文摘

珊瑚羟基磷灰石/碳酸钙(CHACC)是一种生物可降解和综合分析植骨材料具有广阔的临床表现。CHACC已经被证明可以支持增殖和成骨分化的人类骨髓间充质干细胞(msc)在体外和演示工作作为骨形成功能支架体内。脐带矩阵是一个更容易和丰富的msc的组织来源,但其成骨的能力相比,人类骨髓培养时CHACC尚未被证实。在这项研究中,我们评估了人类msc的成骨分化能力,从骨髓、脐带分离矩阵和特征通过流式细胞术,当培养200 - 300μm CHACC颗粒。3 d的文化特征是brightfield和扫描电子显微镜(SEM)。成骨的潜力评估免疫细胞化学和qPCR骨分化的关键标记(碱性磷酸酶,runx2、I型胶原和骨钙素)。第一天,msc笼罩了CHACC颗粒表面形成瀑样,第七天,细胞已经扩散到附近的桥瀑样。细胞外基质沉积和成骨分化了msc在21天两种组织来源。然而,从骨髓msc了优越的成骨分化能力相比从脐带矩阵。总之,是可能的文化和诱导成骨分化的脐带矩阵CHACC msc。进一步的研究需要优化脐带矩阵的osteogenicity msc释放他们的潜能作为现成的,访问,和丰富的骨组织工程的组织来源。

1。介绍

各种各样的支架的使用在颌面外科和牙科,缺损已报告的“黄金标准”对骨移植程序(1]。然而,收获的缺损,通常从髂嵴,需要手术治疗,这是与附加险的失血,感染,发病率,供应是有限的(2,3]。其他类型的移植包括移植和异种移植,但这些可能会导致免疫反应和被收件人拒绝3];因此,这是至关重要的识别合适的替代材料。

合成生物材料,如羟磷灰石、磷酸三钙陶瓷,水泥,和生物玻璃,是骨移植替代物替代来源。然而,这些合成生物材料不模拟架构,孔隙度、组件和有机自然骨并不是最优的生物降解和宿主组织集成或实际植入或注射。天然珊瑚骨骼具有多孔结构,类似于人类的骨小梁(4]。因为它的主要成分是碳酸钙,水热技术开发完全把碳酸钙是珊瑚羟磷灰石(CHA)临床应用的陶瓷5- - - - - -8]。

我们曾报道一个珊瑚羟基磷灰石/碳酸钙(CHACC)材料植入时显示有前途的临床性能大小从10 - 100×10×10毫米³(9,10]。这种材料不仅性能如孔隙度、表面结构和osteoconductivity珊瑚羟磷灰石(CHA)如前所研究[5- - - - - -7),但也提高了宿主组织集成和骨重建[期间可以完全生物降解9]。在此,我们专注于小型CHACC, 200 - 300μ米粒子,与可能被注入促进政府对颌面部和牙科应用程序。

增加骨生物材料的功能,希望对改造和贡献主机集成、干细胞通常添加(11]。在体外细胞的三维结构(12]从干细胞创建类似活组织被称为瀑样和开发模型转化医学》(13和基因治疗14]。

我们曾表明,人类骨髓(BM)间充质干细胞(msc)可以培养CHACC (9,10]。人类脐带矩阵(UCM)是一种相对较新的msc的来源有几个优势BM包括是非侵入性获得充足供应;它不诱导供体发病率和避免伦理限制。此外,UCM msc增殖率更高,进一步可以扩展没有损失的分化潜能,表现出降低免疫原性,临床使用(15]。骨生成UCM-MSCs已经观察到在单层培养系统16)和三维培养系统,例如,在去除矿物质骨(17)和聚已酸内酯,磷酸三钙(18]。很少有研究将UCM MSC比作BM MSC在三维培养系统(16,19]。

因此,本研究的目的是(1)确认msc可以坚持,增殖,并在200 - 300年进行成骨分化μm CHACC粒子形成3 d瀑样和(2)评估UCM msc的成骨的潜力而BM msc。msc - BM和UCM中分离的特点是流式细胞术。CHACC碎成200 - 300μ米粒子到msc被播种和成骨分化培养基中培养。由此产生的瀑样的特点是brightfield和扫描电子显微镜,碱性磷酸酶染色法、免疫细胞化学和PCR的关键成骨的标记。

2。材料和方法

2.1。人类骨髓的准备

本研究西南威尔士研究伦理委员会批准(12 / WA / 0029),所有患者知情同意书。排除标准包括先前存在的条件(例如,结缔组织疾病、糖尿病、恶性肿瘤)或药物(如类固醇和细胞毒性剂)。BM吸入物从髂骨收获两个雌性(25 - 29岁)和两个男性(22和36岁)手术使用BM骨盆环或髋臼愿望针(英国Burton-on-Trent Mana-Tech有限公司)。样本中收集heparinised愿望针,在室温下运输,120分钟内处理。

单核细胞(跨国公司)与大英博物馆吸入使用histopaque - 1077根据制造商的指示(Sigma-Aldrich,普尔,英国)。40×10⁶跨国公司被播种到75厘米²组织培养瓶(蜂星,他一一Bio-One,斯通豪斯,英国)在10毫升最低基本鹰α修改媒体有10%胎牛血清(Antibiotic-Antimycotic Biosera Uckfield,英国)和1% (100 x,生活技术,佩斯利,英国)和培养7天37°C下5%的股份有限公司₂在空气中。媒体改变了每3 - 4天去除污染不依从造血的细胞,和附着msc培养直到70%汇合的。细胞分离使用Accutase根据制造商的指示(Sigma-Aldrich)和传播在3×10的播种密度⁵每75厘米²培养瓶或低温贮藏在10%二甲亚砜(DMSO) (Sigma-Aldrich) 90%的边后卫在液态氮,以供将来使用。

2.2。人类脐带基质的制备

收集人类脐带和胎盘从足月新生儿选择性剖腹产后四个年龄在30至35岁的母亲和120分钟内处理。本研究西南威尔士研究伦理委员会批准,所有的母亲给了知情同意书。入选标准包括母亲18-50至少37周的身孕。排除标准包括先前存在的疾病(如艾滋病、丙型肝炎或免疫学并发症),婴儿胎死腹中,或双胞胎。3厘米的脐带胎盘是近端解剖和血管小心地删除。剩下的矩阵使用手术刀细细切成小方块。丁组织被放置在25厘米²烧瓶与0.5毫升的边后卫。24小时后,1毫升杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM,生活技术,佩斯利,英国)与10%的边后卫和1% Antibiotic-Antimycotic补充说。72小时后,额外3毫升DMEM补充道。文化随后美联储每周两次直到70%汇合的此时他们收获和传播或低温贮藏如上所述。低温贮藏UCM msc和BM msc同时CHACC用于实验的评估。

2.3。描述通过流式细胞术

下面的抗体被用来表型细胞基于国际社会细胞治疗(ISCT)标准(20.]:CD14-APC-eFluor780(61年克隆d3), CD34-eFluor450(克隆4 h11), CD73-FITC(克隆AD2) CD90-APC(克隆eBio5E10) CD105-PE(克隆SN6) (eBioscience,哈特菲尔德,爱尔兰,英国),CD19-PE-Cy7(:克隆j3 - 119),和CD45-Krome橙(克隆J.33)(贝克曼库尔特、威、英国)。所有抗体都是老鼠同形像IgG1,κ。无污点的细胞被用作控制。控制前进,一边进行散射(FSC和SSC)基于散射配置文件清除残骸和对比。细胞(3×10⁵)100年μl流式细胞仪缓冲区(杜尔贝科的PBS,生活技术;叠氮化钠0.2% BSA和0.05%,Sigma-Aldrich)孵化与预定的冰在黑暗中30分钟滴定的抗体。流式细胞仪的细胞被洗缓冲和resuspended在200年μl流式细胞仪缓冲区进行分析。

染色细胞分析在2小时内使用BD流式细胞仪咏叹调我用流式细胞仪天后6.1.3流式细胞分析仪软件(BD生物科学,牛津大学,英国)。仪器被打开前至少1小时每次运行允许激光热身,和血细胞计数器设置&跟踪珠子(BD生物科学)是用来检查仪器性能。10000细胞事件被记录为每个抗体。电压是清白的样品(21]。FCS文件分析Kaluza 1.2(贝克曼库尔特)和平均荧光强度(MFI)显示在logicle (biexponential)轴22]。转达信息密度的事件,轮廓异常值被选为标准密度呈现情节与情节(23]。

2.4。珊瑚羟基磷灰石/碳酸钙Microscaffolds做准备

CHACC(海南医学院附属医院,海口,中华人民共和国)与研钵和研杵碎,随后筛分300μ紧随其后的是一个200μ米筛捕获只有200 - 300μ米粒子。已筛CHACC然后热压处理过的冲销。10μl完整的瀑样介质(αmem Antibiotic-Antimycotics补充的边后卫为10%和1%),和三个CHACC粒子被放置到每个的寺崎微型板块(他一一Bio-One,斯通豪斯,英国)和孵化24小时37°C下5%的股份有限公司₂在空气中。

2.5。瀑样的形成和分化

每10 3000 msc (P3-5)μl瀑样中被添加到先前准备支架粒子寺崎微型板块产生瀑样。第二天,瀑样被转移到一个100毫米培养皿(费舍尔科学、拉夫堡、英国)和旋风让粒子互相接触,使一个更大的脚手架要创建企业集团。瀑样的对待普通瀑样中(控制)或瀑样中补充了100海里地塞米松,10毫米β甘油磷酸和100μM 2-phosphate-ascorbic酸刺激成骨分化。

2.6。描述通过显微镜和生活/死化验

由brightfield瀑样进行分析和扫描电子显微镜(SEM)。样本分析了1天,7、14、21日在分化。SEM,样本1毫米直径,固定在4%戊二醛(Sigma-Aldrich),然后逐渐通过乙醇脱水系列,使用顺序更高浓度的乙醇(70%,80%,90%,95%,和100%)10分钟。最后,样本进一步脱水50% hexamethyldisilazane (Sigma-Aldrich)用乙醇稀释10分钟,其次是完全沉浸在绝对hexamethyldisilazane,在通风橱,在一夜之间蒸发。控制支架粒子(无电池)也培养7天瀑样介质,在37°C下5%的股份有限公司₂在空气中,在固定和脱水。扫描电镜进行了使用日立s - 4800 II SEM的加速电压在110 x 5000 x 1 kV。样品被安装到SEM存根使用双层涂料碳导电胶带(记述有机物,由费舍尔科学)。

14和21天后细胞生存能力也被评估使用生活/死亡分析工具包(生活技术,佩斯利,英国),细胞被染色和钙黄绿素acetoxymethyl (0.1μg / ml)和propidium碘(1μg / ml)和被荧光显微镜。

2.7。评估分化,免疫细胞化学

在21天分化,瀑样洗在PBS和面向大滴的明亮Cryo-M-Bed嵌入化合物吸附在干冰冷冻。10μ使用徕卡m部分被切CM1900染色和融化的幻灯片上。幻灯片中性缓冲福尔马林固定在10% (Sigma-Aldrich),在PBS permeabilised: 0.1% Triton x - 100 (Sigma-Aldrich)和PBS孵化:0.5%牛血清白蛋白(BSA) (Sigma-Aldrich) 30分钟阻止非特异性结合。瀑样是沾preoptimised老鼠单克隆抗体主要针对Runx2的浓度(3μg / ml)(英国研发系统,阿宾顿)、骨钙素(10μg / ml),或者兔多克隆抗体主要针对I型胶原蛋白(10μg / ml) (Abcam,剑桥,英国)一夜之间在湿润环境+ 4°C。游离抗体主要是被洗涤PBS和幻灯片孵化1小时在黑暗中在室温下与二次NL557-conjugated anti-mouse或NL493-conjugated anti-rabbit抗体(1:200)(研发系统)。幻灯片在PBS洗,沾0.1% 4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI,生活技术)在室温下1分钟。每个样本都是水洗的PBS和使用共焦显微镜成像(蔡司LSM710、从、德国)。负面的(没有初级抗体)和空白(脚手架没有细胞)控制包括在内。

2.8。碱性磷酸酶染色

幻灯片被固定在冰冷的70%乙醇(费舍尔科学)10分钟在PBS切片,洗后,之前沉浸在高山衬底工具包(向量实验室,彼得伯勒、英国)根据制造商的指示。幻灯片是在0.1% DAPI染色(生命技术)在室温下1分钟染细胞核和使用共焦显微镜成像。

2.9。实时聚合酶链反应分析

骨生成的关键标记(Runx2、高山和I型胶原)使用实时PCR进行评估。21天分化,RNA是孤立的细胞使用MasterPure工具包(:,剑桥,英国)根据制造商的指示。总之,300年样本细胞溶解μl的组织和细胞溶菌作用的解决方案在65°C 30分钟。蛋白质沉淀的解决方案使用150μl的蛋白质沉淀试剂。离心后,上清液收集和培养1小时37°C和脱氧核糖核酸酶去除DNA。这个过程被重复。RNA被沉淀使用丙胺和离心收集。1μg反转录成RNA的cDNA使用RETROscript®工具(技术)反应20卷μl。实时PCR反应是在50°C运行2分钟和2分钟95°C,作为一个初始变性步骤,其次是40周期在95°C 15秒变性和60°C 30秒退火使用SsoFast EvaGreen Supermix和2005年MyiQ实时PCR检测系统(英国)赫默尔亨普斯特德镇Bio-Rad实验室。每个基因的扩增包含10μl (SsoFast EvaGreen®, 0.6μ0.6 l正向引物μl反向引物,6.8μl核酸酶的自由水,2μl(稀释cDNA与nuclease-free水(1:10)。其次是熔解曲线分析。循环阈值(CT)感兴趣的每个基因的扩增(表1)对管家基因正常化GAPDH在所有样本,和相对基因表达水平是由2 ^ (GAPDH CT-Test CT)方法。

2.10。统计分析

所有实验至少重复一次,直到一致的结果。非参数测试被用来分析统计数据(Statistica版本6中,StatSoft有限公司,英国。所有数据都表示为平均值±标准错误。

3所示。结果

3.1。描述通过流式细胞术

UCM和BM MSC展示了传统MSC表型(20.]显示积极表达CD73、CD90、CD105和消极的表达式造血的标记CD14、CD19, CD34、CD45(图1)。

3.2。明亮的领域和扫描电镜形态学特征

明亮的字段(图2(图)和SEM图像3)被天1、7、14、21的分化过程,而控制图像在21天没有增加成骨的补充。亮视场图像(图2显示粒子之间的差距太大没有UCM msc(图2(A4),白色箭头),直到21天。相比之下,BM msc(图2(B))观察增殖并迅速占领粒子之间的空间早在第七天,在这个时间点后外观并没有改变。SEM图像(图3)显示,随着时间的推移,瀑样的表面变得平滑由于增加细胞密度和细胞外基质的沉积,它绑定CHACC粒子结合在一起形成一个大的企业集团。使用BM msc(图平滑表面展出3在第14天(B3)),而UCM msc(图3(A4))没有覆盖整个表面,直到一天21。增加成骨的补充没有观察到有任何显著影响瀑样形态与控制图像在21天。

14和21天后细胞生存能力也被评估使用钙黄绿素acetoxymethyl (0.1μg / ml)和propidium碘(1μg / ml)和被荧光显微镜。死细胞几乎没有观察到在CHACC使用UCM或BM msc、证明了细胞生存能力不受CHACC微粒的影响。

3.3。骨生成的特点是免疫细胞化学和碱性磷酸酶染色

UCM和BM msc观察瀑样分化的21天。不包括UCM msc生长在控制αmem为高山没有标签(图4(一),A1), osteogenically诱导和noninduced瀑样阳性高山(图4(一)、A2-A4), Runx2(图4(b)、B1-B4)、I型胶原和骨钙素(图4(c), C1-C4)。高山是活跃在MSC的细胞质。Runx2主要是发现细胞核内的msc和出现紫色由于混合核DAPI染色。I型胶原和骨钙蛋白被发现在细胞外基质表面的瀑样。

高山(图4(一)、A5), Runx2(图4(b)、B5)和I型胶原蛋白(图4(c),通过实时PCR C5)也被评估。Osteogenically诱导BM msc被证明更有高山(图4(一)、A5)和Runx2(图4(b)、B5)比osteogenically信使rna诱导UCM msc、相对于管家基因,GAPDH。然而,控制BM MSC也证明有更多Runx2 mRNA相比UCM MSC。UCM Nonosteogenically诱导msc显示高I型胶原蛋白mRNA和蛋白表达,但低高山和Runx2。

4所示。讨论

新型生物材料对骨再生所需的他们没有缺损的固有缺点(失血、感染和发病率的风险,和有限的供应)。然而,他们需要匹配在自体骨置换手术的黄金标准。CHACC已被证明有良好的属性作为植骨,但它缺乏所需的关键组件:自体活细胞与成骨的能力。

在这项研究中,将UCM和BM msc与CHACC微粒形成瀑样和他们在体外成骨的潜力评估和比较。人类UCM msc被证明能对感冒分化成骨的血统,有着共同的表面标记BM msc (15]。CHACC已经用作骨移植物。因此,它将提供一个三维结构为UCM和BM MSC依恋,增殖,分化。瀑样会导致增加细胞数量与细胞悬液法(24)和羟磷灰石层CHACC应该加速细胞的分化,因此矿化(24- - - - - -26]。

尽管BM和UCM msc能够附加CHACC微粒,形成瀑样,增殖,并分化成骨的血统,正如所料,大英博物馆msc的成骨分化水平高于UCM msc。BM msc显示细胞增殖显著增加,表明他们进入成骨分化的第一阶段(27UCM msc之前)。增加成骨分化BM msc runx2的表达增加,进一步证明了这一点高山和骨钙素的标签在免疫细胞化学(25]。其他研究人员也发现骨髓间充质有优越的成骨的潜力相比BM UCM msc (28]。类似于我们的研究中,施耐德等人发现BM msc I型胶原蛋白表达更多的高山但低于UCM msc (29日]。张等人相比MSC在3 d支架来自不同来源的骨髓间充质形式,发现BM的骨头比UCM MSC (18]。降低成骨的潜在解剖UCM msc也许解释的起源来自。Panepucci等人发现较高的骨相关基因在BM msc与脐带静脉msc (30.]。脐带静脉msc表达基因更多相关矩阵改造通过金属蛋白酶和血管生成。因此,UCM msc可以少致力于骨生成,而是致力于血管生成。

有趣的是,张等人还显示,UCM msc可以区分下成骨的血统比BM msc如果他们在单层培养的18]。基于这项研究,未来的工作首先应该调查区分UCM msc在单层然后种子细胞在三维支架。虽然异位骨形成使用UCM msc被证明是劣质BM msc体内相比,UCM的血管生成性质已被利用来提高骨再生。Todeschi等人表明,UCM msc移植orthotopically造成类似的新骨形成量与BM msc通过招募主持人成骨细胞(31日]。陈等人也利用脐带间充质干细胞的血管生成性质通过coculturing人类脐带静脉内皮细胞。他们发现一个类似的新骨形成量能够达到体内coculturing相比人类脐带静脉内皮细胞与BM msc (32]。

这项研究有一些局限性;免疫细胞化学和实时PCR只有评估窄谱的标记,意思msc可以区分天堂不是特别看了看。此外,定量PCR只给RNA表达的乱射的一天这是提取和很短的半衰期约9小时(33]意义表达水平可能是错过了。细胞附着和增长仅限于通过亮视场和SEM图像任意的定性评估。

未来的工作将克服UCM msc的劣质成骨的能力,如初始化成骨分化在2 d文化阶段,和成骨的基因和蛋白质表达将评估更多的时间点的全谱分化三周期间或更长时间来评估UCM msc的全部潜力。同时,利用UCM的血管生成性质,msc CHACC应该探索。

5。结论

这项研究表明,200 - 300μm CHACC颗粒可以是一个适合人类MSC增殖和分化的载体在体外,注射的目的交付开放CHACC的使用新的应用程序在颌面外科和牙科。此外,UCM msc显示下成骨的能力培养时CHACC瀑样相比BM msc。因此,进一步的研究是需要优化的osteogenicity UCM msc释放他们的潜能作为现成的,访问,和丰富的骨组织工程的组织来源。

数据可用性

斯旺西大学的数据;请求访问应该知道夏博士(z.x(电子邮件保护))。

的利益冲突

所有作者状态,他们没有利益冲突。

确认

作者要感谢新生儿免疫组提供抗体和脐带集合和伊恩Pallister教授和创伤的部门在莫里斯顿医院骨科,斯旺西,骨髓集合。他们感谢大卫博士,博士克里斯•赖特博士山姆·韦伯斯特博士乔主教,和凯蒂•桑顿教授为本研究项目的支持和建议。这个项目是由欧洲区域发展基金(ERDF)、海南(GJXM201101)国际科技合作项目,国家自然科学基金(国家自然科学基金委81260271),Osseo再生技术(英国)有限公司和知识经济能力奖学金(凯斯)。