文摘
多功能干细胞有能力生成终末分化细胞类型的每个血统;因此,他们有很大的潜力治疗各种各样的疾病。最广泛的可用的干细胞是来源于人体组织,及其用于治疗应用受限于他们的高成本和低效率。在此,我们报告的媒体的间充质干细胞(msc)隔绝鹿鹿角增强组织再生通过旁分泌作用通过分泌生长因子和细胞因子的组合。值得注意的是,DaMSC-conditioned媒体(DaMSC-CM)增强头发再生通过激活Wnt信号通路。此外,DaMSC-CM在受损的皮肤组织再生潜力通过诱导皮肤regeneration-related基因。值得注意的是,我们发现囊泡来自DaMSC-CM,平均直径的~ 120 nm与毛囊形成有关,这表明分泌囊泡可以作为旁分泌介质局部细胞反应的调制。此外,这些分泌囊泡可以调节Wnt-3a的表达,Wnt-10b,淋巴enhancer-binding因子- 1 (LEF-1),组织相关更新。因此,我们的研究结果表明,使用DaMSC-CM作为一个独特的自然模型快速和完整的组织再生治疗发展可能的应用程序。
1。介绍
成人的间充质干细胞(msc)是自我更新的祖细胞。多功能干细胞有能力生成终末分化细胞类型的每个血统可以制造特定的组织,包括皮肤、骨骼、软骨、脂肪组织。到目前为止,它已经被广泛接受,干细胞在组织修复和再生扮演重要角色(1- - - - - -4]。干细胞再生疗法已成功发展,表明干细胞再生医学有很大的价值之源(5- - - - - -7]。然而,为此利用干细胞需要更好地了解现有组织的机制影响干细胞细胞再生作用。
除了msc的多能干细胞分化潜能,发现了msc的旁分泌因素导致调制组织再生(8,9]。msc分泌生物活性分子,能作用于细胞迁移,抗氧化,antiapoptosis,血管生成和免疫调节通过调节局部细胞反应(10- - - - - -12]。此外,一些研究也表明,注入MSCs-CM增强组织修复(13,14]。释放的旁分泌生长因子和细胞因子等因素会影响干细胞微环境的组织损伤,可激活组织生存、修复、再生。值得注意的是,最近的研究报道,囊泡来源于干细胞可能是干细胞的关键调解人旁分泌机制(15- - - - - -19]。例如,脂肪间充质干细胞(ASC)派生细胞外囊泡可以促进旁分泌信号(19]。细胞外囊泡可以内化成纤维细胞,促进细胞迁移、增殖和胶原蛋白合成。此外,在活的有机体内注射细胞外囊泡进老鼠遭受创伤被招聘显示促进皮肤伤口愈合受损区域的囊泡。因此,msc的多功能潜力和旁分泌机制影响受损组织的修复和再生。
鹿鹿角是唯一的哺乳动物器官接受随后的再生,以应对季节性变化在整个动物的生命,因此是一个非常有用的哺乳动物模型再生(20.,21]。有人建议,鹿角每年更新的过程包括干细胞(22]。鹿茸再生可能由自我更新的多功能干细胞位于椎弓根骨膜(PP),一个永久的额骨上凸起。PP-derived细胞表达一些干细胞标记物,如CD9、OCT-4, Nanog STRO-1,具有多能性,由于其独特的沿几间叶细胞谱系分化再生能力在体外(23,24]。然而,鹿角再生的机制仍不清楚。
在这项研究中,我们证明了条件媒体(CM)培养干细胞分离鹿鹿角中扮演重要角色的头发和皮肤再生通过释放旁分泌因子激活Wnt信号通路。此外,我们发现了一个新的中介旁分泌的行为在组织再生,这表明治疗应用潜力巨大。
2。方法
2.1。隔离鹿Antler-Derived msc (DaMSCs)
新鲜的红鹿(Cervus elaphus)鹿角得到当地的动物伦理委员会批准的条件下,按照批准的协议研究所动物保健。鹿角收集从麻醉4岁的红鹿鹿鹿在春末从当地农场(Han-Lim-Won、韩国)。鹿角尖,由天鹅绒皮肤、软骨膜间质,和chondroprogeniors使用消毒手术器械,然后获得间质组织的切片。获得的样本消化0.075%胶原酶II型(美国Sigma-Aldrich)温和搅拌45分钟在37°C,然后离心,享年300岁10分钟获得间质细胞分数。球是70毫米与尼龙网过滤和resuspended磷酸盐(PBS)。解决方案是分层到histopaque - 1077(美国Sigma-Aldrich)和离心机,享年840岁10分钟。浮在表面的丢弃,一夜之间和细胞分数是培养在37°C,在杜尔贝科修改鹰媒体(DMEM)补充10%胎牛血清的边后卫,100 U /毫升的青霉素和链霉素100毫克/毫升。
2.2。Immunocytofluorescence
培养DaMSCs Immunocytofluorescence标签进行。检测干细胞标记,anti-STRO-1抗体(RnD系统,美国)与异硫氰酸荧光素(FITC)——共轭anti-mouse IgM二级抗体(美国分子探针),和anti-CD90抗体(美国BD生物科学)结合使用Alexa萤石546 -共轭anti-mouse免疫球蛋白二次抗体(美国分子探针)。主要抗体稀释1∶50和二级抗体1∶100。
2.3。蛋白质芯片检测
DaMSCs在DMEM培养3天没有的边后卫然后条件媒体DaMSCs收获。DaMSC-CM治疗后,生长因子抗体阵列工具包(美国RayBio生长因子数组C1)访问根据制造商的指示。正常的媒体(DMEM)被视为消极的控制。
2.4。细胞增殖实验
DaMSC-CM、ASC-CM和正常的媒体被用来治疗三种不同类型的细胞,包括毛乳头细胞(dpc),角化细胞(HaCaTs)和人类皮肤成纤维细胞(HDFs)。48 h后孵化,CCK-8化验(美国Dojindo分子技术)进行了细胞增殖测定吸光度在450 nm使用标仪(美国Bio-Rad)。
2.5。定量rt - pcr(存在)的分析
72 h后治疗DMEM、ASC-CM或DaMSC-CM,从三种不同类型的细胞总RNA提取(dpc, HaCaTs HDFs)获得使用RNeasy迷你包(试剂盒,德国)。每一个1μ克总RNA使用iScriptTM cDNA反向转录合成装备(表达载体、韩国),和50 ng cDNA样本用于存在分析(StepOne实时PCR体系,ABI)与特定的引物补充表中列出S1。
2.6。伤口愈合体外测定
测量细胞的迁移,HDFs保存在无血清的媒体被放置到60毫米盘创建一个支流单层,然后用一个塑料伤害生成微量吸液管小费。洗涤后,媒体被控制媒体或取代DaMSC-CM时间的方式。伤口空间被相差显微镜检查的照片。
2.7。从DaMSC-CM孤立的细胞外囊泡(EVs)
从DaMSCs孤立囊泡分泌,条件媒体收集。条件的集合媒体后,细胞碎片和大型膜颗粒在500年被连续离心30分钟,然后10000年30分钟。小泡在超速离心法收集到1000001 h,然后resuspended PBS进行进一步的实验。
2.8。EVs DaMSC-CM隔绝的表征
分析电动汽车的尺寸和形貌,纳米粒子跟踪分析(NTA)和透射电子显微镜(TEM)分析进行,分别。测量粒子的浓度,NanoSight LM 10仪器(处NanoSight有限公司、英国)使用。TEM图像,囊泡在2%多聚甲醛固定转移到Formvar-carbon-coated电镜网格。网格与PBS洗几次,覆盖着一滴1%戊二醛为5分钟。用蒸馏水洗涤后,电网负沾2%醋酸双氧铀和分析用透射电子显微镜(jem - 1011,德国)。
3所示。结果
3.1。识别DaMSCs
验证的msc、马鹿antler-derived msc使用连续离心方法分离得到。免疫组织化学分析被用来检测干细胞标记包括STRO-1和CD90 DaMSCs(图1)。STRO-1-positive或CD90-positive msc可视化使用荧光显微镜(图1(一))和量化通过规范化DAPI-stained核(图1 (b))。在三个随机选择的地区一个培养皿,> 90%的观察到细胞STRO-1-positive CD90-positive > 95%。
(一)
(b)
3.2。活性生物分子的检测条件DaMSCs的媒体
最近,从神经干细胞分泌的活性生物分子被认为是在组织再生的好处因为分泌分子如细胞因子、生长因子、细胞外基质(ECM)分子可以导致宿主组织的微环境。因此,我们测试了干细胞的旁分泌作用使用生长因子芯片阵列。与DaMSCs对待媒体后,26日分泌生长因子的条件被检测出媒体(图2和补充表S2)。正常的媒体被用于消极控制芯片阵列。生长因子、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)、胰岛素样生长因子(igf)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm - csf)、血小板源生长因子(pdgf)、血管内皮生长因子(vegf)和转化生长因子-β2 (TGF -β2)被发现。特别是,PDGF、VEGF和TGF -β2从DaMSCs明显释放。
3.3。DaMSC-CM对PDC扩散的影响
Mesenchyme-derived毛乳头细胞(dpc),位于毛囊底部,扮演了一个重要的角色在调节毛囊代(25,26]。毛囊发育深深与上皮角化细胞之间的信号和dpc (27]。特别是,Wnt /β连环蛋白信号的hair-inducing活动需要真皮乳头状突起,这是dpc的扩散的关键(28]。因此,我们首先测试DaMSC-CM能否诱导DPC扩散(图3(一个))。DaMSC-CM是用于治疗dpc 48 h,然后使用CCK-8测定细胞增殖是评估。我们也使用脂肪tissue-derived茎cell-conditioned媒体(ASC-CM)进行比较。有趣的是,DaMSC-CM促进细胞生长明显多于ASC-CM。此外,DaMSC-CM显示相比,细胞数量几乎增长了1.4倍正常媒体。接下来,Wnt信号似乎扮演了一个重要的角色在组织修复和再生的机制在胎儿和成人创伤(29日,30.]。Wnt通路调节细胞增殖在伤口愈合。特别是,皮肤伤口表达各种Wnt蛋白质Wnt-1成绩单,3,4,5,-10 b (31日]。此外,毛囊再生和MSC激活可以通过激活诱导的Wnt /β连环蛋白信号通路对于Wnt-3a和Wnt-10b32]。因此,,的Wnt蛋白质如Wnt - 2 Wnt-10a,和在毛囊起始Wnt-10b发挥关键作用,形态发生和发展(33]。研究Wnt信号对头发生长的影响,表达Wnt-3a和Wnt-10b使用定量rt - pcr(数据分析3 (b)和3(c))。
(一)
(b)
治疗DaMSC-CM导致Wnt-3a mRNA增加了3.2倍和1.5倍增加Wnt-10b mRNA相比正常的媒体。因此,DaMSC-CM促进Wnt信号通路的激活头发再生。
3.4。DaMSC-CM对皮肤再生的影响
几项研究表明,干细胞密切有助于伤口修复损伤后,导致受损皮肤的再生(34,35]。因此,我们测试了DaMSC-CM对伤口愈合的影响。首先,我们调查了又有些皮肤保护方面的新细胞包括角质细胞的增殖(HaCaTs)和人类皮肤成纤维细胞(HDFs)在治疗DaMSCs(图4(一))。相比正常的媒体,DaMSC-CM增强扩散两种类型的皮肤细胞。此外,我们研究了在治疗后皮肤regeneration-related基因的表达与DaMSC-CM(图4 (b))。值得注意的是,DaMSC-CM治疗导致高水平的胶原蛋白1型和bFGF信使rna与正常的媒体。此外,为了测试DaMSC-CM对细胞迁移的影响,一个时间在体外伤口愈合试验(图进行4 (c))。细胞增殖的类似于我们的发现,我们观察到增强迁移HDFs人工划痕后汇合的细胞单层DaMSC-CM处理时,特别是在72 h后治疗,当细胞接受DaMSC-CM的迁移率大约是75%。因此,DaMSC-CM也对皮肤伤口再生的影响。
(一)
(b)
(c)
3.5。隔离的分泌囊泡DaMSC-CM作为旁分泌的中介行为
最近的研究报告说,电动汽车从干细胞可能导致旁分泌信号(19,36,37];因此,我们试图从DaMSC-CM净化分泌囊泡(图5)。奇怪的是,许多小泡时发现从DaMSC-CM使用一个超速离心法分离方法。NTA分析获得EVs大小分布的平均119.9 nm(图5(一个)),和TEM图像表现出与脂质影响纳米级囊泡(图5 (b))。接下来,研究电动汽车的潜在功能隔绝DaMSC-CM组织再生,Wnt信号通路相关基因表达和毛囊形成评估治疗后DaMSC-CM EVs(图6)。有趣的是,EVs独自高度Wnt-3a mRNA水平的增加和Wnt-10b ~ ~ 8倍和4倍,分别。相比之下,我们之前的数据显示,DaMSC-CM诱导只有3.2倍和1.5倍的mRNA水平增长Wnt-3a和Wnt-10b(图3 (b))。我们假设电动汽车从DaMSCs分离高纯度与生长因子和其他因素。此外,LEF1 mRNA水平,这是一个主要端点中介的Wnt信号通路38),在治疗下显著增加电动汽车(图5.6倍6)。因此,DaMSCs分泌细胞外囊泡,旁分泌的行为可以作为介质。
(一)
(b)
4所示。讨论
干细胞有很大的潜在的分化和再生为所有类型的细胞,因此独特的细胞在体内。干细胞疗法已在汽车和外源的进行移植重建组织。许多分子组件导致再生过程和影响移植(39,40]。干细胞归巢和自我更新的能力起着至关重要的作用在组织再生机制,但旁分泌的行动也恢复组织的必要条件。除了多能干细胞分化潜能,干细胞可以释放细胞因子,趋化因子,生长因子后受伤。这些旁分泌的因素可以影响相邻细胞及其微环境。有趣的是,旁分泌介质似乎表达了针对损伤。此前报道称,静脉注射和冠脉内注射MSCs-CM显著恢复室性能的损伤模型(41]。值得注意的是,nanovesicles在CM中被发现的直径100 - 220纳米,这表明旁分泌信号可能是影响电动汽车作为细胞之间的调解人。几种方法,包括蛋白质组学芯片阵列芯片,和其他高通量分析,确定囊泡的内容(17]。最近,许多研究已经发现的功能MSC-derived液在治疗效果42]。秘书泡包括液和微泡参与直接或间接细胞间的沟通,从而改变组织环境和新陈代谢。这些囊泡携带不同的细胞因子和生长因子,脂质,小rna,等等,这可以影响组织反应损伤、疾病和感染。令人惊讶的是,msc和MSC-derived液表现出相似的治疗效果在保留组织或促进再生从伤病网站(43,44]。因此,MSC-derived液颗粒治疗的有很大的价值。
在我们的研究中,我们还发现DaMSCs发表高水平的可溶性因子可能诱导激活规范Wnt /β连环蛋白信号。电动车在这项研究中,我们发现还可能影响到旁分泌调节组织再生。因此,有人提出,实际上wnt液分泌,导致组织损伤修复(45,46]。因此,我们调查DaMSC-derived EVs表演在组织再生产生一个新的电动汽车的再生医学方面可能是一个独特的材料快速和完整的组织再生。
5。结论
在这项研究中,我们证明了DaMSC-CM可以显著促进组织再生,如毛囊和皮肤伤口愈合形成,这都是与Wnt信号通路有关。包括PDGF DaMSCs可以释放生物活性分子,VEGF, TGF -β2作为旁分泌因子细胞间的沟通。此外,我们发现纳米级囊泡来源于DaMSC-CM和调查能力通过Wnt信号促进毛囊形成的。这些结果表明,分泌囊泡作为旁分泌调节细胞反应的介质。因此,我们的研究结果表明在再生医学应用潜力巨大。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
KIST机构支持的研究项目(项目号2 e27950)。
补充材料
表S1:存在的引物列表分析。每个信使rna进行了分析使用中存在的相对表达和规范化GAPDH mRNA的表达。表S2:分泌生长因子的列表。干细胞的旁分泌作用使用生长因子芯片阵列进行了测试。(补充材料)