比较分析人类脂肪间充质干细胞从轨道和腹部脂肪

文摘

脂肪组织中含有丰富的多功能间充质干细胞具有较强的增殖和分化潜能进入脂肪细胞,骨细胞和软骨细胞。然而,脂肪间充质干细胞(对asc)显示变量特征基于tissue-harvesting网站。本研究旨在比较人类脂肪间充质干细胞的轨道(轨道对asc)和腹部(对asc腹部)。轨道对asc和腹部被孤立在一个上或下睑成形术操作和抽脂,分别。流仪结果做了分析对asc的表面抗原,测量和细胞因子配置文件使用Luminex化验设备。对asc的multilineage潜力都是调查使用油红O,茜素红,阿尔新染色。逆转录酶聚合酶链反应(rt - pcr)进行测量这些trilineage mRNA水平的基因分型。我们的研究结果表明,这两种类型的对asc表示通常表达干细胞的细胞表面标记;然而,orbital-ASCs显示更高的CD73表达式,对asc CD90、CD105, CD146腹部。不太可能,orbital-ASC表达CD31、CD45和比abdominal-ASCs HLA-DR较小。 Orbital ASCs secreted higher concentrations of eotaxin, fractalkine, IP-10, GRO, MCP-1, IL-6, IL-8, and RANTES but lower MIP-1α比abdominal-ASCs FGF-2, VEGF浓度。我们的结果表明,对asc轨道高潜力对脂肪形成的和成骨分化但低软骨形成的趋势相比,对asc腹部。总之,tissue-harvesting网站是一个强大的行列式脂肪间充质干细胞的特性。理解定义表型的细胞有助于做出合适的选择在不同的再生的临床适应症。

1。介绍

间充质干细胞(msc)是广泛应用于再生医学治疗组织损伤由于一些病理疾病或创伤(1)和来自不同的组织如骨髓、脂肪组织(2)、皮肤(3],肌肉[4),和肌腱2]。然而,这些msc对再生医学的临床适用性必须满足以下条件,如数量丰富,微创,multilineage分化,安全,有效的移植和制造依照现行良好生产规范(GMP)指南5]。骨髓干细胞的最佳来源,但脂肪间充质干细胞(对asc)可以替代来源在临床领域,既显示类似的关于形态学特征,增殖,多能——和一些特定的标记6,7]。

脂肪组织等各种方法很容易被孤立的眼睑,提肛肌切除,并从许多网站剖腹手术数量充足,如腹部、乳房、臀部、大腿轨道,(8]。因此,对asc是更合适的资源再生医学应用由于其丰富和简单的可访问性9,10]。从不同组织对asc网站表现出不同的特征;例如,特征的细胞分离皮下脂肪组织和腹部是不同的11]。具体来说,从皮下脂肪组织基质细胞增殖速度比那些从腹部;但是,没有区域差异在分化的细胞被发现12],ASC发现更高的频率比大腿,腹部或臀部区域(13]。同时,组织从臀部产生更多的基质细胞分离相比孤立从腹部14]。对asc脂肪形成的中胚层起源和经历几个血统,成骨,chondrogenic,肌原性的、心原性的,神经源性分化15]。大多数脂肪组织中胚层起源,但脂肪组织眼睑的外胚层的起源作为神经嵴细胞,如面部肌肉和软骨(16),也可以分化为中胚层的血统(17]。已报告对asc源自于眼睑神经嵴的有类似的特征。(18]。

本研究的目的是描述和比较人类对asc孤立形成轨道和腹部组织并比较他们在multilineage分化能力。

2。材料和方法

2.1。主题

研究参与者10 35 - 55岁的健康男性,包括两种类型的组织,轨道和腹部从同一个人。组织被孤立在临床研究机构审查委员会批准。

2.2。隔离轨道和腹部脂肪干细胞

后对asc轨道对asc和腹部被孤立在前面描述的协议研究与少量修改19]。短暂,轨道获得脂肪组织在一个上或下睑成形术操作在抽脂术和腹部脂肪组织。的脂肪珍珠microdissected和洗在磷酸缓冲溶液(PBS;Welgene、大邱、韩国)去除红细胞和microdissected消化0.25%的I型胶原酶II型(Gibco生命技术、圣保罗、SP、巴西)在37°C下60分钟常数摇晃(20.]。后上层清液,细胞悬浮培养完成增长媒体包含杜尔贝科的修改鹰介质DMEM / F12 (Gibco;大岛屿,美国纽约)10%胎牛血清(的边后卫)(Gibco;大岛屿,美国纽约)和1% penicillin-streptomycin解决方案(P / S) (Gibco;大岛屿,美国纽约)5%的股份有限公司₂和37°C。细胞通过当他们到达20 - 90%融合与媒体改变2-3-day区间。

2.3。流式细胞术

细胞通道3 (p3)分离利用trypsin-EDTA 0.2%(美国Gibco,卡尔斯巴德,CA),固定与甲醇为10分钟−20°C,用1% BSA在PBS,洗净,然后用透化作用缓冲孵化:0.1% Triton x - 100和1% BSA在PBS 10分钟在4°C。细胞培养与抗体对CD31长大,CD34 CD45, CD73, CD90、CD105, CD146, HLA-DR(美国圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX)在冰上30分钟。细胞颗粒状、清洗和固定在1%多聚甲醛。Fluorescence-activated细胞进行排序(流式细胞仪)分析BD生物科学FacsCalibur流式细胞分析仪(美国加利福尼亚州圣何塞,正欲)使用FlowJo软件进行分析。

2.4。多路复用浮在表面的细胞因子测定(Luminex)

我们量化分泌各种细胞因子和生长因子浓度对asc从两种类型的利用Luminex多元分析工具包(美国Billerica的微孔,MA)根据制造商的指示。这个分析工具测量蛋白质浓度的趋化因子:eotaxin, fractalkine,移行细胞诱导protein-10 (IP-10)、单核细胞炎症蛋白(MCP) 1,巨噬细胞抑制蛋白(MIP) 1α,咆哮;促炎细胞因子:粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm - csf)、白介素- 1 (IL)β、2、il - 12 (p40 / p70), il - 6, IL-7,引发,IL-15 IL-17、组织坏死因子——(肿瘤坏死因子)α和干扰素(IFN)γ;抗炎细胞因子:IL-1RA, il - 4、IL-5 IL-13和干扰素- il - 10α;和生长因子:血管内皮生长因子(VEGF)、黑素瘤增长刺激活动(GRO)、表皮生长因子(EGF)、纤维母细胞生长因子(FGF) 2,和血小板源生长因子(PDGF-AA和PDGF-BB)。

2.5。脂肪形成的分化和油红O染色

轨道对asc和腹部与脂肪形成的培养介质包含30μ吲哚美辛,5μ2-isobutyl-1-methylxanthine M胰岛素,0.5毫米,1μM地塞米松(Sigma-Aldrich;圣路易斯,密苏里州,美国)。每2 - 3天中被改变。在21天的分化,细胞与中性10%福尔马林固定1小时30分钟和沾油红O解决方案。定量的脂质空泡,细胞与200年提取μl 100%的异丙醇(默克公司,达姆施塔特,德国)15分钟,和吸光度测量使用VersaMax™+罗v1.23 ELISA板读者(分子设备®,桑尼维尔CA)在540纳米21]。

2.6。成骨分化和茜素红染色

轨道与融合性的增长对asc和腹部在无血清培养干细胞成骨分化工具包(生命技术)。细胞培养与完整的生长培养基(控制)或诱导培养基为21天,媒介是改变每2 - 3天。细胞染色茜素红S染色(Sigma-Aldrich;圣路易斯,密苏里州,美国),和矿化骨测量定量后,制造商的指示。总之,细胞被孵化以10%醋酸在RT为30分钟,刮,转移到新管(1.5毫升),紧随其后的是加热10分钟在85°C,然后冷却在冰。清除碎片的离心后,上清液被转移到一个新的管,归一化10%氢氧化铵的解决方案,和吸光度测量在405海里22]。

2.7。Chondrogenic分化和阿尔新蓝染色

轨道对asc和腹部有80% confluency在chondrogenic分化培养工具(技术),介质是改变每2 - 3天。3周后,细胞被沾染了阿尔新蓝染色(σ)根据制造商的协议。定量测定,染色细胞提取6 M盐酸胍2 h RT和吸光度测量650海里(23]。

2.8。定量实时聚合酶链反应(qPCR)

总RNA提取轨道使用试剂盒RNA分离试剂对asc和腹部,根据制造商的指示。RNA与NanoDrop量化1000(热费希尔,沃尔瑟姆,妈,美国)。我们使用1μg互补脱氧核糖核酸合成的RNA amfiSure Taq DNA聚合酶(美国GenDEPOT)。我们使用赛博qPCR执行绿色PCR反应混合液(美国Bio-Rad) CFX96实时PCR检测系统(Bio-Rad)。引物用于qPCR表中列出1。实时PCR反应测定一式三份和初始激活在95°C 2分钟,其次是40周期:95°C的30秒,30秒60°C, 72°C,持续20秒。的周期数字放大基因的数量达到一个固定的阈值,阈值周期(Ct)决定。相对基因表达被规范计算的差异基因的兴趣周期阈值(δCt)与内源性的三角洲Ct值控制,18 s核糖体RNA(18 s rRNA)。

2.9。统计数据

结果表示为±SEM手段和分析使用GraphPad棱镜软件(版本5.0,GraphPad软件,圣地亚哥,加利福尼亚州)。双尾未配对的学生以及用于分析正态分布数据,和Mann-Whitney测试被用于分析非参数数据。统计学意义是接受值< 0.05。

3所示。结果

3.1。表型特征的轨道对asc和腹部

流仪分析结果,对asc轨道CD31表达,CD45, HLA-DR表达式93.64,94.19,分别对asc和94.40%低于腹部。然而,两种类型的对asc表达显著低比例的CD34表达的干细胞的特征。干细胞的典型标记,如CD90、CD73, CD105, CD146,对asc在两种类型的显著提高;然而,对asc轨道显示这些表达式高于腹部对asc 3.93, 20.73, 13.61,分别为和18.35%(图1(一))。

3.2。轨道对asc和腹部变量分泌的细胞因子水平

定量趋化因子分析表明,轨道对asc显示更高浓度的趋化因子,如eotaxin fractalkine, IP-10, MCP-1,咆哮,分别由30.6,66.2,57.8,83.3%,但低浓度的MIP-1α对asc 96%相比,腹部。促炎细胞因子之一,对asc轨道分泌干扰素-的浓度更高γIL-5, il - 6,引发腹部对asc 11.5, 42.4和73.8%,分别,而其他促炎的蛋白质,如肿瘤坏死因子-α,il - 1β、2、il - 12 (p40 / p70)和IL-17,没有对asc在两种类型的发现。此外,考虑到抗炎细胞因子,这两种类型的浓度对asc表示IL-5相似但没有提到的其他细胞因子被发现在任何上层清液。此外,轨道对asc分泌对asc EGF浓度14.3%高于腹部但FGF-2和VEGF降低了47.5和79.2%,分别。其他生长因子,如PDGF-AB IGF1,没有检测到上层的说明他们的浓度低于相应的化验检测极限。

3.3。比较对asc轨道和腹部的脂肪形成的分化

轨道对asc和腹部与脂肪形成的诱导培养基21天检查相比,脂滴在脂肪生成和noninduced细胞或控制(细胞种植在完成生长媒体)。油红O染色结果显示橙色对asc脂滴在轨道高相比,对asc腹部(数字2(一个)和2 (b))。此外,qPCR分析表明,mRNA的表达基因在脂肪生成,如PPARγ,E / EBPα,FABP4在轨道对asc,高于腹部对asc的57.9,61.1,分别为和94.2%(图2 (c))。

3.4。比较对asc成骨分化的轨道和腹部

轨道对asc和腹部受到成骨的媒介文化的21天。我们的结果表明,这两种类型的对asc显示阳性染色茜素红染色成骨的介质(诱导)相比,完成生长介质(控制)(图3(一个))。茜素红的提取显示的量化结果的钙晶体沉积在轨道对asc 4.9%明显高于腹部对asc在成骨培养基培养(图3 (b))。此外,阐明基因参与骨生成,qPCR进行分析。我们的结果表明,轨道对asc显示显著高表达BMP244.1%,SP747.2%对asc比腹部(图3 (c))。

3.5。比较对asc Chondrogenic分化的轨道和腹部

对asc chondrogenic感应21天之后,与阿尔新蓝染色剂染色并与noninduced细胞。对asc诱导chondrogenic介质显示聚合的细胞和细胞外基质增加生产由蓝色彩色正面阿尔新蓝染色,如(图所示4(一)和4 (b))。此外,以确定是否对asc接受软骨形成,基因的mRNA表达参与软骨形成被qPCR评估分析。我们的研究结果表明,对asc腹部明显高表达Col1A,能,袜9 mRNA水平比轨道对asc 67.1, 90.2,分别为和93.3%(图4 (c))。因此,我们的结果表明,轨道对asc相比不太有力chondrogenic分化对asc腹部。

4所示。讨论

本研究旨在比较特性改变和分化能力之间的脂肪间充质干细胞(对asc)和轨道和腹部组织。将轨道对asc和腹部不自然分离,但可以通过胶原酶消化收获然后扩大在体外,他们显示不同的特征的细胞因子和表面抗原的表达谱。我们的研究首次展示了轨道对asc和腹部之间的表型特征及其trilineage分化的趋势。

对asc来自任何网站应该表达间充质干细胞(MSC)标记而不是持续表达所有MSC的特点,和概要文件表达与文化时间的变化(24]。msc也有负面的表达造血表面标记,集群的区别(CD34、CD45和HLA-DR)和内皮标记(CD31),但高表达CD73, CD90、CD105 [25,26]。CD45存在于造血细胞,调节细胞生长、分化、细胞周期,致癌的转换(27]。CD90膜结合糖蛋白是近90%的变量表达的组织(28),它的功能是与血管生成相关(29日,30.]。此外,CD146,典型的外膜细胞标记,是报告为常见的表面标记msc (31日- - - - - -34),其表达依赖于捐赠或细胞通道号码(35,36]。以前的报告显示的变化CD90 CD146,特异性神经元烯醇酶(研究),对asc和核受体相关蛋白1 (Nurr1)源自于眼睑和腹部脂肪37]。我们的研究结果表明,对asc轨道包含表面标记与msc对asc在水平高于腹部。按照我们的研究结果,对asc包含统一特征标记,CD44阳性,CD73, CD90、和CD31 CD105和消极,CD45和HLA-DR [31日,38]。

大多数趋化因子,比如咆哮,MCP-1 IP-10,吸引炎症细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、T淋巴细胞,而il - 6分泌与多能性和免疫有关的特权msc (39,40]。据报道,fractalkine,包围的趋化因子,在破骨细胞分化的作用[41),和其它趋化因子,如eotaxin MIP-1α,有一个角色在msc(嗜酸性粒细胞招募42]。在我们的研究中,对asc轨道显示更多的免疫安全性和更高浓度的趋化因子生产对asc和腹部。此外,除了IL-5抗炎的标记检测;大多数促炎介质,是对asc表达了两种类型的变量。报告对asc的中介组织再生时分泌特定的可溶性因子,VEGF和FGF等(43]。我们的结果显示这两种类型的对asc分泌VEGF, EGF, FGF-2;然而,分泌物对asc FGF-2和VEGF是较小的轨道对asc和腹部。因此,我们的研究表明,对asc源自不同的网站有不同的属性的炎症和再生。

脂肪形成的分化是由一个复杂的转录因子网络开始增加CCAT的表情/ enhancer-binding蛋白(C / EBP)β/γ,激活PPARγ和C / EBPα(44]。据报道,FABP4是一个明显的adipokine对asc的转录和代谢调节作用[45]。在这项研究中,奥罗染色结果表明,这两个对asc诱导在脂肪形成的培养介质对asc和轨道有更多对asc相比,腹部脂肪形成的属性,确定的mRNA的表达基因在脂肪生成。对asc轨道表示的mRNA水平更高PPARγ,C / EBPα,FABP4对asc比腹部。

以前的研究报道,BMP2扮演着一个重要的角色在细胞粘附、增殖和成熟在骨生成细胞外基质(46,47]。这项研究显示,对asc轨道高表达BMP2和SP7比腹部对asc mRNA水平,说明对asc轨道更强有力的成骨分化。这些基因的表达增加并发的最新发现基因在骨48]。

SOX9是一个主调节器主要软骨基质蛋白II型胶原蛋白的表达(49]。在我们的研究中,对asc腹部显示增加Col1A,能,SOX9对asc mRNA表达比轨道。根据这个结果,最近研究,骨关节炎的患者显示增加了这些基因的表达在chondrogenic分化(50]。

目前的研究应该注意的一些限制。首先,我们没有确定mRNA表达对asc在分化的早期阶段,其次,蛋白质含量的信号机制参与trilineage变异没有调查。我们所知,这是第一个比较研究对asc来源于轨道和腹部脂肪组织的trilineage分化的能力。集体,虽然从相似的脂肪组织分离,这两种类型的对asc显示许多对比特征表面标记和细胞因子释放。此外,轨道的脂肪形成和骨生成具有更强大的功能也更少倾向于chondrogenic分化对asc相比,腹部。进一步研究trilineage分化的机制需要阐明。理解定义表型的细胞有助于做出合适的选择在不同的再生的临床适应症等细胞治疗和组织工程。

数据可用性

人类脂肪组织由盆唐CHA医疗中心和机构审查委员会批准。在我们的研究中使用的引物序列可用加入数量和可以根据要求提供。提供所有数据全部在我们的手稿,结果和必要的通讯作者提供的细节可以在请求。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突有关的出版。

确认

这项研究支持由韩国卫生技术研发项目通过韩国健康产业发展研究所(KHIDI),由卫生部和福利,大韩民国(批准号HI16C1559)。

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