人类Urine-Derived干细胞:潜在的软骨细胞疗法的缺陷

文摘

干细胞治疗被认为是一种乐观的方式来取代目前的治疗软骨缺损。最近,人类urine-derived干细胞(hUSCs),从尿液分离,研究了作为一个有前途的候选人为许多组织工程治疗因其multipotency和足够的扩散活动。然而,它还没有报道hUSCs是否可以用于软骨缺陷。在这项研究中,我们发现,诱导hUSCs chondrogenic-related表达蛋白质,包括aggrecan和胶原蛋白II,是调节基因表达水平在体外。此外,我们结合hUSCs和透明质酸(HA)和hUSCs-HA注入兔膝关节软骨缺损。12周后注射,组织学分析(他、甲苯胺蓝和马森三色的染色),免疫组织化学(aggrecan和胶原蛋白II)和组织学分级的样本表明hUSCs-HA可以刺激更多neocartilage形成与单独hUSCs相比,纯HA,盐水,只诱导软骨再生。在这项研究中,我们表明,hUSCs可能是一个潜在的细胞来源干细胞疗法治疗cartilage-related缺陷在未来。

1。介绍

软骨缺损创伤造成的损伤和骨关节炎(OA)是世界范围的一个主要公共健康威胁(1]。软骨缺陷导致关节活动的限制,导致疼痛和生活质量很差。目前,治疗方案为软骨缺陷包括理疗、外部治疗,关节内的灌溉、软骨成形术,微裂缝,mosaicplasty。然而,这些治疗无法持续刺激生产的透明软骨组织修复,完全填满空的缺陷,或集成修复组织与相邻的本地组织(2]。为了解决这些问题,组织工程被认为是一个有前途的替代战略软骨的再生。

自体软骨细胞移植(ACI)是一种细胞疗法,从nonlesion地区健康的软骨细胞的收获和移植回病变区域(3]。最近,美国食品和药物管理局(FDA)在美国批准使用自体软骨细胞培养在猪胶原膜(》)修复全层软骨缺损在成人患者。ACI和》的过程,它是技术上的挑战获得高密度的软骨细胞和维护他们的分化状态(3- - - - - -5]。因此,其他需要探讨组织工程细胞来源。先前的研究表明,间充质干细胞(msc),如人类脂肪tissue-derived干细胞(hASCs)和人类骨髓间充质干细胞(hBMSCs),是潜在的干细胞来源的应用软骨组织工程方法(6,7]。然而,hBMSCs有限的来源和获取的过程hASCs入侵,敦促更实际的需求和适合组织工程软骨的细胞来源。

自张等人最初隔离的msc描述人类尿液(8),hUSCs收到很大的关注,和几个优点hUSCs已确定。首先,hUSCs显示强大的增殖能力和多功能分化的能力(9]。其次,可以通过一个简单的访问hUSCs,非侵入性,和低成本的方法,从而避免了手术(10]。更重要的是,hUSCs孤立于自体尿液不诱发免疫反应或拒绝。此外,因为没有侵入性和痛苦的过程涉及在收集尿液,伦理问题也越来越少。在先前的研究9,11,12],hUSCs被分化成neuron-like细胞、移行细胞细胞,平滑肌细胞,成骨细胞,已被成功地应用于研究涉及神经、尿,骨组织再生(9,11,12]。然而,它还没有报道是否hUSCs可以应用于软骨组织再生。

小说软骨缺陷的再生策略涉及种子细胞/到生物材料(13]。生物材料为细胞提供一个合适的微环境,包括机械支持工程组织(14]。透明质酸(HA)滑液的重要组成部分,保护关节软骨,润滑和吸收冲击15]。因此,哈是软骨修复能提供一个合适的平台,是常用的。

因此,在这项研究中,我们获得hUSCs按前面描述的程序的隔离和文化8,10和评估他们的软骨形成能力。我们也调查了hUSCs是否可以作为一个潜在的软骨组织工程细胞来源通过比较hUSCs + HA的疗效,hUSCs孤独,独自公顷,生理盐水后注入兔膝关节软骨缺损。治疗结果的评估是总值外观和组织学和免疫组织化学分析。

2。材料和方法

本研究的指导下进行护理和使用国家卫生研究院的实验动物。研究伦理委员会对人类和动物样本协议是中国西部医院的伦理委员会批准,四川大学,成都,中国。

2.1。隔离和人类Urine-Derived干细胞的增殖

主要hUSCs得到从五个健康的成年男性捐赠者,他们23至27岁(平均年龄:25年)没有泌尿系统疾病,使用前面描述的方法(8,10]。总共200毫升无菌收集尿液样本的每个人,和后续步骤分别进行。每一个样本添加1%青霉素和链霉素和离心10分钟1500 rpm。细胞颗粒在25毫升resuspended磷酸盐(PBS)和离心10分钟1500 rpm。然后,细胞被播种在24-well板块与培养基组成的角化细胞无血清培养基(KSFM)和胚胎成纤维细胞中(EFM)比1:1以及5%胎牛血清(的边后卫)[8,10]。媒介是改变每三天,细胞通道到达subconfluency后用胰蛋白酶。

评价细胞增殖,hUSCs被播种到96孔板,100年孵化μL细胞培养基在37°C和5%的公司₂。细胞生存能力评估在天0,1,3,5,7,9使用细胞计数Kit-8 (CCK-8;生活技术,美国)。在每个时间点,10μL (CCK-8试剂添加到每个好,光密度测量使用分光光度计波长490 nm背景校正在630海里。

2.2。流式细胞术分析

当通道4 (P4),使用trypsin-EDTA hUSCs被收获,1×10⁶hUSCs resuspended在汉克的平衡盐溶液(hbs)补充1% (v/v牛血清白蛋白(BSA)。细胞培养30分钟在4°C在黑暗中,紧随其后的是以下单克隆抗体:CD34-APC(美国BD) CD45-PE(美国BD) HLA-DR-PE(美国BD) CD29-PE(美国BD) CD73-PE(美国BD) CD90-FITC(美国BD)、CD105(英国Abcam)和存在(英国Abcam)。接下来,细胞被洗PBS和孵化与适当的二次抗体。细胞进行了分析使用贝克曼Cytomics FC500流式细胞分析仪(美国贝克曼库尔特)。

2.3。Multilineage人类Urine-Derived干细胞的分化潜能

2.3.1。成骨诱导

诱导成骨分化,hUSCs养殖密度的5×10³细胞/在6-well板21天37°C和5%条件下的有限公司₂在成骨的介质(Cyagen生物科学公司,美国)。媒介是每三天更换一次。感应后,细胞被固定为75%乙醇为20分钟和染色茜素红溶液(美国σ)30分钟。

2.3.2。脂肪形成的诱导

hUSCs(4通道)的密度培养5×10³细胞/在6-well板并使用脂肪形成的诱导培养基(Cyagen生物科学公司,美国)。媒介是每三天更换一次。总共14天后,细胞被固定用10%福尔马林和沾油红O解决方案(美国σ)30分钟可视化脂质空泡。

2.3.3。Chondrogenic分化

诱导chondrogenic分化,1×10⁶hUSCs离心5分钟在1500 rpm之后,颗粒在chondrogenic resuspended介质(Cyagen生物科学公司,美国)。21天的感应后,甲苯胺蓝的解决方案是使用可视化细胞外matrix-bound蛋白聚糖。用于免疫荧光,颗粒嵌入最佳切削温度(OTC)复合后chondrogenic分化。与II型胶原细胞随后被孵化(1:100;罗福斯、美国)和anti-aggrecan (1: 100;罗福斯,美国)抗体2 h,在PBS洗两次,沾anti-mouse Alexa萤石594免疫球蛋白g (1: 200;杰克逊,美国)。核与DAPI染色。使用荧光显微镜观察细胞(日本奥林巴斯IX50)。

2.4。定量逆转录酶聚合酶链反应(rt - pcr)

chondrogenic感应21天后,细胞RNA提取使用试剂盒试剂(美国生活技术)和reverse-transcribed cDNA使用PrimeScript RT试剂盒(豆类、日本)。特定基因的表达是量化使用SYBR预混料交货Taq II工具包(豆类、日本)IQ5实时系统(美国Bio-Rad)。引物序列用于qPCR展示在表1。目标基因表达分析和h-actin相比,它作为一个参考基因。

2.5。人类Urine-Derived干细胞软骨组织工程:在活的有机体内研究

2.5.1。建立hUSCs-Hyaluronic酸的混合物注入

透明质酸(HA)购买从Furuida生物科学(HA解决方案的浓度是1%)。hUSCs和HA 1×10的比例混合⁷:1毫升。提供的混合物是hUSC培养基。

2.5.2。在hUSCs-HA细胞形态、生存能力和扩散

细胞形态学的hUSCs HA与hUSCs在PBS评估细胞的状态。细胞的生存能力哈决定使用一个膜联蛋白V-FITC /π凋亡检测设备(16]。24小时后建立hUSCs-HA解决方案系统,hUSCs被离心从hUSCs-HA检索的解决方案。细胞悬液沾满了斑斑5μL (FITC-conjugated膜联蛋白V和10μL(π。细胞流式细胞仪分析了石中剑(美国BD)。

细胞增殖的hUSCs-HA hUSCs-PBS评估在天0,1,3,5,7使用CCK-8工具包(美国生活技术)hUSC培养基与HA或PBS。在每个时间点,10μL CCK-8试剂添加到每个好,光密度是衡量使用分光光度计波长490 nm背景校正在630海里。

2.5.3。动物模型

所有手术一般戊巴比妥钠麻醉下进行,并努力减少动物的痛苦。在这项研究中,共计24 12个新西兰白兔(2 - 2.5公斤,没有性别限制)是从成都Dashuo实验动物有限公司购买的。双方进行了手术。

建立软骨缺损,兔子被麻醉的静脉注射戊巴比妥钠(20毫克/公斤)。膝盖的一般消毒后,上了一个口子的内侧关节膝盖。关节囊被打开后,膝盖骨脱臼外侧,股骨髁部公开。直径5毫米的角膜环钻用于软骨缺陷轮廓的网站。使用放大镜可视化Noncalcified软骨被刮走了。建模的目的是消除软骨尽可能不破坏软骨下骨(图1)。手术后,动物收到抗生素(青霉素连续三天)和止痛剂(丁丙诺啡两天)。兔子的监控活动的迹象,关节运动,局部感染和其他并发症。

三周后手术,兔子被随机分为四组后注入不同的治疗物质。我们选择较低和髌骨的侧边缘注入物质和消除关节液的吸确认一个准确的注入点。建立了下列四组:A组(i) (hUSCs加上哈, ),1×10⁷细胞和1毫升1% HA (pH值6.7,1000 kDa, Furuida,中国)注入膝关节腔;(2)B组(hUSCs ),1×10⁷细胞和1毫升生理盐水注入膝关节;(3)C组(HA组, ),只有1毫升1% HA注入膝关节;及(iv) D组与生理盐水对照组注射( )。

2.5.4。总出现

12周后注射,24只兔子是牺牲和48膝盖是收获。周围的软组织被移除,和有缺陷的软骨组织。之后,两个调查员评估总值的软骨组织,包括修复的程度,集成边境地带和宏观表面外观。

2.5.5。组织学分析

样本与PBS洗两次,7天在4.0%多聚甲醛固定在25 - 30°C,和脱钙10%甲酸为3个月。脱钙作用后,从外侧股骨髁部被切成三块沿矢状面内侧髁。所有样品都是嵌入在石蜡,切成5μ米厚的部分是沾hematoxylin-eosin(他),马森,甲苯胺蓝。的细胞形态、颜色矩阵,完整无缺的表面,与相邻的宿主软骨和软骨厚度和集成。

2.5.6。免疫组织化学分析

石蜡包埋组织与二甲苯脱蜡、内源性过氧化物酶被用3%过氧化氢。部分与PBS冲洗和阻塞山羊血清(四川大学有限公司,中国),其次是孵化与主抗体:鼠标II型胶原蛋白和鼠标anti-aggrecan(美国罗福斯)12 h在4°C。与PBS洗涤三次5分钟后,部分与山羊孵化anti-mouse免疫球蛋白(H + L)二级抗体(过氧化物酶Affinipure, 115-035-003,杰克逊,美国)在室温下30分钟以及peroxidase-conjugated链霉亲和素(四川大学有限公司,中国)。接下来,部分与PBS 5分钟洗了三次。最后,3,3-diaminobenzidine (DAB)加入了含有0.01%过氧化氢溶液,和部分与苏木精复染色。

2.5.7。组织学得分

量化治疗结果的差异在组织学和免疫组织化学染色,组织学得分是根据皮内描述的方法et al。17]。总之,范围从0(好)14(严重)。在我们的研究中,填充的缺陷,重建的骨软骨交界处,矩阵染色,细胞形态(表2)。

2.6。统计分析

所有的值表示为平均值±标准偏差(SD)。使用SPSS 17.0统计分析软件SPSS,美国)。使用学生的结果进行了分析t以及, 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。hUSCs的形态和特征

细胞殖民地hUSCs初始镀后观察7 - 10天,细胞的“米粒”式的外观(图2(一个))。经过几个段落,hUSCs总是表现出一个细长的形态(图2 (b))。此外,流式细胞术结果显示hUSCs CD29有阳性染色,CD73, CD90、CD105,存在,但不利于CD34、CD45、mhc ii HLA-DR(图2 (c))。数据2 (d)和2 (e)显示,在特定诱导培养后媒体,hUSCs证明分化成成骨的或脂肪形成的血统的积极的对茜素红和油红O染色,分别。此外,CCK-8试验表明,细胞经历了一个快速增长阶段从第一天到第三天。第三天之后,增长放缓(图2 (f))。数据表明,细胞分离出人类尿液和维护特定的文化条件下被归类为MSC。

3.2。在体外Chondrogenic分化hUSCs的潜力

21天chondrogenic感应后,甲苯胺蓝染色的hUSCs表明多糖和蛋白聚糖(图的存在3(一个))。chondrogenic-related标记物的表达,比如aggrecan和胶原蛋白II,决心通过免疫荧光试验(图3 (b))。此外,实时PCR显示chondrogenesis-related基因的表达,aggrecan Sox9,胶原蛋白II是调节,诱导hUSCs(图3 (c))。

3.3。在hUSCs-HA细胞形态、生存能力和扩散

hUSCs形态学的HA在0 h,类似于PBS hUSCs 5 h, 48 h后播种(图4(一))。膜联蛋白V /π试验表明,24小时后,84.2%的hUSCs播种在哈还活着(图4 (b))。此外,CCK-8试验表明,细胞的增殖能力hUSCs-HA组类似于hUSCs-PBS小组天0,1,3,5,7(图4 (c))。

3.4。总出现软骨

不同程度的软骨损伤是保持注射后12周。代表总出现软骨如图5。没有显著变化在膝关节软骨退化观察中,除了在软骨缺损。A组(hUSCs +公顷),新成立的cartilage-like组织缺陷网站经常被观察到,表面颜色是相对正常,新成立的cartilage-like组织连接与周围软骨组织。B组(hUSCs)也显示新成立cartilage-like组织。然而,划痕是注意缺陷之间的连接网站和正常的网站。C组(公顷),一些新成立的cartilage-like组织观察。一个明显的划痕但是出现缺陷之间的连接网站上和正常的网站。在D组(对照组用生理盐水注射),软骨缺陷是没有恢复和新成立的cartilage-like组织几乎没有观察到。

3.5。组织学评估的新软骨的形成在活的有机体内软骨缺损模型

马森他染色,染色,甲苯胺蓝染色法进行。代表他的新形成的软骨染色组织的形象,B, C, D图所示6。在A组中,缺陷网站是由组织类似于neocartilage,软骨细胞在现在。矩阵染色正常外观。在B组,签署类似于软骨组织和纤维组织观察。相比之下,neocartilage-like组织缺陷网站上很少见到在C和D组。

代表图像的马森染色图所示7。在A组,许多软骨细胞。定期组织类似于软骨纤维观察,和矩阵的颜色接近正常软骨组织。在B组,软骨细胞几乎没有观察到,虽然大多数细胞nonchondrocytes。苍白的颜色矩阵相比,正常的软骨。在C和D组,没有观察到软骨缺陷网站。

代表图像的甲苯胺蓝染色图所示8。A组的染色显示一个深蓝色的缺陷处染色均匀层软骨细胞和明显的潮标。相比之下,只有淡蓝色染色,很少有软骨细胞,大量的纤维细胞和纤维组织观察在b组没有neocartilage组织中观察到C和D组。

代表图像的免疫组织化学分析neocartilage从所有四组给出的数字9和10。A组表现出大量软骨细胞的细胞。此外,缺陷在A组的颜色类似于周围组织,这表明,大量的II型胶原蛋白和aggrecan蛋白质分泌。在B组,一些细胞类似于软骨细胞观察和缺陷的光色是网站。在C和D组,没有检测到新成立的组织。数据表示的存在增加胶原纤维和aggrecan蛋白质A组与B组相比,C和d组织化学分析和免疫组织化学暗示hUSCs结合HA更有效地刺激软骨的再生比hUSCs单独或HA。

3.6。组织学得分

A组的组织学得分(2.75±0.62)的得分明显高于B组(6±0.74, ),C组(9.58±0.79, )和D组(12.41±0.79, )。这些发现表明hUSCs-HA单独而不是独自hUSCs和HA是最有效的治疗在促进neocartilage的形成(图11)。

4所示。讨论

在我们的研究中,我们探索的细胞性质hUSCs chondrogenic力量分化成软骨细胞和比较。在兔子后注入膝关节软骨缺陷或不哈,aggrecan和胶原蛋白II的沉积是研究作为neocartilage特点的形成在活的有机体内。hUSCs的自我更新能力和分化潜能被检查在体外,而他们的能力来支持新的软骨形成软骨缺损模型评估通过组织学评估。这些发现表明hUSCs可能是一个潜在的替代治疗软骨组织工程细胞来源,尤其是当结合哈。

以前的研究报道,干细胞适当播种到生物材料能促进软骨的再生不良网站(13,18]。msc可以来自各种各样的人体组织,包括骨髓、骨骼肌、脂肪组织,脐带血,皮肤,牙髓,子宫内膜,在大量研究已报告之前(19- - - - - -22]。MSC特色可行的细胞类型在尿液最近被发现8,10,23]。在我们的研究中,我们证实hUSCs,当在适当的条件下培养如上所述,拥有属性属于msc。虽然裴et al。24)报道,hUSCs没有显示能够分化成软骨细胞5% O₂和5%的公司₂孵化器14天,关et al。9),巴拉et al。10高,et al。25]表明hUSCs可以区分向chondrogenic血统chondrogenic感应后28天。康等。26)报道,hUSCs可以分化成软骨细胞但显示hASCs相比chondrogenic分化率相对较低。关等。9)也证明了hUSCs拥有生物学特性类似于hASCs multilineage分化潜能。这里,我们成功地孤立hUSCs从人类尿液样本,并演示了hUSCs分化成软骨细胞的能力20% O₂和5%的公司₂孵化器21天,基于证据的细胞形态、蛋白质表达、chondrogenesis-related基因表达。充足的证据已经证明了这一三维文化比稳定的单层培养软骨细胞表型在体外(27],它匹配的方法,我们成功地诱导hUSCs分化成软骨细胞。因此,文化环境和培养时间可能影响hUSCs chondrogenic归纳的结果。此外,与自体的细胞移植相比,依靠昂贵和侵入性手术,我们的研究显示,hUSCs可能提供一个低成本和无害的方法治愈创伤造成的损伤和OA软骨缺陷。

据Venable et al。28),哈可能与软骨损伤有关OA的早期病理变化。OA的治疗关节内的HA注射常用于促进软骨修复,并导致该函数的机制提出了包括抑制促炎细胞因子和趋化因子,促进合成代谢,缓解疼痛(29日,30.]。然而,效果是有争议的31日- - - - - -33]。这种差异可能是由于不当的位置注入(34),次优的剂量的哈,或者长时间间隔诱导OA和注入的哈。在这项研究中,我们注入了哈,hUSCs,或混合成的兔膝关节软骨关节软骨的缺陷和经济复苏的水平相比。与其他组相比,软骨再生hUSCs + HA组被发现是最好的和相应的组织学得分最高。hUSCs + HA组,除此之外,neocartilage-like组织覆盖缺陷网站,发现软骨细胞在组织中恢复过来,而且矩阵染色是正常的。相比之下,只有少数neocartilage-like组织被发现在其他组。我们的研究结果符合一些更早的研究的结果。Neocartilage也报道了Grigolo et al .,谁表明,治疗24周后软骨细胞和HA衍生品,兔膝关节软骨缺陷被修复(18]。韩国的研究人员展示了积极的治疗效果在使用类似的方法(35]。一个可能的解释可能是软骨细胞播种到适当配置合成可生物降解聚合物遵循和执行不同的功能在体外,证明了矩阵的形成(18]。手术植入hUSCs + HA cell-polymer混合物在动物导致新软骨的形成,成熟时间和显示胶原蛋白II型的表达和合成蛋白聚糖(18]。

尽管这项研究的结果是有前途的,之前需要解决几个限制临床应用和进一步的研究是必要的披露:(1)如何提高chondrogenic容量hUSCs因为所有chondrogenic基因的表达水平相对较低(24,26];(2)的优势比其他MSC hUSCs通过对比chondrogenic hUSCs能力与其他MSC类型,如hBMSCs hASCs;和(3)的分子机制参与hUSCs之间的交互和哈。

基于我们之前研究的结果和pH值的测量值,渗透压,和干细胞的存活率的解决方案,我们选择1% HA生理盐水作为干预手段。细胞增殖的能力进行了测试使用CCK-8试验,这表明,细胞的增殖能力hUSCs-HA组相似的细胞hUSCs-PBS组在天0,1,3,5,7。值得注意的是,HA生理盐水对hUSC活动只有很小的副作用。在夏皮罗的研究等。36),这是暗示在兔子可以修复软骨缺损动物在6周。但是可以实现只有缺陷的直径小于3毫米,缺陷的深度触及软骨下骨,和干预缺席。确保我们的实验的可靠性和解决疑问的自愈,我们扩大了缺陷的直径5毫米和删除所有不破坏软骨下骨软骨来避免任何干扰骨骨髓来源msc。

5。结论

总之,我们的研究结果表明,根据干细胞特征,hUSCs可以分为MSC家族。hUSCs能够分化成软骨细胞与第二aggrecan和胶原蛋白的沉积特征在体外。此外,hUSCs-HA可以刺激更多neocartilage形成与hUSCs相比,哈,和盐。这些结果,我们之前研究的结果,表明hUSCs可以替代治疗软骨组织工程细胞来源和一个有前途的候选人,尤其是当结合哈。

的利益冲突

作者声明没有潜在的利益冲突的研究,本文的作者,和/或出版。

确认

这项工作是由中国国家自然科学基金(没有。31370984)。

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