们的外部环境,我们最初研究物理修改细胞对3 d打印的棱镜。hMSCs介绍了3 d / BSA, 3 d / FN, 3 d / Col1和3 d / LN棱镜和培养了两个星期。物理修改棱镜跟踪通过检查结构实验的持续时间的变化。代表相衬显微镜图像的四个不同的棱镜天1、7、14个图所示3(一个),定量演化图所示3 (b)和3 (c)。hMSCs与BSA棱镜迁移到和在整个结构没有大的修改结构在第一周。第二周的文化导致减少矩阵大小不同程度(损失10 - 80%)。BSA / FN棱镜的细胞迅速修改了结构,继续减少的规模在持续时间2周。细胞的BSA / Col1棱镜没有大大改变结构维度在第一周。然而,细胞迅速退化的棱镜在第二周导致完整的结构破坏。BSA / LN结构保留原功能在第一周但被hMSCs缩小在第二周。的最终尺寸结构相对于初始条件数据所示3 (b)和3 (c)。总的来说,hMSCs实际操作不同动态的结构,不同程度,从最高到最低订单的最终尺寸:3 d / Col1 < 3 d / FN < 3 d / BSA < 3 d / LN。
(一)
(b)
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3.5。动力学整合素、基质金属蛋白酶和细胞外基质表达在打印的棱镜
动力学和不同程度的修改棱镜hMSCs可能反映了初始状态,特别是家庭成员整合素的表达。整合蛋白的ECM粘附分子和收缩,每个家庭成员港口特定ECM特异性蛋白质。因此,我们研究了初始常见的表达水平α和β子单元hMSCs通过RNAseq数据(图3 (d))。我们发现,msc表达了整合素α和β子单元与纤连蛋白(α5,αV,β1)、层粘连蛋白(α3,α6,β1),和I型胶原蛋白α11日,β1)(26,27]。然而,这些发现了整合素亚单位在不同的水平,可以从最高到最低排名如下:根据ECM亲和力FN > LN >胶原蛋白I型(图3 (d))。这种程度的表达式补充等装修的动力学那些棱镜与高水平的整合蛋白绑定能力(3 d / FN)重组更快比低水平的整合蛋白的结合能力。这也可以解释的温和和零星的退化3 d / BSA棱镜,缺乏直接接口提供的强大的肌动蛋白细胞骨架整合素参与。
整合蛋白通常与Col1绑定(α1β1,α2β1)hMSCs所表达的并不好,可能考虑重构动力学滞后。然而,3 d / Col1结构完全退化的2周。因此,我们研究了初始的表达基质金属蛋白酶(MMPs),酶降解特定ECM蛋白质依赖MMP的家庭成员。我们观察到最高的MMP1表达和MMP2,这都是胶原蛋白I型退化(图的能力3 (e))。因此,这些特定的初始表达基质金属蛋白酶可能允许msc缓慢而大幅降低3 d / Col1结构。值得注意的是,可以不显著降低FN (28)或LN (29日),虽然MMP2可以降低FN,但不是LN。其他四个基质金属蛋白酶表达的适度水平hMSCs天0 (MMP14, MMP16 MMP19, MMP24),只有MMP14能降解胶原蛋白I型,FN、LN (30.- - - - - -32]。综上所述,ECM棱镜被改造的速度反映了最初的整合素的表达,而退化的程度可能与更紧密地与MMP的表达。
棱镜完全退化以来似乎在第二周棱镜除了加速3 d / FN,我们检查了MSC与矩阵重构相关的基因的变化,包括内生ECM(表1),整合蛋白(表2)和基质金属蛋白酶(表3),在28日天关注这些基因棱镜类型之间的显著改变。有趣的是,我们注意到大多数整合蛋白的表达水平之间没有显著改变大多数3 d条件和相对于2 d控制(表2,图3 (d))。我们下了微分表达式之间的基质金属蛋白酶3 d打印的棱镜在28天(表3)。MMP16调节3 d / Col1打印的棱镜。MMP16是膜式金属蛋白酶裂开,从而激活MMP2,公认为分裂的胶原蛋白。此外,MMP13是调节3 d / Col1和降低I型胶原蛋白,虽然偏爱II型胶原蛋白。增强表达MMP13 MMP16,加上持续的MMP1表达和MMP2,支持3 d的迅速和完全退化/ Col1棱镜在星期2。不完全降解的3 d / FN和3 d / LN结构可能反映了低或缺乏这些ECM的基质金属蛋白酶的表达特定的蛋白质,即MMP7, MMP10, MMP11, MMP14,和MMP15 LN和MMP7 MMP10, MMP11, MMP12 MMP14, MMP15 FN。此外,细胞培养3 d / LN表现出高水平的的金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP) 3。
忽略的分析到目前为止新沉积的ECM蛋白质有可能也有助于重塑ECM棱镜的动力学。表1显示最戏剧性的变化在成绩单的纤连蛋白的表达,ECM棱镜之间syndecan4 versican, tenascin C类型。当然,转录表达并不一定表明沉积这快照肯定错过ECM可能沉积在中间时间点。然而,微分表达式之间的ECM棱镜进一步支持的前提下暴露在不同基质蛋白在早期的时间点结果特定的微环境支持不同的行为的进化。
3.6。在进化ECM环境发展和分化行为普遍
在细胞发育和分化途径也普遍的3 d棱镜,甚至超过增殖,迁移,生成和细胞骨架的激活,表明环境在这个时间点(28天)有利于细胞的规范。在最近的一次检测的发展和分化途径,我们注意到,更多的发展途径分化途径相比有显著影响。有趣的是,许多这样的发展途径不是通常与msc相关联,如肺癌和腺的发展。此外,发育或分化途径触发ECM特定在某些情况下(数字4(一)和4 (b))。特别是,骨骼发育与3 d / BSA和3 d / LN结构;肌肉发展和腺发展改变了3 d / LN结构;神经发育与3 d / Col1结构;肺发育和整体分化途径是与3 d / LN和3 d / Col1结构。脉管系统发展与所有ECM-based棱镜与3 d / FN结构彻底超过别人。有趣的是,3 d / FN只是与脉管系统发展,表明这个ECM的效用蛋白质三维组织工程的努力,寻求包括一个有功能的脉管系统。
(一)
(b)
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3.7。血管和血管发展3 d / FN结构
我们进一步探索血管发展的3 d / FN结构考虑到需要在组织工程领域为厚组织生成功能和集成的血管网络。特别是,我们检查关键的表达血管内皮和平滑肌细胞标记,这些细胞是重要的功能血管网络的发展。hMSCs培养3 d / FN表达结构28天内皮细胞(MCAM VCAM)和平滑肌细胞标记(ACTA2 TAGLN)表明外生,全身纤连蛋白的蛋白质在3 d可以触发hMSCs成这两种类型的细胞分化(数字4 (c)和4 (d))。我们还为spingosine-1-phosphate探测(S1P),鞘脂类,已被证明在脉管系统发展中发挥作用,由SGPL1[不可逆转地退化33- - - - - -35]。我们提到显著减少磷酸鞘氨醇裂合酶(SGPL1)在细胞培养3 d / FN专门(图结构4 (e))。因此,虽然功能成熟的血管细胞类型在3 d / FN还有待观察,这些分化途径的起始是强烈支持。
4所示。讨论
在这项工作中,我们检查了全身的全球影响转录I型胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白- 111单独hMSC 3 d文化的行为后28天。主要结果的变化反映在蛋白质降解,分化和发展途径。有趣的是,我们观察到无统计差异msc分化的脂肪形成的和chondrogenic血统;然而,交替发展路径包括肺癌、神经、血管、肌肉发展被激活,激活相关的原始成分3 d ECM-based微环境。ECM成分的微环境发生了显著变化在four-week-study持续支持的概念演变ECM提供所需时间线索分化到多个不同的血统。
最引人注目的分化结果血管分化与纤连蛋白有关。干细胞的分化成内皮细胞与纤连蛋白曾被证明(36]。特别是,巴蒂斯塔的研究等人研究了公司的差异化在LN和FN在胶原蛋白水凝胶和观察到纤连蛋白刺激EC和血管化而LN刺激cardiomyogenic差异化(37]。此外,像那些在克拉克等人的研究表明纤连蛋白和血管内皮细胞活性之间的密切联系38]。但是这是第一个研究表明骨髓间充质纤连蛋白暴露的主要反应是血管分化的一个最强有力的ECM-stimulated反应的上下文中,我们观察到我们的3 d模型系统。应该注意的是,我们的3 d模型系统包含一个交联机制,可以隐藏关键细胞绑定或可溶性因子封存地点,从而使比较本地组织或其他3 d模型系统,不包括外生这种类型的交联。即便如此,这些研究显示包含全身纤连蛋白在组织工程,特别是厚与血管组织的要求可能是有利的。
作为构建证据支持这一概念,细胞外基质是一种有效的信号分子,现在,是时候解决整合素后会发生什么之前接触和转录的蛋白质与成熟细胞类型有关。本研究的设计是不精心设计能够有效解决这个问题,因为我们只能访问开始和结束事件的动力学途径激活ECM-guided分化。未来的研究可能会受益于一个改变设计中信号动力学可以被捕获。有一些最近的出版物,开始调查这些动力学。例如,肽的激活α5β1可以推动成骨分化的间充质干细胞通过Wnt /β连环蛋白通过PI3K / Akt信号通路激活(39]。此外,订婚fibroblast-derived ECM的通过β1,α2,α3整合蛋白在人类胚胎干细胞已被证明激活Wnt /β连环蛋白通路通过mek erk通路,使内胚层分化(40]。最后,我们有初步证据表明,激活integrin-linked激酶(家族)的焦点粘连夫妇β通过GSK3连环蛋白激活β使心肌细胞分化。失踪在这些研究中考虑的多步过程固有的任何分化的结果。因此,虽然提供外源性ECM可能提供一个强有力的信号1,“后续信号的来源尚不清楚,可能源于刺激内源性ECM的降解ECM的可溶性因子的合成,或固溶性因素。识别源信号的2、3、等ECM-guided分化和操作相关的细胞内信号通路如前所述ECM-based中会有用的在体外药物筛选平台,毒性测试,和疾病建模和意志是至关重要的干细胞治疗策略,ECM接触是不可避免的。
缩写
| ECM: | 细胞外基质 |
| hMSC: | 人类间充质干细胞 |
| 挂钩: | 聚乙二醇 |
| FN: | 纤连蛋白 |
| 杆菌: | I型胶原蛋白 |
| LN: | 层粘连蛋白- 111 |
| FPKM: | 每千碱基片段对每百万映射读取 |
| COL1A1: | α1的I型胶原链 |
| SGPL1: | Sphingosine-1-phosphate裂合酶1 |
| MAGED2: | 法师家人D2 |
| 走: | 基因本体论 |
| MMP的: | 基质金属蛋白酶 |
| VCAM: | 血管细胞粘附分子 |
| MCAM: | 黑色素瘤细胞粘附分子 |
| ACTA2: | 平滑肌主动脉alpha-actin |
| TAGLN: | Transgelin |
| 制: | 小鼠胚胎干细胞 |
| MEK: | 增殖蛋白激酶激酶 |
| 兵: | 细胞外signal-regulated激酶 |
| FPGA: | 现场可编程门阵列 |
| 先进先出: | 先入先出 |
| PMT: | 光电倍增管 |
| GUI: | 图形用户界面 |
| BSA: | 牛血清白蛋白 |
| 定单计划: | Octadecyltrichlorosilane |
| 这部电影: | 荧光寿命成像显微镜 |
| 拿拿淋: | 数值孔径 |
| 扫描电镜: | 扫描电子显微镜 |
| SCDE: | 单细胞的微分表达式 |
| 大卫: | 数据库的注释,可视化和综合发现 |
| 方差分析: | 方差分析。 |
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
手稿是通过贡献的作者写的。所有作者都批准的最终版本的手稿。
确认
作者感谢杰瑞·丹尼尔斯,明尼苏达大学基因组学中心,通过RNAseq小心处理的RNA样品。作者承认艾莉森·伯曼和托马斯·Houghland技术援助。作者还要感谢Peiman Hematti,威斯康星大学麦迪逊分校提供间充质干细胞。资助这项工作是由NSF提供研究生研究奖学金Quyen Tran。NSF BME奖,1445650。NIH R01 HL137204。NIH R01 HL131017。
补充材料
补充1。补充表1:包含原始数据相关的跟踪物理结构修改。
补充2。补充表2:包含FPKM数据对所有记录的样本。
补充3。补充表3:包含样本类型之间的差异表达基因。
补充4。补充表4:包含基因本体分析。