文摘

诱导多能干细胞)的细胞则提供了新的机会运动神经元病(MND)建模、药物筛选、细胞治疗的发展。在各种类型的万能,urine-derived已经成为一个有前途的干细胞来源的细胞则因为他们可以安全地和无创孤立和容易重新编程。这里,第一次,我们区分urine-derived万能(urine-iPSCs)运动神经元(MNs)和urine-iPSCs的能力和cord-blood-derived相比则分化成MNs (B-iPSCs)。使用小分子、成熟MNs生成urine-iPSCs早在26天的文化。与肌肉细胞,此外,在coculture MNs预计长轴突形成神经肌肉接头(NMJs)。免疫荧光法和PCR证实了MN和NMJ标记的表达水平。MN的比率的比较积极的标签标记与urine-iPSCs B-iPSCs表明这些细胞的分化潜能没有显著不同。上述结果表明,urine-iPSCs是一个新的、有前途的干细胞来源MND建模和进一步的细胞治疗的发展。

1。介绍

运动神经元病(mnd)选择性地影响运动神经元(MNs),项目轴突肌肉和控制的自愿行动。mnd患者可能会出现一系列的症状,如肌肉无力、萎缩,和反射亢进,最终导致死亡1]。没有有效的治疗方法可用于MND。因此,多能干细胞(已经)已成为一个重要的研究工具MND和代表一个有前途的治疗方法2]。在各种各样的干细胞,诱导多能干细胞(万能),从成年体细胞重编程,非常便于MND建模、药物发现,和个体治疗移植,没有道德问题(3];所有的这些努力理解MND取得长足进展。到目前为止,多种类型的体细胞被重组成万能,包括广泛使用的皮肤成纤维细胞和外周血细胞,可能分化成MNs [4]。与这些细胞相比,尿细胞提供一个方便的、具有成本效益的,非侵入性的细胞来源,可以获得和重组成万能5]。然而,目前尚不清楚urine-derived人类万能干细胞分化成MNs的能力。在这项研究中,我们迅速和有效地诱导分化urine-derived万能MNs (urine-iPSCs)。免疫荧光法和PCR证实神经标记的表达水平在每一个阶段的诱导和MN-specific标记的细胞来自urine-iPSCs。我们还演示了MNs的功能能力形成的cocultures NMJs urine-derived MNs和肌肉细胞。

2。材料和方法

2.1。iPSC文化

人类iPSC线用于这个研究包括了两个尿细胞衍生iPSC行,UE017 UC005,经中国科学院广州生物医药与健康研究所(6]。控制,绳血液iPSC (B-iPSC),这是购自Gibco(美国、目录A18945)被用于这项研究。则都是培养与mTeSR Matrigel-coated盘子我(干细胞技术,加拿大),每日更换。免疫荧光法进行识别多能性标记的表达谱。

2.2。分化的细胞则为异常

杜的协议的万能干细胞分化成MNs使用轻微的修改(图1(一))[7]。MN代,未分化的细胞则被分离与5μM EDTA(表达载体)5分钟,然后通过Matrigel-coated盘子1:6。第二天,与神经干细胞中取代mTeSR分化培养基(NDM)的3μM CHIR99021 (CHIRσ),2μM DMH1(σ),和2μσ,M SB341542(某人)。的NDM包括杜尔贝科修改鹰中(DMEM / F12) Neurobasal介质在1:1的浓度,0.5×N2, 0.5×B27, 0.1毫米抗坏血酸(σ),1×Glutamax,和1×antibiotic-antimycotic从英杰公司(其他所有人)。每隔一天中被改变。保持在这些条件下的细胞则为6天分化成神经上皮的祖细胞(棉结)。7天,棉结是对待dispase(1毫克/毫升)5分钟,然后轻轻resuspended NDM,包括1μM CHIR, 2μM DMH1, 2μ0.1 M某人,μσM维甲酸(RA),和0.5μM purmorphamine (Purσ),镀在Matrigel-coated板块在1:3浓度。培养基是改变每隔一天6天,12天,棉结的分化成神经元祖细胞(基于),在花结聚合。诱导和基于MNs,解除了花结dispase(1毫克/毫升)然后在悬浮培养的NDM 0.5μ0.1 M类风湿性关节炎,μM Pur 10 ng / ml脑源性神经营养因子(BDNF, PeproTech), 10 ng / ml胶质细胞line-derived神经营养因子(GDNF, PeproTech)和10 ng / ml胰岛素样生长因子(IGF PeproTech) 6天。19天,HB9-positive MN球体形成。诱导进一步成熟,这些MN球体与accutase分离(表达载体)和培养附着NDM成单个神经元,包括0.5μ0.1 M类风湿性关节炎,μ0.1 M咕噜咕噜叫,μ米复合E (Cpd E, Calbiochem),和上述神经营养因子,超过7天。然后,MNs分化成成熟的MNs。

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图1
(一)课程和小分子为万能干细胞分化成成熟的MNs鸡尾酒。后接触CHIR99021、SB431542 DMH1 6天,万能干细胞分化成棉结。超过6天,RA和咕噜咕噜叫,细胞分化成基于。在过去的2周的分化,在RA的存在,咕噜咕噜叫,和神经营养因子,基于最终分化成成熟的MNs。(b)形态的细胞来源于三个iPSC线在每一个分化阶段。在分化过程中,前三行iPSC展出制服,未分化的形态。经过6天的感应,细胞表现出不一致的大小和形状和聚集集中(D7,棉结)。额外的6天的分化,细胞形态学改变迅速,细胞开始收集集中形成圆花饰(D13,基于,黑色箭头)。19天,分化MNs开始预测轴突。MNs逐渐成熟,其轴突延长(D26,白色箭头)。 The scale bar is 100 μm。
2.3。Coculture iPSC-Derived的MNs和C2C12细胞

C2C12细胞,小鼠成肌细胞细胞系,从中国获得生长介质类型收集和培养文化中心(DMEM / F12补充10%胎牛血清(的边后卫)),直到达到60 - 70%的细胞融合。然后,介质改为分化培养基(马血清DMEM / F12 2% (HS)),和成肌细胞培养介质4天分化成骨骼肌细胞。19天,UC005-derived MN球体被分离成单一的MNs, MNs被添加到每个菜的肌肉细胞,和媒介的NDM取代,补充了RA,咕噜咕噜叫,BDNF, GDNF, IGF。在1 - 2天,MNs投影轴突,在文化,超过1星期后形成的MNs NMJs肌肉细胞。

2.4。免疫荧光

培养细胞被放置在12毫米盖,固定在4%多聚甲醛(PFA;σ)在室温下10分钟,洗了三次与磷酸盐(PBS,基因族群,中国),和治疗permeabilizing和阻断缓冲区(10%驴血清,0.225% Triton x - 100)在室温下1小时。然后,这些细胞被孵化与以下主要抗体:OCT4(1: 200年,Abcam), Nanog(1: 250年,Abcam) SSEA4(1: 250年,Abcam), TRA-1-60(1: 300年,Abcam) SOX1(1: 300年,博士德),SOX2(1: 300年,博士德),巢蛋白(1:300年,Abcam) Olig2(1: 500年,微孔),Pax6(1: 100年,DSHB) HB9 (1: 50, DSHB), Islet1(1: 250年,Abcam),聊天(1:100年,微孔),TuJ1(1: 250年,Abcam)。所有抗体都是稀释的抗体稀释缓冲(2%驴血清,0.05% triton x - 100),和细胞抗体孵育过夜在4°C。洗三个步骤之后,这些细胞被孵化1小时在室温下与二次抗体:Alexa萤石(488或555)驴anti-mouse anti-rabbit驴,驴抗体。检测乙酰胆碱受体,cocultured细胞孵化与Alexa萤石555 -共轭α-BTX (1μg / ml,英杰公司)为1小时37°C之前固定。细胞被洗2次PBS PFA和固定为4%。所有细胞样品使用奥林巴斯荧光显微镜观察。

2.5。RNA隔离和rt - pcr

神经元标记的信使rna表达水平进行了分析使用逆转录酶聚合酶链反应(rt - pcr)。试剂盒(σ),氯仿,异丙醇,DNase我是用于总RNA提取。然后,0.8μg孤立的RNA是reverse-transcribed cDNA使用PrimeScript™RT大师混合(豆类,京都,日本)。pcr包含1.5μl cDNA、10μ0.8 l Taq(豆类),交货μl引物(表1),7.7μl nuclease-free H2o . 98°C的PCR条件包括2分钟,其次是40 98°C的周期为10秒,30秒65°C, 72°C,持续30秒。pcr, GAPDH被选作为看家基因。

表1
引物用于逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)。
2.6。统计分析

GraphPad棱镜7软件(GraphPad软件)是用于统计分析。提出了结果从三个独立的实验。统计学意义是决定的t以及,结果给出的意味着±标准错误的意思。的 值 , , 被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。描述的万能

在分化过程的开始之前,我们首先分析了多功能属性和万能的纯度。urine-iPSCs和B-iPSCs表现出统一的未分化的形态,包括圆形,大核仁,胞,和有组织的殖民地,类似于胚胎干细胞的特点(ESCs)(图1)[8]。所有iPSC线上面提到,包括UC005 UE017, B-iPSC,经免疫荧光染色的多能性标记,包括OCT4、Nanog TRA-1-60, SSEA4(图2)[9]。


图2
在万能干细胞多能性标记表达式。三个iPSC行,B-iPSC UE017, UC005,多能性标记阳性,包括OCT4、Nanog SSEA4, TRA-1-60。细胞核与4复染色 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)。酒吧是50μm。
3.2。感应小分子的棉结

演示urine-derived万能干细胞分化成MNs的潜力,我们感应B-iPSCs和urine-iPSCs (UE017 UC005) MNs(图1)。MNs的规范,是由以下步骤:中和,caudalization, ventralization [10]。中和,第一步是激活的联合抑制骨形成蛋白(BMP)和转化生长因子β(TGFβ)信号通路11]。的GSK-3β抑制剂通过刺激促进神经祖细胞增殖的规范化Wnt信号通路,导致神经前体的维护(12]。根据这些初步研究[7,13),当iPSC殖民地的融合达到70 - 80%,我们的万能,培养它们附着在新Matrigel-coated盘子,然后取代了媒介NDM,包括BMP / TGF DMH1和SB431542(抑制剂β)和CHIR99021 (GSK-3抑制剂β),引起神经感应。则保持在这些中和条件下6天分化成棉结,表现出明显的形态学变化。不规则,polygon-shaped细胞聚合集中,周边细胞比中央细胞(图1 (b))。采用免疫染色显示积极的标签对棉结的表达神经祖标记SOX1 SOX2,巢蛋白(图3(一个))[14]。大多数的细胞来源于三个iPSC线表示这些pan-neural标记。通过计算阳性细胞,我们确定的积极比棉结源自UC005 (UC005-NEP)和SOX1 SOX2 immunolabeling显著高于B-NEP和UE017-NEP(图3 (b))。rt - pcr也证实神经标记SOX2和巢蛋白的表达(图4)。

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图3
棉结源自urine-iPSCs和B-iPSCs表达神经祖标记。(一)采用免疫染色的神经祖标记。棉结源自三个iPSC行,B-iPSC, UC005, UE017,阳性神经前体标记,SOX1 SOX2,巢蛋白。细胞核与4复染色 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)。酒吧是50μm。(b)的比率正标签SOX1和SOX2棉结后7天的感应。棉结从UC005表达高水平的神经前体标记。正面的标签的比例(%)=(阳性细胞数/总人数)×100%。提出了三个独立实验的结果意味着±标准错误的意思(SEM)。 和 根据学生的t以及。
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图4
(a)的PCR分析mRNA表达水平的神经细胞分化标记在每一个阶段。经过7天的分化,B-NEPs和urine-NEPs表达神经标记,巢蛋白和SOX2。感应额外6天后,细胞来源于三个iPSC行表达了MNP标记,Olig2 Pax6。早在19天的感应,MNs B-iPSCs urine-iPSCs表示MN-specific标记,HB9。这些信使rna表达结果与蛋白表达的结果一致,通过免疫荧光所示。(b)的分化阶段的MNs和标记的细胞则常用的表征。
3.3。有效的神经感应和MN的一代

棉结的进一步归纳和基于指caudalization ventralization,声波刺猬(嘘)被激活的信号通路和风湿性关节炎10]。被暴露于0.1的棉结μ0.5 M类风湿性关节炎,μM Pur(嘘信号通路的激活剂),DMH1,某人,CHIR 6天表现出快速变化形态。在这个阶段,诱导细胞聚集集中并形成圆花饰(图1 (b)),神经管状结构具有分化潜力向中枢神经系统(CNS)和周围神经系统(pn)的命运15]。MNP的玫瑰阳性细胞标记(16),Olig2 Pax6,但外围细胞接壤的玫瑰都是消极的(图5(一个))。采用免疫染色和rt - pcr验证MNP标记的表达urine-iPSC——和B-iPSC-induced基于(数字4和5(一个))。当我们细胞阳性的比率相比MNP标记细胞中所有三个iPSC行,Olig2和Pax6细胞的表达水平来源于B-iPSCs (B-MNPs)和UC005 (UC005-MNPs)明显高于细胞UE017 (UE017-MNPs);此外,Pax6 B-MNPs表达水平明显高于在UC005-MNPs(图5 (c))。

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图5
采用免疫染色和积极的标签和基于和MNs的比率。(a)感应13天后,细胞来源于三个iPSC行,UC005, UE017, B-iPSC, MNP标记为正,Olig2 Pax6。细胞核与4复染色 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)。酒吧是50μm。(b) 19天的感应后,细胞来源于三个iPSC行,UC005, UE017, B-iPSC, MN标记为正,HB9 Islet1。细胞核与4复染色 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)。酒吧是50μm。(c)细胞从UC005 B-iPSC行MNP更高水平的表达比从UE017行细胞标记。(d)的比值正面标签HB9和Islet1基于经过19天的归纳。积极HB9标签的比率是79%,74%,81%,MNs来源于UC005, UE017 B-iPSC,分别,但差别无统计学意义。总共84%的MNs B-iPSC Islet1表示,这明显高于MNs UC005和UE017。正面的标签的比例(%)=(阳性细胞数/总人数)×100%。 , , 根据学生的t以及。
3.4。MN规范和成熟

诱导和基于功能MNs,我们培养和基于悬浮与降低Pur (0.1μRA(0.5米)和增加μ米)(7)再加上BDNF, GDNF, IGF(每10 ng / ml)。6天后在成熟条件下,锰浮动球体形成,就是明证HB9的表达,一个不成熟的运动神经元标记(17],LIM-homeodomain转录因子Islet1 [18)(图5 (b))。正面的标签的比例在B-iPSC-derived HB9 MNs (B-MNs)高于MNs源自UC005 (UC005-MNs)和UE017 (UE017-MNs),但是差异没有统计学意义(图5 (d))。我们试图培养细胞附着在这个阶段以避免损坏分离领域的下一个阶段;然而,积极的标签的比例下降。然后,我们这些锰球分离成单个细胞和基底膜基质上培养Pur, RA和Cpd E切口(抑制剂)。第二天,附着urine-MNs B-MNs投影轴突。当MNs培养在这些条件下超过7天,MNs的进一步成熟和长轴突投射;轴突伸长发生逐渐随着时间的推移(图1 (b))。MN成熟是由神经标记的免疫荧光染色证明TuJ1和成熟MN-specific标记(图聊天6(一))[19,20.]。rt - pcr进一步验证的mRNA表达MN-specific标记HB9 urine-MNs和B-MNs,与免疫荧光观察(图一致4)。

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图6
成熟和功能MNs生成后26天的分化。(一)成熟的MNs采用免疫染色。在诱导条件下超过26天,细胞来源于三个iPSC行,B-iPS, UE017, UC005,表示成熟MN标记胆碱乙酰转移酶(聊天)。他们也表达了神经元TuJ1标志。细胞核与4复染色 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)。(b) Cocultured肌肉细胞和MNs神经肌肉接头形式。免疫荧光染色显示α金环蛇毒素- (BTX -)积极的网站与TuJ1标签覆盖UC005 MNs (A, B, C)。细胞核与4复染色 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)。酒吧是50μm。
3.5。NMJs Urine-MNs和肌肉细胞之间形成的

19天的神经分化,分离UC005-MNs被添加到肌肉培养细胞的菜肴,5天之后,coculturing,肌细胞收缩brightfield显微镜观察。额外的2 - 3天内,免疫荧光染色显示积极的乙酰胆碱受体(乙酰胆碱受体)标记的标签,α金环蛇毒素(α-BTX),表面的肌肉细胞(21)和colocalizationα-BTX和TuJ1网站UC005-MNs的轴突(图6 (b)乙酰胆碱受体),这表明积累和形成NMJs urine-MNs和肌肉细胞之间在这些网站22]。

4所示。讨论

干细胞的定向分化成MNs拥有一个伟大的承诺的体外模型神经退行性疾病和细胞替代疗法(23]。几个协议MN分化已报告(7,24- - - - - -26]。在这些协议中,杜的协议取得了高度纯MNs,由万能干细胞分化人口。迄今为止,不同来源的细胞则包括皮肤成纤维细胞和血液细胞,都用于这些MN差异化协议(27,28]。皮肤成纤维细胞和血液细胞相比,尿细胞更安全、更有效的隔离和重编程(4]。在这项研究中,第一次,我们将演示urine-iPSCs分化成MNs的潜力。我们进一步研究了血液细胞衍生的能力urine-iPSCs分化成MNs的细胞则通过比较神经标记的表达水平。

我们使用Du的差异化协议(7),轻微的修改,诱导和基于分化成成熟的MNs。促进稳定的分化,细胞治疗RA,咕噜咕噜叫,Cpd E,和神经营养因子,这不是一直在增加在杜的协议。万能干细胞分化前的MNs, urine-iPSCs (UC005 UE017)表现出特征的属性已经被,这证实了免疫荧光染色的多能性标记。然后,激活诱导BMP和TGFβ结合GSK-3抑制β发起万能的中和。经过7天的感应,B-iPSCs和urine-iPSCs分化成棉结。神经前体的比率积极的标签标记棉结源自三个iPSC线都大于85%,和UC005-NEPs的比例略高于其他两个细胞系。在随后的6天,RA和Pur导致快速变化形态、花结的形成,upregulation MNP的标记Olig2 Pax6。MNP标记的表达水平在UC005-MNPs B-MNPs UE017-MNPs明显高于。悬挂的进一步分化,细胞来源于三个iPSC线聚集和形成MN球体,这表达了MN标记HB9 Islet1。积极标记前体神经标记的利率和MNP标记细胞UC005明显不同,UE017, B-iPSC,但利率MN的积极的标签标记,HB9,细胞中未达到统计上的显著水平。为进一步MN成熟,RA的联合行动,咕噜咕噜叫,和Cpd E导致成熟的长轴突和表达的投影MN标记,聊天,MNs来自这三个iPSC线。cocultured肌肉细胞时,urine-iPSC-derived MNs展示功能属性,包括对肌肉细胞轴突的投影,肌肉收缩的感应,NMJ的形成。进一步证实了我们采用的观察中,我们使用rt - pcr分析神经元的信使rna表达水平和MN-specific标记。 In all three iPSC lines, we detected expression of neuronal markers (SOX1, Nestin, Pax6, and Olig2) and the MN-specific marker, HB9.

总之,神经细胞标记物的表达谱,用免疫细胞化学和rt - pcr表明urine-iPSCs能够成功地分化成MNs。之间形成NMJs MNs和肌肉细胞进一步表明urine-MNs的功能性质。此外,MN的比率的比较积极的标签标记表明urine-iPSCs的能力和B-iPSCs分化成MNs不是明显不同。但是,有一些重要的方面,我们没有调查,如体外诱导MNs的电生理特性(29日]。此外,移植MNs MND的动物模型对于未来的研究是必要的细胞再生医学(30.]。上面提到的这两个方面将在我们未来的探索研究。在这项研究中,我们演示了区分urine-derived万能干细胞成MNs的可行性。自urine-derived则以非侵入性的方式,可以很容易地访问urine-derived万能干细胞疾病建模提供一种新型的平台,MND的药物筛选、细胞治疗。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

桓伊进行了实验,分析数据,并写了草稿。范冰冰谢,本Liu玄王,李许,刘贾,李敏收集和分析数据。秀峰钟和富华彭的构思和设计实验和撰写并批准了手稿。富华彭监督这个项目。

确认

作者要感谢Guangjin潘教授(中国科学院广州生物医药与健康研究院)提供两个尿液细胞衍生iPSC行,UE017 UC005。这项研究得到了广东省自然科学基金(没有。2015 a03013167),广州科技项目基金(1563000227)、国家自然科学基金(81271327和81271327),广东省科技项目(2017年2014 a020211008 2015 a020212011, b020230003),和中国国家重点研发项目(2012年2016 yfc1101103 2017 yfa0104101, cb966500)。