GM1神经节苷脂能促进人类肌腱干细胞的成骨分化

文摘

神经节甘脂,唾液acid-conjugated鞘糖脂的脂质筏、监管机构被认为是重要的细胞增殖,迁移和细胞凋亡。由于其独特的定位在细胞膜,它们调节几个关键的细胞受体的活性,并增加证据支持他们的参与也在干细胞分化。在这种背景下,我们在此报告所扮演的角色的神经节苷脂GM1在人类肌腱干细胞成骨分化(及)。特别是,我们发现增加GM1在骨生成工具的驱动过程。事实上,补充的神经节苷脂在中显著增加及成骨分化能力。从力学上看,我们发现GM1补充减少引起的血小板源生长因子受体磷酸化-β(PDGFR -β),这是一个已知的抑制剂的成骨的承诺。这些结果进一步证实了通过观察GM1补充能够恢复时抑制对骨的影响过程与外生PDGF抑制。

1。介绍

受伤的tendon-to-bone enthesis是常见的骨科领域的医学,和高失败率常与她们修复(1]。促进组织再生的生物佐剂的使用,如生长因子、富含血小板血浆,和干细胞,潜力巨大改善手术后的愈合率和功能(2]。因此,使用肌腱干细胞改善tendon-bone结修复被认为是有利的,因为肌腱干细胞已经属于肌腱环境和具有可塑性可能恢复的不同组织中发现tendon-to-bone enthesis [3]。沿着这些线路,我们报道的第一隔离人类肌腱干细胞的冈上肌和长头肱二头肌肌腱,我们证明了他们可以诱导分化为成骨细胞,脂肪细胞,肌肉细胞(4]。尽管如此,在干细胞领域的开放问题是完善差异化策略为了向特定表型驱动过程,避免干扰细胞或承诺,更不利的是,不受控制的未分化的祖细胞的增殖。在这种背景下,本研究神经节甘脂的作用,唾液acid-containing鞘糖脂(gsl)无所不在地分布在细胞膜(5),及成骨分化的。大量研究证实,神经节甘脂及其表达水平控制在开发过程中(6),细胞特定类型(7),支持这个想法,这些分子是关键球员在细胞的承诺。虽然这些脂类生物的角色显然意识到,因为他们已经被证明参与过程像细胞增殖8],细胞粘附[9,细胞凋亡10),和分化11),他们所知甚少在干细胞体内平衡和分化中的作用。尽管如此,它已经表明,减少神经节苷脂生物合成抑制msc的神经分化过程的早期阶段(12],我们组最近表明,增加神经节苷脂GD1a是至关重要的对人类骨髓间充质干细胞(MSC)分化(13]。此外,我们证明了关键作用的唾液酸酶NEU3调节神经节苷脂GM3内容,这是一个主要在骨骼肌细胞分化和生存缺氧(14- - - - - -17]。显然,神经节甘脂主要分布在细胞质膜的脂质筏,富含关键酪氨酸激酶受体,本研究进一步证实了概念,我们开始完全公布这些鞘脂类在干细胞生物学的作用。

2。材料和方法

2.1。细胞隔离和文化

人类肌腱干细胞(及)隔绝冈上肌肌腱期间收集的标本关节镜肩袖修复,如前所报道(4]。孤立在基本培养基培养及被α修改(αmem)(默克公司)补充了2毫米谷酰胺(Euroclone), 1% antibiotic-antimycotic混合物(Euroclone)和20% (v/v胎牛血清(的边后卫)(HyClone热费希尔科学)37°C公司5%₂和95% air-humidified气氛。每2 - 3天中被改变。

2.2。成骨、脂肪形成的分化

及被播种在3×10的浓度⁴细胞/厘米²在生长介质,24小时后,细胞转向成骨的或脂肪形成的媒介为17天或21天,分别。成骨分化培养得到的细胞在DMEM-low葡萄糖(默克公司)补充4毫米谷酰胺(Euroclone), 1% antibiotic-antimycotic混合物(Euroclone), 10%的边后卫(HyClone热费希尔科学),10 nM维生素d3(默克密理博)和间充质干细胞成骨工具包(默克密理博)根据制造商的指示。脂肪形成的分化诱导了细胞培养的DMEM-low葡萄糖补充4毫米谷酰胺,1% antibiotic-antimycotic混合物,10%的边后卫,和间充质干细胞脂肪生成工具(默克密理博),根据制造商的指示。评估的影响神经节苷脂GM1治疗(圣克鲁斯生物技术)分化,及培养了17天的成骨的媒介或脂肪形成的21天中补充了1,10、50和100μM GM1。评估血小板源生长的影响factor-BB (PDGF-BB热费希尔科学)成骨分化,细胞培养的成骨的介质包含PDGF-BB在最后10 ng / ml的浓度。分化培养基是改变每2 - 3天。

2.3。鞘脂类代谢放射性标记的细胞

细胞鞘脂类的代谢放射性标记进行如前所述,Riboni et al。18]。简单地说,[3 -³H]鞘氨醇(D-erythro > 97%, 50μCi, 1.85兆贝可PerkinElmer)溶解在DMEM-low葡萄糖10%的边后卫最终浓度为2.4 nM鞘氨醇,对应110.000 dpm /毫升放射性。中被加入到细胞和孵化2小时(脉冲)37°C,那么取而代之的是DMEM-low葡萄糖10%的边后卫没有(³H]鞘氨醇48小时(chase)。孵化后,细胞收获细胞刮在磷酸盐(PBS)。细胞悬浊液是冻结和冻干。

2.4。提取和色谱分离放射性标记的鞘脂类

总脂质提取了如前所述的坏蛋et al。13]。简单地说,第一次提取脂质20:10:1 (v/v)氯仿/甲醇/水,干下氮流,然后一个两阶段划分进行了在氯仿/甲醇二:1 (v/v)和20% (v/v)水。分区后,神经节甘脂的水相的高效薄层色谱分离和分析(效果),使用溶剂氯仿/甲醇/水CaCl 0.2%运行₂60:40:9 (v/v/v)[19,20.]。放射性标记的鞘脂类是可视化Beta-Imager 2000 (Biospace)。与个人相关的放射性脂质决定β视觉软件(Biospace)。

2.5。RNA提取和实时PCR

总RNA分离使用试剂盒试剂(Ambion,生活技术),和1μg中提取RNA的反向转录cDNA使用iScript互补脱氧核糖核酸合成装备(Bio-Rad)根据制造商的指示。实时PCR进行的96孔板10 ng cDNA作为模板,0.2μM引物,2 x电力SYBR绿色PCR反应混合液(Promega) 20μ每口井的L最后体积,使用StepOnePlus实时PCR系统(应用生物系统公司)。以下引物被用来放大相应的靶基因:人类碱性磷酸酶(ALP) 5-CGCACGGAACTCCTGACC-3和反向5-GCCACCACCACCATCTCG-3 ,过氧物酶体proliferator-activated受体-γ(PPAR -γ)转发5-TTCCTTCACTGATACACTGTCTGC-3和反向5-GGAGTGGGAGTGGTCTTCCATTAC-3 ,脂蛋白脂肪酶(LPL) 5-AGAGAGAACCAGACTCCAATG-3和反向5-GGCTCCAAGGCTGTATCC-3 ,β1,3-galactosyltransferase (GM1合成酶)5-CGCCTTCCAGGACTCCTACC-3和反向5-CCGTCTTGAGGACGTATCGG-3 ,骨钙素向前5-GCAGCGAGGTAGTGAAGAG-3和反向5-GAAAGCCGATGTGGTCAGC-3 ,和S14系列(作为内生控制所有实时PCR实验)5-GTGTGACTGGTGGGATGAAGG-3和反向5-TTGATGTGTAGGGCGGTGATAC-3 。

2.6。分析矿化

矩阵的矿化及评估在使用骨成骨分化的17天化验设备(默克密理博)。简单,细胞被固定为4%多聚甲醛在室温下15分钟。为了探测矿物沉积在细胞外基质,细胞被洗两次与PBS和孵化与茜素红染色溶液为20分钟。染色的染料被提取的单层根据制造商的指示和量化使用维克多3仪器(珀金埃尔默)。

2.7。免疫印迹

细胞在冰冷的PBS收获细胞刮和离心机在400 g×10分钟4°C。细胞细胞溶解在缓冲区里帕(150 mM氯化钠,特里同x - 100 1%, 0.5%钠脱氧胆酸盐,0.1%钠十二烷基硫酸盐、pH值和50毫米三8)包含完整的蛋白酶和磷酸酶抑制剂(默克公司)。细胞溶菌作用后,样本离心机在10000×4 g 15分钟°c .蛋白质含量测定用皮尔斯BCA蛋白质化验设备(热科学)。蛋白质被加载到10% sds - page凝胶,然后转移到一个硝基膜(由electroblotting Trans-Blot Bio-Rad实验室)。挡住了膜后5% (w/v0.1%的脱脂奶粉)Tris-buffered saline-Tween (TBS-T) 1小时在室温下,一夜之间他们孵化在4°C以下主要抗体:兔子phospho-PDGFR -β1:1000稀释(Y751、细胞信号);兔子PDGFR -β1:1000稀释(细胞信号);和兔单克隆早期内体抗原1 (EEA1), 1: 1000稀释(细胞信号)。膜被洗了三次TBS-T和孵化1小时在室温下与特定的二级抗体。特别是,phospho-PDGFR -β与IRDye孵化®800 cw山羊anti-mouse免疫球蛋白(LI-COR),总PDGFR -β与IRDye第680山羊anti-rabbit免疫球蛋白(Li-COR)和EEA1 HRP-conjugated anti-rabbit免疫球蛋白(Amersham),稀释1:5% (5000w/v)在TBS-T脱脂奶粉。分析了膜的奥德赛®FC成像系统(LI-COR)和特定的光密度分析图像工作室™软件(LI-COR)。

3所示。结果

3.1。神经节苷脂的变化及对成骨细胞和脂肪细胞分化

评估及有关的神经节苷脂模式分布,细胞新陈代谢和鞘脂类前体(3 -放射性标记的³H]鞘氨醇,定量分析了HTPLC加上radiochromatoscanner,如“材料和方法。“在增殖及神经节苷脂分布如下:GM3 (7.85±30.79%), GM2 (2.33±2.53%), GM1 (2.94±7.28%), GD3(19.35±43.83%),和GD1a(2.80±4.71%),与GM3 GD3主要神经节甘脂(图1(一)和1 (b)T0)。

接下来,神经节苷脂的变化模式进行评估及成骨细胞和脂肪细胞分化,如前所报道(417和21天后),通过代谢放射性标记的细胞培养成骨介绍过o。d。邓肯()或脂肪形成的(公元)中(图1(一))。及向成骨细胞分化时,1.6——2.8倍增加GM3和GM1神经节甘脂是观察,分别减少GD3 3.7倍,比增殖未分化的细胞。及向脂肪细胞分化时,GM3增加了1.7倍和1.5倍下降GD3相对分布观察,未分化的细胞相比,无显著变化的相对数量GM1可以观察(图1(一))。测试是否观察到增加GM1在骨是由于其生物合成的upregulation, GM1合成酶表达测量实时PCR,和2.6倍增加可以观察到分化过程的结束,比增殖及有关。另一方面,减少3.2倍GM1合成酶表达测量及诱导分化为脂肪细胞(图时1 (b))。

3.2。外生GM1对成骨分化的影响及有关

测试的角色GM1在骨生成增加,外生1,10、50和100μM GM1在成骨分化过程中补充。成骨的高山标志基因的表达是衡量实时PCR相比,经过17天的分化和未分化细胞(T0)和GM1-free成骨的媒介介绍过o。d。邓肯()。结果显示显著增加1.8——2.4倍高山表达在细胞补充50或100μM GM1除了成骨的介质,分别比(图2(一个))。

之后,细胞诱导分化成骨细胞在50或100μM GM1和评估他们的能力来维持细胞外基质矿化的使用标准茜素红染色,如“材料和方法。“染料相对量化显示增加红染色及分化GM1的存在,这是明显高于100年(1.7倍)μM GM1-treated细胞(图2 (b))。相反,外生GM1强烈抑制脂肪形成的的基因表达标记LPL和PPAR -γ(数据2 (c)和2 (d))。

3.3。GM1-Activated成骨机制

测试骨是否激活通过抑制PDGFR GM1 -β,及诱导分化的神经节苷脂,然后受到PDGFR -β通过免疫印迹分析。结果显示,GM1-treated细胞在PDGFR——减少了40%β磷酸化,测量pPDGFR / PDGFR比率,比未经处理的细胞,支持的假设GM1-induced抑制PDGFR -β(图3(一个))。此外,它是评估外生GM1是否能够抵消PDGF-induced激活PDGFR -β,这是众所周知的,抑制骨(21]。这个目的,及诱导分化为17天在正常成骨的介质存在10 ng / ml PDGF-BB,导致降低43%高山表达式(图3 (b))和骨钙素的表达下降了40%,实时PCR(图3 (c))。另一方面,增加100人μM GM1成骨的介质包含10 ng / ml PDGF-BB完全恢复及有关的分化能力,高山和骨钙蛋白表达水平与分化治疗控制(图3 (b)和3 (c))。

4所示。讨论

在这项工作中,我们调查的角色神经节甘脂成年人肌腱干细胞的成骨分化,我们孤立和特点从人类首次冈上肌肌腱(4]。神经节苷脂模式分析的方法需要一个初始的代谢放射性标记的细胞通过添加[3 -鞘脂类³H]鞘氨醇的培养基已经有效地用于我们实验室多年来(13- - - - - -15]。结果,细胞合成放射性标记的鞘脂类,可以分离效果radiochromatoscanner色谱法和精确测量。代谢放射性标记的使用极大地提高了方法的灵敏度,减少所需的干细胞数量为每一个分析。结果表明,及有关的两个主要的神经节甘脂,GM3 GD3,增加和减少,分别在细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化,表明这些神经节甘脂的调制可能是与一般细胞的生理状态的变化而不是承诺向一个特定的细胞谱系。另一方面,显著增加的神经节苷脂GM1只是观察到骨生成期间,支持这个神经节苷脂的可能作用在驱动过程中(图1)。GM1内容的增加伴随着合酶的增加,而不是减少在脂肪生成(图1)。有趣的是,分化培养基的添加外源性GM1改善骨生成、确认的高山基因表达显著增加,这是一个特定的成骨细胞标记,以及通过增加细胞外基质矿化,所评估的茜素红染色(图2)。相反,脂肪形成的的基因表达标记PPAR -γ和LPL减少GM1补充脂肪形成的分化中,支持的神经节苷脂能显著抑制过程(图2)。然后我们调查了GM1-induced增加及骨生成的机制。沿着这条线,据报道,神经节甘脂可以调节表皮生长因子受体的活动(22),纤维母细胞生长因子受体(23),神经生长因子受体(神经生长因子)24),血小板源生长因子受体(PDGFR) [25),胰岛素受体(IR) [26]。特别是,它已经表明,GM1 PDGFR监管通过不同的机制是至关重要的行动似乎是细胞泛型类型。在这种情况下,它已被证实,在成纤维细胞,GM1能够抑制ligand-mediated磷酸化的酪氨酸残基的胞质尾受体(27),以及ligand-induced细胞内和PDGFR SH2-containing蛋白质协会在人类神经胶质瘤细胞28]。相反,在Swiss-3T3细胞,表明GM1-mediated抑制PDGFR需要细胞外和/或跨膜域受体(29日]。此外,在相同的细胞系,它已经表明,GM1调节PDGFR信号通过控制外受体的分布和PAG调节细胞膜的脂质筏和分区和PDGFR的促有丝分裂的信号通过一个小窝(GM1水平增加30.,31日]。据报道,PDGF / PDGFR信号参与调控各种细胞功能,包括骨生成和成年干细胞向成骨细胞分化。特别是,它的差别已经观察到对这些PDGRα促进成骨分化的msc通过BMP / smad信号通路(32),和PDGFR的阻塞β通路显著促进成骨细胞分化和矩阵在小鼠成骨细胞矿化MC3T3-E1细胞(33]。此外,PDGFR——β抑制增加了基本鼠成骨细胞的成骨分化细胞(34)和人类msc (21]。,这些结果支持假设GM1可能施加其影响骨生成的抑制PDGF受体及有关。为了验证这个假设,我们评估了PDGFR——激活水平β受体在骨外生GM1在培养基的存在。事实上,我们观察到显著降低受体的激活GM1时添加到分化培养基(图3)。为了进一步证实我们的假设,我们评估GM1是否能够抵消骨生成的抑制由PDGFR的激活——造成的β在添加的配体(PDGF-BB)在分化培养基。结果表明,PDGF-BB刺激抑制骨生成,证实了高山和骨钙素基因表达明显降低。正如预期,增加GM1成骨的介质包含PDGF-BB完全恢复及有关的分化能力,我们能够观察到高山和骨钙素的表达水平与未经处理的控制细胞(图相似3)。

5。结论

总之,我们的结果表明,神经节苷脂GM1在成骨分化及有关的显著增加。最重要的是,神经节苷脂增加仪器驾驶过程通过抑制PDGFR -β。的确,分化培养基的添加外源性GM1大大增加及成骨的能力,支持其可能作为新的因素被添加在分化培养基来改善这个过程。在我们实验室正在进行进一步的研究来全面阐明GM1 PDGFR——的监管机制β激活和可能的治疗GM1在再生医学中的应用。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是支持的部分“第2行赠款、B型”的生物医学科学健康、米兰(意大利)和由当地大学研究基金IRCCS亲自到圣Donato医院临床研究部分由意大利卫生部。

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