比较再生组织质量矩阵后细胞植入使用放大软骨细胞相比Synovium-Derived干细胞软骨病变的兔模型

文摘

已知问题的自体软骨细胞移植激励寻找细胞替代。这项研究的目的是为了测试synovium-derived干细胞的潜力(SMSC)使用矩阵再生软骨植入。的骨软骨缺损模型兔股骨内侧髁,胶原膜被播种与culture-expanded外源的软骨细胞或SMSC然后移植到损伤。一个定制的滑膜作为控制。兔子SMSC形成典型的软骨体外。宏观评价缺陷愈合和再生组织的厚度没有透露干预组之间的显著差异。然而,瞬时和剪切模量,反映出的生物力学强度,修复组织,是优越的使用同种异体的软骨细胞移植组( )。这与一个更chondrogenic结构和更高的蛋白聚糖表达,导致较低的OARSI评分( )。修复组织的团体表达了相当大量的胶原类型,二世和x软骨再生矩阵后植入使用同种异体的未分化的干细胞synovium-derived兔子在一个缺陷模型显示类似的宏观结果和胶原蛋白成分相比,放大软骨细胞;然而,生物力学特点和组织学得分低。

1。介绍

关节软骨缺陷往往导致疼痛,损失函数,最后骨关节炎(OA),导致产生重大影响在每个发达国家公共卫生系统,OA目前影响个人(八分之一1]。自体软骨细胞移植是一个细胞治疗,成功被用来治疗大,孤立的,完整的软骨厚度缺陷(2]。一些缺点如需要两个手术和一个重要的施主能级发病率强调需要修改的过程。此外,典型的并发症如肥厚性再生软骨的形成、干扰粘结修复软骨,软骨生物力学阻力的新成立的不足,和分层3]开车寻找替代技术。间充质干细胞(基质),特别是synovium-derived间充质干细胞(SMSC),代表一个有前途的替代细胞来源。这是总结的概要文件表达在细胞表面标志(4,5),表明chondrogenic表型,自然形成软骨的能力尤其是附近的软骨细胞(6]。此外,肥厚性分化的形成相比大大减少明显,由骨髓间充质干细胞(7,8]。

SMSC有高数量和他们的采购并不导致显著的施主能级发病率。SMSC的细胞特征表明他们是否适合软骨再生协议基于chondrogenic表型(5)包括其维护几个细胞培养后形成细胞外基质(段落及其优秀的能力9];然而,应该如何应用于软骨缺陷SMSC达到最佳修复质量需要确定。

这个临床范式后,在目前的研究中,我们假设未分化SCMC可以修复软骨损伤内侧髁的兔子模型全层损伤一样高效的同种异体的culture-expanded软骨细胞。通过使用同种异体的移植方法,研究设计相关临床应用和模仿现成的协议(10]。主要的结果则是生物力学稳定,二级标准修复质量的组织学评估结果。探究的结果表达式的immunohistological评价胶原类型,二世和X,标记为软骨细胞分化和肥大。

2。方法

2.1。细胞的准备

我们跟着Kubosch等的方法。6]。

两只动物牺牲前3个月的实验,膝盖解剖完全移除从胫骨和股骨软骨。同时,膝关节滑液的准备。软骨是切成小块,水洗,并转入DMEM F-12 10% (Lonza BioWhittaker,巴塞尔瑞士),胎牛血清(FCS), 1%青霉素和链霉素(P / S)(表达载体,卡尔斯鲁厄,德国)、庆大霉素0.5%和3%胶原酶CLS II型(Biochrom,柏林,德国)。切碎的软骨组织被酶消化在接下来的16个小时在摇晃孵化器与200 rpm 37°C。随后,软骨细胞释放的离心机,水洗,和播种在扩张中DMEM F-12补充10% FCS,庆大霉素P / S, 1%和0.5%。软骨细胞的扩张是由播种在涂布T-flasks密度为2500 - 5000细胞/厘米²。这些细胞被冻结在达到融合。解冻时细胞种植和使用达到一个日志增长阶段(通道2)。同样,滑膜组织被切割成小块,洗净,并转入DMEM F-12中有10% FCS (Biochrom,柏林,德国),1%青霉素和链霉素(P / S)(表达载体,卡尔斯鲁厄,德国),0.5% (Biochrom,柏林,德国)、庆大霉素和3%胶原酶P(罗氏,曼海姆,德国)。中止消化在接下来的4个小时在摇晃孵化器(200 rpm) 37°C。随后,释放细胞离心,洗,播种在扩张中DMEM F-12 (10% FCS, 1% P / S,庆大霉素0.5%)。SMSC被播种在涂布T-flasks密度2500 - 5000细胞/厘米²为扩张。这些细胞被冻结在达到融合。解冻时细胞种植和使用达到一个日志增长阶段(通道2)。SMSC和软骨细胞都放大,增长同步,在通道2用于动物实验。

2.2。描述的兔子Synovium-Derived间充质干细胞(SMSC)

2.2.1。Chondrogenic分化

兔子SMSC分布在15毫升聚丙烯管使用每500人250000个细胞μl培养基(DMEM高葡萄糖)补充10%的边后卫,青霉素和链霉素1%,10%的(胰岛素、人类转铁蛋白,亚硒酸钠从康宁,纽约,美国),1%丙酮酸钠(美国马热费希尔科学),100 nM地塞米松(Sigma-Aldrich、Brøndby、丹麦),10 ng / ml TGFβ3(美国新泽西州PeproTech), 50μg /毫升维生素C (Sigma-Aldrich)。为了促进聚合形成,细胞被轻轻离心机使用500年为5分钟。Chondrogenic媒体改变了每2 - 3天21天,和细胞培养在37°C和5%的公司₂。

2.2.2。成骨分化

兔子SMSC镀在密度20000细胞/厘米²在标准DMEM(低葡萄糖)媒体和confluency培养,直到他们达到80 - 90%。24小时后,兔子SMSC暴露在成骨的媒体被李et al。11),它包含DMEM葡萄糖(5.5毫米),10%的边后卫,1%,青霉素和链霉素10毫米β甘油磷酸酯(Calbiochem-Merck,达姆施塔特,德国),100 nM地塞米松,50μg / ml维生素C (Sigma-Aldrich)。成骨的媒体改变了每2 - 3天21天,和细胞培养在37°C和5%的公司₂。

(1)碱性磷酸酶(ALP)活性和细胞生存能力。高山活动以天21细胞成骨分化和规范化的可行性。为了评估细胞生存能力,细胞被孵化20μl (CellTiter-Blue试剂(Promega,曼海姆,德国)和100年μl媒体37°C 1 h。1小时后,荧光强度测量(560_前女友/ 590_新兴市场)FluoStarω标(BMG Labtech、Birkerød、丹麦)。随后,这些细胞被洗Tris-buffered盐水和固定的3.7%甲醛和90%乙醇室温30秒。之后,这些细胞被孵化与高山基质,对硝基苯磷酸1毫克/毫升NaHCO 50毫米₃MgCl (pH = 9.6)和1毫米₂在37°C为20分钟。通过添加3 M氢氧化钠反应停止。吸光度测量使用FluoStarω标在405海里。

(2)茜素红染色。为了评估矩阵矿化,经过21天的成骨分化,兔子SMSC与茜素红染色。简而言之,这些细胞被洗的PBS和固定的70% iced-cold乙醇在−1 h 20°C。随后,细胞被洗的H₂O和染色茜素红溶液pH = 4.2(σ)10分钟。染色后,细胞与PBS洗5分钟为了消除游离染料。

2.2.3。脂肪形成的分化

去,兔子SMSC镀在密度30000细胞/厘米²在标准DMEM(低葡萄糖)媒体和培养,直到confluency细胞达到100%。随后,媒体取而代之的是脂肪形成的媒体改编自李et al。11],它包含DMEM(25毫米的葡萄糖),10%的边后卫,青霉素和链霉素,500年的1%μM IBMX (3-isobutyl-1-methylxanthine, Gibco、Herlev、丹麦),1μ地塞米松,200μM吲哚美辛,10μg / ml胰岛素(σ,Brøndby,丹麦)。脂肪形成的媒体改变了每2 - 3天21天,和细胞培养在37°C和5%的公司₂。

(1)油红O染色。经过21天的脂肪形成的差异化,兔子SMSC沾油红O为了评估脂肪细胞的形成。简而言之,这些细胞被洗的PBS和固定的4%多聚甲醛在室温下10分钟。随后,这些细胞被3%异丙醇清洗和孵化与25 mg油红O(σ)在5毫升的60%异丙醇和3.35毫升H₂O为1 h。

2.3。RNA分离和定量PCR

细胞总RNA分离使用试剂盒®试剂(表达载体、Tastrup、丹麦)根据制造商的协议。经过21天的分化,样本中分离试剂盒使用gentleMACS分离器(Miltenyi研究,隆德,瑞典)。互补脱氧核糖核酸形成于1μ使用RevertAid H - g总RNA的合成第一链cDNA工具包(美国马热科学)。引物设计使用Primer-BLAST软件。引物序列表中描述1(补充数据在这里)。实时PCR进行StepOnePlus实时PCR系统(应用生物系统公司)使用快速SYBR®绿色混合(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。每个样本都是运行在一式三份。使用ΔCt方法计算的结果。给出的数据是2−ΔΔCt, 0和天之间的相对表达改变21。

2.4。认证

动物保护区域董事会批准决定从2013年3月9日的实验用额外的修改在8月21日和2015年9月11日(G-13/75)。

2.5。麻醉

兔子接受氯胺酮(35毫克/公斤)结合medetomidine肌内注射(0.25毫克/公斤)。在手术期间,林格氏溶液(10 ml / kg / h)是通过静脉注射进入边际耳静脉。与0.5 - -2%异氟烷麻醉是补充(双与自然通风面罩,FiO₂> 0.4)。心率和血氧饱和度监测。手术前和后3天,兔子收到carprofen,非甾体类抗炎药物(4毫克/公斤南卡罗来纳州。)作为止痛剂和上边(enrofloxacin) 2.5%(0.4毫升/公斤)作为一种抗生素。

2.6。操作

女性得到了新西兰白兔从查尔斯河(Sulzfeld,德国)。动物们保持应用特定的无菌条件和控制室温。适应环境持续了14天。动物被关在笼子里的无限制的水和食物供应和一个典型的日夜节律。操作的时候,动物们已经达到大约3.5到4.2公斤的体重和生长板关闭。剃须和消毒后,膝关节都由中央打开皮肤切割和内侧parapatellar关节切开术。在这之后,髌骨外侧流离失所。以后,霍法脂肪垫与滑膜部分切除,和全层软骨病变是准备在中央股骨内侧髁使用钻一个直径3.5毫米,停在2毫米深度。关注在一个精确的垂直钻井方向角。考虑平均软骨(图0.5毫米的高度1(一)),软骨下骨板被打开了。对照组的缺陷是滑膜覆盖皮瓣,匹配准备病变大小和固定的压缩和纤维蛋白胶(巴克斯特,Unterschleißheim,德国)。治疗组的细胞,匹配襟翼的双层I / III型胶原支架(Wolhusen Chondro-Gide Geistlich,制药公司,瑞士)准备,被动地播种与细胞(多孔,400000细胞/缺陷;15分钟粘附时间)和固定所述滑膜皮瓣。细胞悬液接种的40000000细胞/准备和10毫升μl了定制的支架。移植固定后,髌骨重新安置和联合,后跟一个视觉控制正确的移植位置。分开以后,关节切开术和皮肤缝合。伤口是密封使用铝喷。

我们比较4组(滑膜皮瓣,参与的软骨,软骨细胞移植的放大,或SMSC),包括每组6的膝盖(12只兔子)。膝盖被随机分配到每个小组通过使用一个随机数生成器。动物牺牲了6周后,膝盖移植和第一生物力学测试。在这之后,标本组织学分析。在一个试点研究比较胶原支架的植入和没有软骨细胞,显著差异被发现后3、6、12、24周(Oliver Huwert未发表的数据)。的差异,然而,拒绝从7到5.4点规模总结,评估宏观和组织学评分(补充图1)。这可能是由于软骨缺陷兔子的自然修复能力,迫使集中在六周时间点。

2.7。临床评估的兔子

兔子动员自己断奶后立即全力轴承。他们没有临床症状的疼痛。他们仔细观察了一个星期,直到伤口愈合和没有感染的迹象。兔子不跛行超过2 - 3天很快就正常,特有的移动模式。

2.8。生物力学评价

定义力学参数,多轴测试单元1马赫的模型V500css (Biomomentum,蒙特利尔,加拿大)自动正常校准和缩进映射由霍尼韦尔国防部multiple-axis负载细胞。34(美国新泽西州霍尼韦尔),纽波特运动控制器ESP 301(新港、欧文、美国),和一个硬度计压头1毫米直径的球面几何学。生物力学的调查,10个不同位置的样本检测。位置选择1马赫的映射模块的软件(Biomomentum,蒙特利尔)。五位置选择的健康部分样本(左髁在补充图4),和五个位置被选上的缺陷部分样本(补充图4上髁)。为了避免脱水的软骨在测量期间,多次被滋润的示例磷酸盐(PBS)。

2.8.1发布。自动缩进映射

自动缩进的映射,以下参数被设置在1马赫的运动:z联络0.5毫米/秒,速度联系标准0.1015 N, 0.5毫米的扫描网格。缩进振幅将0.2毫米和缩进速度0.2毫米/秒。弛豫时间是5 s。

2.8.2。厚度自动映射

厚度与针映射技术(12)代替球形压头27 g×3/4“皮内注射针(b·布劳恩,Melsungen,德国)。下面的参数输入到软件:1马赫的运动阶段0.5 mm / s的速度;联系的标准4 N和阶段2 x负载的重新定位解决。针的机械测试人员直接垂直向样本以恒定速度直到软骨表面渗透和针停在软骨下骨边缘。

2.8.3。数据处理

研究结果分析了使用软件版本1马赫的分析4.1.0.17 (Biomomentum,蒙特利尔)和起源9.1专业(起源实验室,北安普顿,美国)。所使用的评价方法是根据Sim et al。13]。使用自动厚度映射的结果,软骨厚度计算在每个位置的区别表面的垂直位置(负载开始增加)骨和软骨的位置/接口(对应于第一个拐点的位移/力曲线)(见补充图4 b)。瞬时弹性模量(IM或即时或杨氏模量)在每个位置拟合得到的荷载位移曲线与相应的厚度和有效泊松比(0.5)为缩进一个弹性模型(14)(请参见下面的方程)。 与P=负载,H=压痕深度,一个=接触区半径,ν=泊松比k=校正因子依赖一个/h和ν。

剪切模量(G)计算如下:

一个示例提供了一个典型的应变弛豫曲线(图4 c)的补充材料。

2.9。组织学

生物力学测试后,标本缓冲福尔马林固定在4%。薄片技术促进了准备的幻灯片。纵向切片标本与ethylene-diamine-tetra-acetic酸、脱钙与乙醇脱水,脱脂和二甲苯代替(Histoclear®),然后嵌入石蜡。进行了部分使用旋转式切片机(HM 340 e、Microm热费希尔科学Inc .,沃尔瑟姆,妈,美国)。他们染上hematoxylin-eosin和Safranin-O。部分的图像分析是利用光学显微镜(KS300,卡尔蔡司有限公司,从德国)与图像分析单位(从Axioplan,卡尔蔡司视觉有限公司,德国)。代表幻灯片被两个不同的考官,盲目地选择和评估确定OARSI分数(15]。平均值和中位数计算,用于统计组比较。

2.10。免疫组织学

胶原蛋白I型、II型和X型免疫组织化学,部分被孵化30分钟5%正常山羊血清,其后孵化1:50单克隆鼠标anticollagen I型抗体(MAB3391,克隆5 d8-g9 Chemicon, Hofheim,德国),1:50单克隆鼠标anticollagen II型抗体(MAB8887,克隆6 b3, Chemicon),或1:500单克隆鼠标anticollagen类型X抗体(克隆COL-10 C7974,σ,Taufkirchen,德国)2 h,三个与PBS洗涤剂,和孵化biotin-labelled山羊antimouse免疫球蛋白为30分钟(阿克利,Herford,德国)。之后,部分被孵化与亲和素30分钟和3-amino-9-ethylcarbazole (AEC)的基质10分钟。代表选择幻灯片,盲法,评价两种不同的考官,确定Remmele-Stegner分数(16)和比较积极的和消极的污渍。平均值和中位数计算,用于统计组比较。

2.11。统计数据

所有的值被表示为平均值±标准错误的意思。关于分数和所有数值(如果 ),统计显著性测试主要使用Mann-Whitney nonparametricallyU测试。使用事后多重比较计算与Kruskall-Wallis统计H测试。概率分布的样本n≥5 Kolmogorov-Smirnov试验进行了分析。正态分布样本然后比较使用t以及,否则样本nonparametrically相比表示。被定义为统计意义 。

3所示。结果

3.1。细胞特性

兔子滑膜间充质干细胞(SMSC)容易分化成软骨细胞在3周后颗粒文化。阿尔新蓝染色颗粒粘多糖的数据所示2(一个)和2 (b)。观察软骨的类似的染色模式Safranin-O(数字2 (d)和2 (e))。细胞表现出部分呈表型。Chondrogenic分化能力大幅下降后进一步通过细胞(数字2 (c)和2 (f))。

此外,定量rt - pcr显示超表达的软骨mRNA在SMSC软骨细胞分化的标志。见数据2 (g)- - - - - -2(我)、胶原蛋白II型(col2) Aggrecan(能),和Sox9 mRNA明显诱导,这是观察在p3和p4细胞。然而,响应较低相比,p4 p3细胞。

成骨分化SMSC体现了典型的形态学改变(补充图2 a和2 b)。茜素红染色可视化矿化细胞外基质的形成。然而,茜素红染色强度和缺乏碱性磷酸酶表达表明成骨细胞的分化能力有限(补充图2 c和e)。定量rt - pcr分析证实了这一发现,略微增加胶原蛋白I型(col1)和骨钙素(OCN)的mRNA表达后21天(补充图2 d)。类似于脂肪细胞的分化,通道4细胞成骨细胞的分化能力非常有限。

兔子SMSC也能够在脂肪细胞分化,证明了一个油红O染色(补充图3和图3 b)。脂肪细胞的分化与积累的小脂滴和脂肪形成的基因的诱导,如PPARG(过氧物酶体proliferator-activated受体γ)和一个(脂联素)(补充图3 c)。连同增殖率下降,p4几乎失去脂肪形成的细胞分化能力(数据未显示)。

3.2。总评价

宏观的评价程度的恢复使用“拥有”的得分缺陷填充(17]显示成功治疗内侧髁病变达到值低于3不等。我们没有观察干预组之间的差异(表1)。对照组不干预的所有膝盖自然没有软骨损伤(“拥有”的得分= 0)。结果并不是单独报道,因为没有愈合面积或病变。此外,表面的百分比包含修复病变组织与邻近的天然软骨被评价为“治疗领域。“大部分表面被修复组织,但我们没有发现差异组评估6周postinjury(表1)。

宏观的愈合程度的评估使用icr评分和治疗的面积没有显示6周后两组之间的差异。每个组在统计学上相比其他组;结果表明n。(不重要)。

3.3。生物力学评价

3.3.1。厚度

软骨的厚度的参考的股骨内侧髁为0.50±0.12毫米。没有统计上显著的差异获得的软骨厚度的干预组:1.47±0.20毫米的滑膜组织,移植SMSC 1.35±0.36毫米,1.17±0.44毫米放大软骨细胞移植(图1(一))。之间的比较的控制和每个滑膜组织或SMSC组显示显著统计学差异( );然而,软骨细胞的直接统计对比和对照组未能达到意义( )。

3.3.2。瞬时或即时模数(IM)

瞬时或即时模量描述抗机械应力的软骨与骨关节炎的变化(13]。正常软骨预计高IM值,关联的即时模数的对照组中最高达到4.69±0.68 MPa。没有统计上显著的差异组用一块移植滑膜(1.48±0.20 MPa)和移植SMSC (1.35±0.358 MPa, )。然而,两组有一个即时模量低于对照组( )和组软骨细胞移植扩增技术(2.42±0.66 MPa, )。尽管数值低,软骨细胞的即时模组没有明显不同于对照组没有缺陷( ,图2 (b))。

3.4。剪切模量

胶原蛋白含量影响剪切模量,它描述了材料的剪切应力和软骨健康测量提供了一种功能(18]。这一分析的模式类似于即时模量。对照组的剪切模量最高的达到14.09±2.05 MPa。之间没有统计上的显著差异组用一块移植的滑膜(2.06±0.63 MPa)和移植SMSC (1.90±1.16, )。然而,两组有一个即时模量低于对照组( )和组软骨细胞移植扩增技术(7.27±1.97 MPa, )。尽管数值低,软骨细胞的即时模组没有统计学上显著不同于对照组无损伤( ,图2 (c))。

3.5。组织学评价

对于定性再生组织的组织学评估,标本是由他和Safranin-O染色(图3(一个))。污渍准备确认统一的缺陷和缺陷填充以及粘多糖的表达。的焊接缺陷边缘有部分干预组的高质量的独立。略锥形形状缺陷,相应的演习,这是用于缺陷的准备。没有迹象的免疫反应对植入材料证明由巨噬细胞的缺失或巨细胞。

OARSI分数来获得定量比较。所有的软骨领域没有骨关节炎的迹象(OARSI得分= 0),这是明显好于所有干预组的分数。分数最低的是观察与放大处理后软骨细胞达到4.88±1.43点,比8.11±3.84分( )滑膜组织和8.71±4.19分( 处理放大SMSC)的缺陷。只有与滑膜组织达到统计显著性水平(图3 (b))。

3.6。免疫组织学

胶原蛋白的定量评价类型I, II,和X表达式使用Remmele-Stegner得分后没有显示干预组之间的差异(表4 - 6周2),但是所有的胶原蛋白类型表达在不同类型的原始或再生软骨组织。

胶原蛋白类型的评价我,二世和X表达式使用Remmele-Stegner量化分数没有显示6周后两组之间的差异。每组在统计学上每个检查胶原蛋白相比其他组(n .(不重要)。

染色质量的水平和强度都比较胶原蛋白类型I和II和较低的X型胶原干预组。图4显示了胶原蛋白类型代表幻灯片我(a),二世(b), X (c),比较特定抗体的染色与他们同形像控制。

4所示。讨论

本研究的主要发现是,兔子synovium-derived基质间充质干细胞(SMSC)可以分化成脂肪形成的,成骨,chondrogenic血统体外;然而,SMSC形成软骨才是最合适的。未分化SMSC有资格获得矩阵植入兔子在缺陷模型;然而,获得生物力学稳定的再生软骨及其质量评估验证组织学骨关节炎评分,是小相比,目前的标准协议利用放大软骨细胞。

大量研究强调了chondrogenic SMSC的表型5,6对自然[],它表明一个非凡的适用性19和手术诱导软骨修复的目的10,20.]。这是发现在病理过程中,支持显示滑膜软骨形成导致滑膜chondromatosis [21]。直接比较不同来源的间充质干细胞指出显著差异和软骨的形成(SMSC的优越性22]。这些数据符合我们的研究结果,证明形成高质量的软骨粘多糖和胶原蛋白II型的表达用兔子SMSC。相比之下,这些细胞的脂肪形成的和成骨分化能力是有限的。李等人描述了类似的发现和增补,某些表面标记物的表达,比如CD29 CD90、人类的间充质干细胞和兔子之间的不同来源,他们根据他们的表型11]。尽管如此,不同的体内模型展示了类似的功能和成功对于兔子SMSC应用程序(10,11]。除此之外,这些细胞支持成功的软骨再生动物模型的其他物种20.,23),在临床应用在人类身上。SMSC成功例如用于arthroscopically协助软骨修复导致改善MRI特征,组织学和临床结果24]。然而,这项研究只包括10个病人没有标准化的随访和对照组。证明一个注入SMSC是无效的,但是每周注射在大鼠chondroprotective有膝盖效果显著,大关等人指出,应用程序具有决定性影响的方法治疗程度(25]。贝聿铭等人证明了成功的使用SMSC播种到非织造聚乙醇酸网结合合成骨替代修复兔膝关节骨软骨缺陷(10]。然而,第一次治疗的细胞植入前孵化器1月使用生长因子的鸡尾酒。此后,植入物的生化、生物力学和组织学检查的特点,表明植入前成熟提高了构造。提出的设计的基础研究为临床应用是易于使用的协议的必要性。因此,这个过程是一样的标准协议的自体软骨细胞移植,SMSC的软骨细胞代替。否则,对于通过细胞有相同的起始条件,起源相同的兔子,同种异体的移植和生存能力。软骨细胞,目前“黄金标准”,同时控制。非常有前途的体外数据的基础上我们自己的实验和结果发布的其他团体对他们chondrogenic predifferentiation,我们将看到类似的结果,当体外predifferentiation,由所有其他群体,迄今为止应用是省略了10]。这种方法应该避免预制结构的另一个特征问题,足够的边界整合的失败所观察到的不借et al。26]。一个成功的测试这个过程也是先决条件可能一步协议,真正将提高该方法的观点。然而,未分化SMSC未能显示软骨细胞一样的软骨修复的效率。虽然再生组织缺陷的高度大于,在干预组与天然软骨相比,生物力学应力阻力较低。因为准备的缺陷是2毫米,因此比天然软骨高度,这之间的区别是明显的和类似的干预组。再生组织的测量高度与缺陷深度,间接证实了统一配置的病变。总评价和干预组再生高度不同,这直接导致的结论是,实际的相关参数,再生组织的质量评价是瞬时和剪切模量,反映了生物力学应力阻力。同样,这是所描述的分析使用scaffold-free组织工程结构利用SMSC [27),表现出抗压性能类似于软骨受伤。然而,在这项研究中,结构缺乏成熟的软骨,典型的带状配置有劣质表面刚度和保水能力。缺乏定向分化环境可能造成这个问题。因此,生物力学可能明显改善当SMSC在支架结合生长因子,诱导chondrogenic TGF等分化β。

胶原蛋白类型I, II, X描述纤维软骨和软骨细胞去分化,典型的透明软骨,软骨肥大,分别为(28]。虽然所有胶原蛋白类型表示干预组之间没有显著差异,被发现的差异比较胶原蛋白类型的水平。而染色的数量和质量的胶原蛋白类型I和II等于对方,X型胶原表达的水平。这是一个典型的模式对早期软骨修复(29日),特别是再生与部分纤维软骨的形成有关。

可能的解释为有效减少软骨缺损愈合所使用的原始滑膜细胞的分化能力。解剖条件造成的兔子,非常小的尺寸,很难分离滑膜和周围组织的其他部分如霍法脂肪垫。,其他类型的间充质干细胞来源于脂肪组织或CD44 + CD34−外膜nonendothelial祖细胞可能是混合在植入干细胞数量和影响结果cartilage-forming能力(30.]。细胞也没有标记为以后跟踪目的。此外,报告结果只反映短期结果。6周可能只是没有足够长的时间来允许chondrogenic体内分化和足够的软骨形成。然而,体外研究使用transwell coculture已经表明,7天后,SMSC会分化成软骨细胞形成典型的chondron-like结构没有应用生物力学刺激(6]。此外,生物力学刺激预计将显著支持软骨形成(31日]。

有几种可能性提高SMSC移植后的结果。首先,细胞可以在放大阶段predifferentiated如图所示(前10]。然而,这种植入前制备过程复杂,因此生产过程的挑战。此外,可以使用不同的支架,提供生物力学特征或/和增长factor-releasing机制,支持自发chondrogenic分化(32]。这项研究并没有解决时间的影响,这可能会导致进一步成熟的再生组织的影响下自然环境。此外,其他组SMSC测试注入技术,显示成功治疗骨关节炎或软骨病变(20.,25,33]。然而,这种方法的作用机理仍不确定,因为目前还不清楚这些细胞在病变以及丰富的细胞行为。

5。结论

Synovium-derived干细胞(SMSC)演示了一个高chondrogenic潜在的体外。当用于矩阵植入在兔子缺陷模型,未分化SMSC显示宏观和immunohistological修复结果与当前标准利用放大软骨细胞。然而,抗生物力学和组织学得分低。考虑到大型潜在的证据SMSC软骨再生,应该继续寻找替代协议和条件。此外,研究表明,外源的植入是可能的软骨细胞和间充质干细胞,提供一个重要的简化矩阵细胞植入。

信息披露

早期版本的工作提出了海报在ECM会议摘要2017。

的利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

作者的贡献

哈根Schmal负责这项研究的概念和设计,导致了数据的分析和解释,是通讯作者,获得资金,进行了手术,协调不同的研究小组的协作,并负责撰写的手稿和获得最终批准提交的文章。Justyna m . Kowal负责体外表征SMSC qPCR和组织学等支持的解释结果,导致的概念研究,通过本文的最终版本。议长奥卡卡塞姆负责协调细胞实验室的工作,支持和写作本文的解释结果,导致研究的概念,通过本文的最终版本。支持迈克尔•Seidenstuecker负责生物力学测试结果的解释和写作这篇文章,导致研究的概念,通过本文的最终版本。Anke伯恩斯坦是参与概念,支持动物实验,协调有关生物力学测试和组织学实验室工作,支持这个与她的专业知识有重要的输入数据的解释,通过本文的最终版本。凯瑟琳Bottiger监督动物实验,并负责麻醉学和安置的兔子,导致了研究的概念,支持组织学和生物力学分析的样品制备和批准的最终版本。Tanshiyue熊进行免疫组织学,支持样品制备,通过本文的最终版本。伊娃j . Kubosch贡献果断地采取行动,本研究的构思和设计,数据的分析和解释,获得资金,负责当地协调,参与操作,支持组织学和生物力学分析的样品制备,起草部分的文章,修改后的文章,最后批准提交的文章。

确认

支持的研究资助德国分部的AOTrauma(2015)和弗莱堡大学医学院的研究委员会(1072/15)。开放基金提供的出版成本南丹麦大学的欧登塞。

补充材料

补充表1:使用的引物序列。补充图4 a-4c:更详细描述的生物力学分析。补充图2:兔子SMSC的成骨分化。补充图3:脂肪形成的差异化的兔子SMSC的描述。(补充材料)

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