损失函数的表观遗传修饰符和拼接因素在早期阶段的心脏重新编程

文摘

心脏成纤维细胞直接重编程(CFs)诱导心肌细胞(icm)是一种新出现的有前途的方法心脏再生,疾病模型和药物发现。然而,其潜力大大限制由于重编程效率低,很大程度上是未知的潜在的分子机制。我们以前筛选和鉴定表观遗传因素与组蛋白修饰在iCM重组有关。在这里,我们使用shrna瞄准一个额外的电池的表观遗传因素参与染色质重塑和RNA拼接因素进一步确定抑制剂和主持人直接心脏重新编程。击倒的RNA剪接因素Sf3a1或Sf3b1显著降低百分比和总数量的心脏标志物阳性icm通常伴随着压抑的基因表达。删除另一个RNA拼接因素Zrsr2促进了CFs CM分子特性的收购和小鼠胚胎成纤维细胞(mef)在蛋白质和mRNA水平。此外,一个一致的重编程效率的增加在CFs和mef shrna对待目标Bcor(组件Bcor复杂的总科)或Stag2 cohesin复杂(组件)。我们的工作从而揭示了几个额外的表观遗传和拼接因素,抑制或所需iCM重组和突出表观遗传调控的重要性和RNA剪接过程细胞命运转换。

1。介绍

哺乳动物心脏再生能力有限,因此有害的侮辱,如心肌梗塞(MI)可能导致永久丧失心肌细胞(CMs)和心脏功能逐渐下降1]。到目前为止,有有限的治疗后完全恢复心脏功能心脏损伤,最终导致心力衰竭,成为死亡的主要原因。最近,几种有前景的策略来补充失去的内生CMs或更换出现故障的CMs,包括使用自体来源的CMs来源于心脏祖/干细胞,多能干细胞,或直接诱导心肌细胞(icm) [2]。其中,成纤维细胞直接重编程到icm近年来一直积极地追求,因为它的可行性在体外和体内,其独特的过程没有经过多能祖阶段,这可以避免肿瘤发生的风险。首次报道,三个主转录因子,Gata4, Mef2c Tbx5,能够直接将小鼠的心脏成纤维细胞(CFs)转化为icm体外(3]。随后,一代的icm体内小鼠心肌梗死模型成为可能,从而导致功能改善和减少疤痕的大小(4,5]。此后,越来越多的研究关注执行替代鸡尾酒,可以提高效率和/或纯度的icm (4,6- - - - - -16),开始揭示出其潜在的分子机制在iCM重组(17- - - - - -22]。尽管有这些进步,iCM方法的潜力仍然是有限的,因为病人使用相对较低的效率,很大程度上是未知的分子机制,必须完全阐明未来临床前的实现。

表观遗传学的定义是稳定和可遗传的基因表达和细胞表型的变化,不涉及DNA序列的变化(23,24]。虽然细胞命运转换要求指导线索通过异位的主转录因子的表达,重组成功依赖,可以极大地增强了表观遗传修饰,对于建立和维护是必要的在轮细胞分裂的基因表达模式发生改变。因此,表观遗传调控的细胞重新编程至关重要阐述了在其他直接重编程过程25]。我们和其他人表明repatterning H3K27me3 H3K4me3, DNA甲基化是伴随着基因转录的交替在早期阶段的心脏从成纤维细胞重新编程3,17,19,26),与组蛋白相关的修改和删除表观遗传障碍,如Bmi1 Mll1,大大改善了icm的数量和质量18,21]。然而,除了组蛋白修饰和DNA甲基化,稳定维持基因表达的表观遗传过程还包括染色质重塑和各种rna介导的过程,以及表观遗传相关监管机构的作用在很大程度上仍未知直接的心脏重新编程。最近的研究对心脏细胞重编程开发和证明了协调的转录因子和染色质重塑是至关重要的细胞命运的决心和转换(25,27,28]。因此,尽管研究,重要的是识别关键染色质remodeling-related表观遗传监管机构协调iCM归纳。描述每个表观遗传的调制器将有助于了解细胞具有相同DNA重组成不同的血统和描绘表观遗传障碍和主持人的角色参与不仅iCM重组,也或许其他细胞重新编程过程。

RNA拼接越来越被认为是一个重要的层转译后的基因调控在心脏29日]。例如,剪接因子Sf3b1, U2乐队的一个组件snRNPS参与本构和可变剪接,特异表达在人类和小鼠模型的病态心脏肥大(30.]。此外,全球拼接的降级模式已经证明发生在体细胞重编程(31日]。删除拼接因素U2af1和Srsf3诱导多能干细胞重编程效率降低(万能)31日]。值得注意的是,最近我们发现删除的可变剪接因子Ptbp1显著提升心脏命运转换成纤维细胞(22]。这些研究强调了监管RNA剪接机制的一部分细胞重新编程和心脏病的发病机理和隐含的潜在关键作用iCM重组RNA连接因素。因此,识别功能剪接因子在心脏重组直接将提供进一步的了解我们对iCM感应分子机制的理解。

这里,我们筛选后生调节器与不同的复合物和核心拼接shRNA-mediated损失因素的功能分析和识别剪接因子Sf3a1和Sf3b1所需直接的心脏重新编程。与此同时,删除另一个拼接因素Zrsr2增强代icm CFs和mef。额外两个后生监管者,Bcor和Stag2涉及作为独立的表观遗传抑制剂iCM重组。这些发现提供额外的见解的关键角色后生调节器和拼接因素直接心脏血统转换和未来进一步研究表观遗传的基础和RNA重组splicing-related机制。

2。材料和方法

2.1。鼠标线

转基因小鼠携带αMHC-GFP记者被用于隔离的心脏成纤维细胞(CFs)和小鼠胚胎成纤维细胞(mef) [3,5]。所有鼠标协议机构批准的动物保健和使用委员会(IACUC),北卡罗莱纳大学教堂山分校。动物保健依法执行准则建立了北卡罗莱纳大学教堂山分校。

2.2。质粒

建立了多顺反子构造pMXs-puro-MGT如前所述[14]。pMXs-puro-MGT图提供的质粒图S1。与pLKO shRNA慢病毒载体。1backbone were obtained from Sigma-Aldrich. Packaging and envelop vectors for lentivirus were psPAX2 and pMD2.G (Addgene).

2.3。病毒包装和转导

板在媒体293 t细胞培养(10%胎牛血清(的边后卫)/ 1 x青霉素和链霉素(P / S) / 0.1毫米不必要的氨基酸(NEAA) / DMEM)(技术)。四到五百万板细胞播种到10厘米菜被用于转染。第二天,pMXs-puro-MGT引入板细胞使用Nanofect (Alstem)根据制造商的指示。简单地说,20μ克pMXs-puro-MGT和45μl与500年Nanofect涨跌互现μl DMEM在不同管,混合相结合和涡几秒钟。在室温15分钟的孵化后,1毫升的总混合添加一滴一滴地板细胞。新的293 t中没有P / S转染前被换下。16小时posttransfection,媒体改变了媒体与普通293 t。上层清液包含收集逆转录病毒转染48和72小时后,透过一个0.45μm过滤器(热科学),8%的孵化PEG6000一夜之间(σ)在4°C。病毒颗粒颗粒状和离心机在3900 rpm 30分钟在4°C和resuspended 100μl DMEM。对慢性疲劳综合症或mef 24盘,10μl (pMX-puro-MGT补充了4μg / ml聚凝胺(生命技术)添加心脏重新编程。

五百万293 t细胞播种并培养隔夜菜在一个10厘米293 t的媒体被用于慢病毒包装。10μ克pLKO。1mixture with shRNAs (equal amount) targeting one gene, 7 μpsPAX2 g, 3μ克pMD2。500年G涨跌互现μl DMEM。DNA混合物是结合转染试剂混合物45μl Nanofect和500μl的DMEM、涡流和孵化在室温20分钟。媒体posttransfection交换16个小时后,媒体“(分泌物)收集posttransfection 48和72小时。过滤媒体孵化8% PEG6000一夜之间在4°C和离心机在3900 rpm, 30分钟在4°C获得病毒颗粒。100年μl的DMEM resuspend病毒颗粒。10μ慢病毒用于细胞的l播种在每个24-well板合并感染管理逆转录病毒。

2.4。慢性疲劳综合症的隔离

外植体和新鲜的隔离CFs进行根据先前描述的协议(14,32]。简而言之,心从产后解剖1.5 (p1.5)小鼠,与冷PBS冲洗,用无菌叶片切成小块。为外植体慢性疲劳综合症、小组织被镀到gelatin-coated菜肴和培养的成纤维细胞(神奇动物)媒体(IMDM / 20%的边后卫/ 1 xpen /喉炎)7天。之前magnetic-activated细胞排序(mac),移植心脏细胞使胰蛋白酶化,透过40μm细胞过滤器(BD)。隔离新鲜CFs,心脏组织与0.05%胰蛋白酶消化37°C 10分钟和0.2%胶原酶II型/哈佛商学院(生命技术)在37°C 5分钟之后1分钟5倍的涡流。每一次,上层清液包含单个细胞是透过40μm细胞过滤器(BD)和中和在相同体积的FB媒体。红细胞被使用红细胞裂解缓冲(KHCO3 NH4Cl 150毫升、10毫米和0.1毫米EDTA) 1分钟在冰上。然后,mac进行丰富Thy1.2-positive成纤维细胞。细胞孵育10μl的生物素anti-Thy1.2抗体(Biolegend)流式细胞仪缓冲区(DPBS / 2% EDTA的边后卫/ 2毫米)30分钟在4°C,然后10μl (Anti-Biotin微(Miltenyi研究)在mac缓冲区(DPBS / 0.5% BSA / 2毫米EDTA)在4°C 30分钟。之后,细胞被洗和resuspended mac缓冲区,用于校准LS列(Miltenyi研究)。Thy1.2-positive细胞被刷新,重新播种。

2.5。mef的准备

mef从E13.5被孤立αMHC-GFP幼崽从CD1应变如前所述33]。短暂,从怀孕的老鼠胚胎孤立E13.5解剖了头和红色的器官,然后用无菌叶片开采。小型组织中分离1毫升0.05%胰蛋白酶/ EDTA补充100单位DNase我15分钟37°C,然后中和在媒体MEF(10%的边后卫/ 1 xp / S / DMEM)。离心后,细胞resuspended成MEF媒体和镀gelatin-coated菜肴。然后,mef低通道号码(n= 2 - 6)被用于iCM重新化验。

2.6。直接的心脏重新编程

ExCFs,先和mef被播种到gelatin-coated井24-well板的细胞密度2×10⁴一天前感染。iCM媒体(10%的边后卫/ 20% M199 / DMEM) 10μl(逆转录病毒puro-MGT 10μ慢病毒shrna l, 4μg / ml聚凝胺取代FB媒体重组天0。iCM媒体1μg / ml嘌呤霉素在第三天,取而代之的是使用常规iCM媒体一天6。在第十天,重编程细胞收集的试剂盒RNA提取或用4%多聚甲醛固定(PFA)疣状(图1(一))。

2.7。流式细胞术和免疫细胞化学(ICC)

流式细胞术,重新编程细胞使胰蛋白酶化0.05%胰蛋白酶/ EDTA(技术)、固定和固定/透化作用的解决方案(BD生物科学)30分钟在4°C。烫/清洗液(BD生物科学)是用于清洗之间的每一个步骤。细胞培养与初级抗体(GFP, 1: 500年,表达载体;cTnT 1: 400年,热科学)稀释BD烫/ 30分钟清洗解决方案4°C和亚历克斯·福陆488 -共轭或亚历克斯·福陆647 -共轭二次抗体(1:500年,杰克逊ImmunoResearch Inc .) 30分钟在4°C。细胞在贝克曼库尔特青色ADP流式细胞分析仪运行。数据分析由FlowJo软件(树明星)。刑事法庭,4% PFA-fixed细胞permeablized Triton-X100 20分钟,0.1%被5% BSA在室温下30分钟,然后孵化主要抗体(GFP, 1: 500年,表达载体;α辅肌动蛋白1:500年,Sigma-Aldrich;cTnT 1: 400年,热科学一夜之间)在4°C和亚历克斯·福陆488 -共轭或亚历克斯·福陆647 -共轭二次抗体(1:500年,杰克逊ImmunoResearch Inc .)在室温下1小时。最后,赫斯特33342年核(技术)是用于标签。PBS是用于洗每一步之间。图像捕获使用evo®FL汽车细胞成像系统(技术)。ICC的量化,10下图像被随机获得20 x放大在同一曝光设置。然后显示细胞数手动盲的方式。

2.8。RNA提取和逆转录定量PCR (RT-qPCR)

根据制造商的指示,细胞溶解产物试剂盒试剂(表达载体)分离与氯仿。RNA与异丙醇在水相沉淀,颗粒状和离心机,用乙醇洗净,筛选了DNase-free和RNase-free水。纯化RNA被Nanodrop量化(热科学)和reverse-transcribed cDNA使用上标三世逆转录酶(表达载体)。qPCR执行使用电力SYBR绿色PCR反应混合液(应用生物系统公司)ABI ViiA 7实时PCR系统(应用生物系统公司)。提供了额外的引物序列RT-qPCR补充表S2。

2.9。统计分析

对于每一个实验,3 - 4生物复制技术重复检查。消极的控制(即。,mock-treated and/or nontargeting shRNA control transduced cells) and positive controls (i.e., shBmi1-transfected cells) were used in every single experiment. Average number from technical duplicates was used for statistics. For ICC, quantification was performed from 10 images randomly taken under 20x magnification at the same exposure setting in a blind fashion, and averaged numbers were used for final statistics. Where appropriate, values are presented as the mean ± SEM of replicate experiments. Statistical analyses were performed with two-way unpaired Studentt以及或单向方差分析。表明两组有显著的区别的价值 , , , 表示高度显著性差异。

3所示。结果

3.1。RNAi表观遗传筛查监管者在早期阶段的心脏重新编程

我们之前显示删除的关键表观遗传障碍Bmi1促进icm生成的效率和质量通过转录factor-mediated直接重编程(21]。为了进一步检查额外的表观遗传因素对iCM重组的影响,我们使用了一个类似的功能丧失的屏幕来确定25的角色选择的相关基因表观遗传修饰和染色质重塑(表1)。4 - 6短发夹池用于每个基因(表的可拆卸的S1)。我们使用外植体感染心脏成纤维细胞分离方法(ExCFs, (3))αMHC-GFP转基因幼崽在P1.5 shRNA池,随后转导的多顺反子重组向量表达Mef2c Gata4, Tbx5短(管理)。然后,我们决定重新编程icm的百分比表达αMHC-GFP和心肌肌钙蛋白T (cTnT)流式细胞术(图1(一))。不属预定目标的成分和oligo-targeting Bmi1担任正面和负面的控制,分别是(21]。经过10天的感染,可拆卸的shrna效率首先取决于实时定量PCR (RT-qPCR)(图1 (b))。然后,一代的icm在可拆卸的各种基因被褶皱的变化相对于shNT得分的比例控制αMHC-GFP +细胞和cTnT +细胞。我们发现击倒的四个基因有显著提高重组效率控制shNT相比,但仍低于Bmi1撞倒时(图1 (c))。在目标基因BCL6-interacting辅阻遏物(Bcor)和RuvB-like蛋白1 (Ruvbl1两个染色质修饰符),研究了不同染色质复合物(34- - - - - -38]。剩下的两个成分靶向cohesin复杂的组件之一,基质抗原2 (Stag2剪接体的拼接因素之一),组装、锌指(CCCH类型)RNA结合主题,和丝氨酸/精氨酸丰富2 (Zrsr2)。相反,击倒set2 / MLL中的蛋白质家族的一些成员,赖氨酸- 2 (K)特定的甲基转移酶(Mll1 / Kmt2a),赖氨酸- (K)特定的甲基转移酶2 d (Mll2 / Kmt2d()和赖氨酸)- K -特定的甲基转移酶2 e (Mll5 / Kmt2e),显示压抑对一代的影响αMHC-GFP + icm,暗示H3K4甲基化的重要作用心脏改变(图1 (d))。有趣的是,最高目标,推倒导致的5倍的比例减少αMHC-GFP + icm,剪接因子3,亚基1 (Sf3a1)、和剪接因子3 b亚基1 (Sf3b1)。都属于剪接体的拼接因素同样Zrsr2但有相反的表型Zrsr2损耗而删除。利用shRNA-mediated RNAi屏幕,我们确定了各种表观遗传调节器所需或抑制iCM重组。

3.2。击倒后受损的心脏重新编程Sf3a1或Sf3b1

剪接体是一个复杂和高度动态的分子机制,识别出接头地点,内含子从前体信使rna (pre-mRNAs) [39,40]。五个小ribonuclear蛋白质颗粒(snRNPs)和各种辅助蛋白质组装形成剪接体(39,40]。U2 snRNP Sf3a1和Sf3b1组件,稳定U2核内小rna绑定到分支点在内含子序列41,42]。这两个剪接因子的突变被发现与骨髓增生异常综合征(43]。然而,它仍然是不太为人所知的细胞功能Sf3a1或Sf3b1。通过我们的shRNA屏幕,我们好奇发现击倒两个拼接因素参与剪接体组装导致抑制iCM的一代。然后我们确认shRNA屏幕流式细胞术和量化结果的icm来自ExCFs。感染后10天shSf3a1或shSf3b1慢病毒MGT-transduced ExCFs,细胞的百分比表达心脏标记,αMHC-GFP或cTnT和阳性细胞急剧下降(图2(a))。进一步证实Sf3a1和Sf3b1 iCM重组的重要角色,我们执行击倒实验新孤立的慢性疲劳综合症(先),这似乎是最适合MGT-mediated心脏重编程(21),重组效率评估流程和ICC iCM-expressing心脏标记物的分析。一致,可拆卸的Sf3a1或Sf3b1压抑的生成αMHC-GFP和/或cTnT-positive icm来自先相比,那些来自控制shNT-infected CFs(图2 (b))。ICC图像和量化显示类似的重新编程细胞表达减少αMHC-GFP记者和心脏Z-disc蛋白质,α辅肌动蛋白在击倒Sf3a1或Sf3b1(数据2 (c)- - - - - -2 (e))。与此同时,我们发现这两个拼接的可拆卸的因素在重组导致显著降低总细胞数由赫斯特33342年染色(图表示2 (f))。这些数据表明,损耗剪接因子不仅iCM重组效率下降,也影响细胞的生存在这样的环境。

3.3。增强转换的icm CFs在击倒Ruvbl1,Bcor,Zrsr2,或Stag2

另一方面,我们进一步证实的表型是由于击倒四支安打,Ruvbl1,Bcor,Zrsr2,Stag2似乎是直接的心脏重新编程的抑制剂。Ruvbl1(或Tip48 potin)属于AAA +腺苷三磷酸酶(atp酶与多个相关活动)家族(36]。许多核染质的再塑造复合物含有Ruvbl1,如INO80复杂,TIP60复杂,SWR1复杂,为了便于装配和维护atp酶的催化活性36,38,44]。据报道,INO80需要复杂的胚胎干细胞自我更新和多潜能通过交换和沉积H2A组蛋白变体。Z (45]。在这里,进一步证实Ruvbl1作为潜在的抑制剂的作用心脏重新编程,我们评估了iCM代ExCFs和先通过流式细胞术和刑事法庭染色。shNT作为消极的控制,而shBmi1作为一个积极的控制。流式细胞术结果显示2倍增加的百分比cTnT + icm MGT-transduced ExCFs和先shRuvbl1慢病毒感染后(数字3(一个)和3 (b))。此外,损失Ruvbl1导致显著增加的百分比αMHC-GFP +细胞来源于先(数字3 (c)和3 (d))。有趣的是,击倒其他地下桶基因Ruvbl2似乎没有影响(图重编程效率1 (d)),显示不同的角色不同的地下桶icm在转换从成纤维细胞的基因。

Bcor已被确定为一个已知转录辅阻遏物和调节基因的表达与epigenetic-modifying复合物包括Polycomb集团(PcG)蛋白质,Skp-Cullin-F-box (SCF)泛素连接酶,和组蛋白demethylase34,35]。Bcor是一个无所不在地表达相关基因和x连锁oculofaciocardiodental (OFCD)综合征以多个缺陷在人类,如心脏心房间隔缺损(34,46]。研究Bcor丧失功能的突变小鼠表现出强烈的parent-of-origin效果,表明可能的监管角色Bcor胚胎外的组织在早期发展(46]。此外,Bcor需要适当的胚胎干细胞分化成外胚层、中胚层,下游造血血统(46]。这是第一次Bcor在iCM重组研究。我们发现,击倒的Bcor导致了10倍和三倍增加的百分比cTnT + icm源自ExCFs,先分别相比,治疗shNT(数字3(一个)和3 (b))。增加额外的心脏标记物的百分比αMHC-GFP和αActinin-positive icm在Bcor击倒经ICC染色(数字3 (c)和3 (d))。值得注意的是,基于心脏标志物表达衡量流和刑事法庭,击倒Bcor导致了前四名候选人中增加重组效率最高。

Zrsr2 (U2AF35同族体)是另一个重要组成部分的剪接体47]。Zrsr2(或Urp)身体与U2AF65和丝氨酸/ arginine-rich (SR)蛋白质促进外显子/内含子边界的识别和剪接体组装47,48]。10天后本转导,cTnT +细胞的比例大幅提高检测的治疗下shZrsr2 ExCFs和先相比,获得控制shNT治疗(数字3(一个)和3 (b))。此外,以及绝对数量的百分比αMHC-GFP +或α辅肌动蛋白+细胞的显著增加Zrsr2(数据3 (c)和3 (d))。综上所述,我们的数据表明,功能的丧失Zrsr2增强的转换从心脏成纤维细胞到icm。

Stag2(或SA2)编码的一个核心单元cohesin复杂,该基金持有分裂细胞的姐妹染色单体和对染色质隔离至关重要49,50]。此外,cohesin最近与染色质循环和绝缘通过其直接与CTCF的交互控制染色质结构和基因调控51- - - - - -53]。同样的,独立于不同的隔离方法准备开始CFs,损失的Stag2总是导致显著增加的比例和数量的icm通过流式细胞术所示αMHC-GFP + / cTnT +细胞和刑事法庭的分析αMHC-GFP +或α辅肌动蛋白+细胞(数字3(一个)- - - - - -3 (d))。然而,另一个组件的可拆卸的凝聚力的复杂Rad21并不影响iCM重组(图1 (d)),这意味着潜在的复杂性机制Stag2复合物功能和相关的凝聚力在直接的心脏重新编程。

3.4。增强的iCM代从mef耗尽Bcor,Zrsr2,或Stag2

排除候选表观遗传因素对心脏的细胞特定类型的角色重新编程,我们利用小鼠胚胎成纤维细胞(mef)隔绝E13.5幼崽αMHC-GFP击倒的转基因老鼠来测试效果Ruvbl1,Bcor,Zrsr2,Stag2。经过10天的本感应,αMHC-GFP +和/或cTnT + icm进行评估通过流式细胞术mef感染shrna瞄准Ruvbl1,Bcor,Zrsr2,Stag2,或控制序列(图4(一))。值得注意的是,击倒的Bcor,Zrsr2,或Stag2导致了大约5倍的比例增加α相比MHC-GFP + icm shNT-treated细胞(图4(一))。然而,降价Ruvbl1导致仅仅2倍增加的百分比αMHC-GFP +细胞(图4(一))。通常,褶皱的变化cTnT +细胞的比例增加到不同程度上消耗的候选人四个基因,但cTnT +细胞的比例来自mef总是低于来自慢性疲劳综合症(数字3(一个)和4(一)),表明不同的可塑性来自不同来源的成纤维细胞心脏成纤维细胞是最适合。有趣的是,亮视场细胞图像显示MGT-transduced细胞击倒后变得平坦Bcor或Zrsr2观察和广泛的细胞死亡从shStag2-infected mef(图4 (b)33342染色(图),证实了赫斯特4 (d)第三个图)。然而,总细胞数改变先改变时(图3 (d)第五图),这表明成纤维细胞与多样化的起源开始回应不同损失的染色质的表观遗传因素参与广泛监管复合体。此外,我们执行刑事法庭染色的心脏的记者αMHC-GFP和cTnT MGT-transduced mef针对候选基因的shrna对待。明显的百分比αMHC-GFP +细胞只有在shStag2-treated显著增加(增加2倍)mef相比,在shNT-treated细胞(数字4 (c)和4 (d))。然而,不仅的绝对数量αMHC-GFP + icm击倒后还总细胞减少Bcor/Zrsr2/Stag2(图4 (d)),表明表观遗传的影响破坏mef的基本细胞的生存和生长。与此同时,我们发现的损失Ruvbl1并不影响iCM重组效率从mef第十天在转导管理(数据吗4(一),4 (c),4 (d)),这表明Ruvbl1可能CF的压制功能具体表明表观遗传状态的潜在可变性在多种细胞类型。了这些数据,我们建议Bcor / Zrsr2 Stag2期间抑制表观遗传调控因素心脏重组从几成纤维细胞类型。

3.5。击倒后表观遗传重编程细胞的基因表达分析和连接因素

进一步探索如何击倒的表观遗传和拼接监管机构icm的表达谱的影响,我们用一组执行RT-qPCR厘米标记基因与肌节结构形成,离子通道,纤维母细胞标记基因重组ExCFs shRNA慢病毒合并感染。有趣的是,失去了Zrsr2导致心脏标志物表达最高的增加却没有改变纤维母细胞标记表达式(图5(一个))。与此同时,击倒Stag2明显抑制成纤维细胞的基因表达,以及心脏基因的表达(图5(一个)),这表明Stag2全球基因表达的重要作用。另一方面,核心剪接体的损耗因子Sf3a1和Sf3b1似乎通常干扰所有标记基因的表达无论细胞谱系。一个戏剧性的减少这些制造商基因被发现在治疗shSf3a1或shSf3b1(图5 (b)),建议的重要作用U2-dependent剪接体保持在成纤维细胞基因表达。此外,击倒后相似的表型Bcor/Zrsr2/Stag2被RT-qPCR获得相同的标记基因MGT-transduced mef(图5 (c))。因此,我们发现基因表达模式击倒的重编程细胞造成不同的表观遗传因素,表明不同的分子响应和潜在的潜在机制在不同的表观遗传复合体或拼接的操纵因素潜在编排心脏和fibroblast-related基因的表达。

4所示。讨论

在这项研究中,我们进行了shRNA-mediated损失函数的屏幕后生调节器参与染色质重塑和RNA剪接因子在直接的心脏重新编程。我们证明了拼接因素Sf3a1 Sf3b1心脏需要重组,虽然Zrsr2抑制iCM归纳。此外,我们发现,删除Bcor和Stag2提高重组效率无论从成纤维细胞的起源,表明Bcor-related BCOR复杂和Stag2-involved cohesin icm的复杂转换期间可能起到抑制的作用。虽然这些因素编排iCM重组的详细机制仍有待阐明,我们的结果显示额外的监管机构参与的分子网络底层直接转换成纤维细胞iCM。

结合我们之前发现,剪接因子已经被证明是直接心脏重组期间扮演至关重要的角色22]。击倒的Sf3a1和Sf3b1核心组件的U2 snRNP组装U2-dependent主要剪接体,大大减少了总重编程细胞数量和抑制纤维母细胞和心脏基因的mRNA水平。然而,降价Zrsr2,不仅参与U2-dependent U12-dependent所需主要的拼接也小拼接(48),增强心脏重新编程和增加心脏标记的iCM比例和基因表达。相反的表型可能与剪接体和细胞特定类型的复杂性和动态拼接因素的函数。同样,我们观察到不同U2af1击倒对iCM的一代的影响,在iPSC重组(31日),表明不同的RNA剪接调控iCM和iPSC重组过程。

虽然cohesin被广泛认为是ESC自我更新和确认为主持人所需iPSC重组的53- - - - - -55),它是有趣的发现击倒cohesin的核心组成部分Stag2促进了iCM代伴随着纤维母细胞标记物的表达减少,暗示cohesin直接心脏重组作为一个潜在的障碍。此外,cohesin-depleted ESCs和细胞则难以维持或建立多能性基因的表达,这可能是由于远程交互的损失(54,55)或由缺陷引起的DNA损伤反应扩散(56]。然而,排除细胞增殖的影响研究表明,cohesin损耗增强ES细胞启动体细胞重编程的能力(57]。有可能的是,在我们的研究中,全部重新编程iCM可能部分解释的:特性相反的角色cohesin iCM与iPSC重组。此外,cohesin也有助于建立和维护组织基因表达的52,58]。因此,这将是特别有趣的调查细胞特定类型的角色cohesin基因调控在不同的细胞命运转换过程。

5。结论

在这项研究中,我们使用shRNA-mediated RNAi屏幕和确定因素Sf3a1和Sf3b1作为重要的监管机构而剪接因子Zrsr2和表观遗传调节器Bcor和Stag2抑制障碍直接心脏重新编程。我们的发现不仅提供了洞察iCM重编程的分子机制的理解也可能RNAi-based方法提高重组效率。

的利益冲突

作者指出任何潜在的利益冲突。

确认

作者感谢专家从UNC流式细胞仪核心技术援助。他们感谢刘钱学森实验室,实验室的有用的讨论和手稿的关键评论。他们感谢Greg g .王博士请提供他们的关键试剂实验。这项研究是由国家卫生研究院/ NHLBI R00HL109079格兰特和美国心脏协会(AHA) 15 grnt25530005格兰特李建东刘和啊哈13 sdg17060010,埃里森医学基金会(EMF)授予ag - ns - 1064 - 13, NIH / NHLBI R01HL128331李钱先生。

补充材料

图S1:质粒pMXs-puro-MGT地图。图多顺反子的逆转录病毒vector-expressing Mef2c、Gata4 Tbx5, P2A和T2A隔开。表S1:序列成分低聚糖用于RNAi屏幕。表S2:引物和Taqman调查列表。(补充材料)

引用

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