文摘
间充质干细胞(msc)是出名的导航网站受伤的细胞损伤的响应信号。然而,干细胞细胞因子如何招募目标组织机制仍不清楚。在这项研究中,我们发现interleukin-1 proinflammation细胞因子β(il - 1β)促进间充质干细胞迁移。互补脱氧核糖核酸微阵列的数据表明,il - 1β诱发矩阵metalloproteinase-1(金属蛋白酶- 1)的表达。然后我们使用定量实时PCR和金属蛋白酶- 1 ELISA来验证结果。小干扰rna转染MSC、金属蛋白酶- 1和il - 1 MSC预处理β抑制剂interleukin-1受体拮抗剂(IL-1RA), MMP的金属蛋白酶组织抑制剂1 (TIMP1)、金属蛋白酶2组织抑制剂(TIMP2)、金属蛋白酶- 1抑制剂GM6001, protease-activated受体1 (PAR1)抑制剂SCH79797证实PAR1蛋白信号通路导致il - 1β全身的细胞迁移。总之,il - 1β促进金属蛋白酶- 1的分泌,然后激活PAR1 G-protein-coupled信号通路促进间充质干细胞迁移。
1。介绍
脐带间充质干细胞具有多种属性,使其感兴趣的来源的细胞治疗使用[1]。干细胞迁移到受损组织在伤口愈合和组织再生(扮演关键角色2]。假设组织损伤或凋亡发布网站招募干细胞受损的因素,然后动员干细胞增殖和分化来取代受损组织(3,4]。人们已经发现,系统注入间充质干细胞具有迁移能力受伤或发炎组织网站,起到治疗作用5]。然而,干细胞的归巢功能所涉及的机制仍不完全清楚。最近的研究表明,炎症和缺血性组织可能释放细胞因子或生长因子如基质细胞衍生因子(SDF) 1α转化生长因子- (TGF -)β1、单核细胞趋化蛋白- 1 (MCP),肿瘤坏死因子(TNF),α和白细胞介素(IL)促进间充质干细胞归巢受伤的区域(2,6]。一些细胞因子和生长因子受体存在于间充质干细胞,包括interleukin-1受体(IL-1R) [7]。
Interleukin-1β起着重要的作用在许多器官炎症和组织损伤。il - 1β参与一系列细胞功能,包括细胞增殖、分化和凋亡。il - 1β同样促进细胞迁移和导航通过激活下游蛋白激酶级联,导致炎性蛋白的表达(8]。此外,它已被观察到,il - 1β提高淋巴细胞和嗜酸性粒细胞细胞粘附和transendothelial迁移9,10]。有研究表明,il - 1β能够诱导基质金属蛋白酶(MMP)表达式的不同类型,可降解细胞外基质,促进细胞迁移(8,11- - - - - -14]。据报道,il - 1β全身的金属蛋白酶- 1的表达在软骨细胞ERK激活(15]。
细胞迁移是一个复杂的过程包括细胞外基质的解体,分离细胞的基底膜,细胞迁移从原始位置,内渗到目标组织,与目标微环境和交互(16]。细胞外基质的分解需要蛋白水解酶的作用,如基质金属蛋白酶是zinc-dependent肽链内切酶(17]。基质金属蛋白酶分泌活性的酶原或发酵菌,被激活的乳沟prodomain [18]。根据底物特异性和结构、基质金属蛋白酶分为几个子组:胶原酶(如金属蛋白酶- 1),明胶酶(如MMP-2和MMP-9) stromelysins(例如,MMP-3和MMP-10), matrilysins(例如,MMP-7和MMP-26),和膜式矩阵metalloproteinase-1 (MT1-MMP)。特别是,间质胶原酶(金属蛋白酶- 1)被发现参与乳腺癌的入侵19]。Stromal-derived金属蛋白酶- 1已被证明裂开并激活G-protein-coupled受体PAR1,导致细胞内信号的激活规范入侵过程在乳腺癌细胞20.]。最近,金属蛋白酶- 1的功能作用在干细胞的迁移活动进行了研究。何鸿燊et al。21)发现目标击倒的内生金属蛋白酶- 1抑制间充质干细胞在体外的迁移能力。
先前的研究表明,炎性细胞因子,如转化生长因子- (TGF)β1、肿瘤坏死因子(TNF)α,il - 1β在干细胞增加基质金属蛋白酶的生产,导致强烈的刺激趋化迁移通过细胞外基质(2,22]。这些发现表明,干细胞的归巢能力的增强可以通过调制的间充质干细胞对各种生长因子和细胞因子的反应。
Protease-activated受体(PAR) 1是一个G-protein-coupled受体识别与发现的第一个凝血酶受体(23,24]。PAR1激活凝血酶和其他trypsin-like serine-like蛋白酶是基于蛋白酶裂开的n端结构域的释放受配体受体结合受体的细胞外循环,随后激活G-protein-coupled信号转导(25]。PAR1在组织修复中起着核心作用,纤维化炎症、神经退化,动脉粥样硬化和再狭窄26- - - - - -28]。据报道,金属蛋白酶- 1在肿瘤恶化方面发挥重要作用通过激活PAR1 [20.]。此外,PAR1被发现参与癌症的侵袭性和转移性过程的乳腺癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、黑色素瘤(20.,29日- - - - - -32]。此外,何鸿燊et al。21)报道,金属蛋白酶- 1相互作用的干扰和PAR1严重减少了干细胞的迁移能力,表明的重要性MMP-1-PAR1信号轴调节间充质干细胞的迁移能力。
在这项研究中,我们表明,proinflammation细胞因子il - 1β促进间充质干细胞移植,可以抑制IL-1RA。此外,我们发现,il - 1β可以增加金属蛋白酶- 1分泌(33]。由于金属蛋白酶- 1分泌的抑制TIMP1, TIMP2,小干扰rna转染GM6001金属蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶- 1,PAR1激活和干细胞移植被抑制了。通过使用IL-1RA (il - 1β抑制剂)和SCH79797 (PAR1抑制剂),干细胞的迁移能力也降低了。综上所述,我们认为,il - 1β介导干细胞迁移涉及金属蛋白酶- 1的表达,然后激活PAR1最后影响间充质干细胞迁移通过信号转导通路。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
人脐带间充质干细胞维持low-serum定义中:56%低杜尔贝科的修改鹰介质(表达载体、钙、美国),37% MCDB 201(σ,密苏里州,美国),2%胎牛血清(热,洛根,UT), 0.5毫克/毫升白蛋白(σ,密苏里州,美国),1 x insulin-transferrin-selenium-A(表达载体、钙、美国),1 x抗生素抗真菌的解决方案(热,洛根,UT), 10 nM地塞米松(σ,密苏里州,美国),50μ米l抗坏血酸2-phosphate(σ,密苏里州,美国),10 ng / ml表皮生长因子(美国新泽西州PeproTech),和1 ng / ml血小板源生长factor-BB(美国新泽西州PeproTech)。细胞在37°C和5%孵化有限公司2。当细胞融合达到70 - 80%,他们分离HyQTase(热,洛根,UT)和山肩的比率1:4。
2.2。细胞因子和抑制剂
采用无血清细胞培养被渴望16小时DMEM含有0.1%牛血清白蛋白然后处理2μg / ml il - 1β抑制剂IL-RA(美国新泽西州PeproTech)细胞因子刺激前2小时。MMP抑制剂TIMP1和TIMP2(美国新泽西州PeproTech)和金属蛋白酶- 1抑制剂GM6001(默克公司,达姆施塔特,德国)il - 1之前添加到细胞培养2小时β刺激在45纳米浓度,45 nM制程,分别和50 nM。100海里PAR1抑制剂SCH79797(轴突Medchem、格罗宁根、荷兰)添加到细胞培养2小时前刺激如前所述。在表示时间,细胞被孵化12-48小时与人类重组il - 1 100 ng / mlβ(美国新泽西州PeproTech)这些抑制剂的继续存在。
2.3。细胞生存能力分析
镀细胞在无血清DMEM 24-well板块含有0.1% BSA 16小时和刺激人类重组il - 1 0 - 500 ng / mlβ18个小时。PrestoBlue™细胞生存能力试剂直接添加细胞培养基和孵化30分钟37°C。结果发现使用多模微型板块读者(200年无限,Tecan)。
2.4。MTT试验
细胞被镀在96 -孔板12 - 16个小时在无血清DMEM含有0.1% BSA和刺激人类重组il - 1 100 ng / mlβ36小时。5-dimethyl-2-thiazolyl MTT测定试剂(3 -(4日)2,5-diphenyl-2H四唑溴化;美国赛瓦、海德堡、德国)直接添加细胞培养基和孵化4小时37°C,然后DMSO(σ,密苏里州,美国)添加了2个小时。结果发现使用多模微型板块读者(200年无限,Tecan)。
2.5。微阵列分析
总RNA分离间充质干细胞有或没有il - 1β刺激和IL-1RA刺激。RNA质量检查与人类基因组RNA电泳前组合U133 2.0阵列芯片(Affymetrix)。互补脱氧核糖核酸检测和原始数据从国立阳明大学获得VYM基因组研究中心。
2.6。定量实时聚合酶链反应
刺激后,细胞收获和总RNA提取使用TriPure隔离试剂(Bioline、伦敦、英国)根据制造商的指示。RNA与在泰特罗cDNA合成转化为cDNA工具包(Bioline、伦敦、英国)。以下寡核苷酸被用于每个基因:金属蛋白酶- 1正向引物5-GATGGACCTGGAGGAAATCTTG-3和金属蛋白酶- 1反向引物5-TGAGCATCCCCTCCAATACC-3和GAPDH正向引物5-GGAGTCAACGGATTTGGTCGTA-3和GAPDH反向引物5-GGCAATATCCACTTTACCAGAGT-3 。
分析了基因表达定量实时PCR使用SensiFAST CYBR Hi-ROX系统(Bioline、伦敦、英国),并且每个反应是三个一组的重复。
2.7。金属蛋白酶- 1酶联免疫吸附试验
48小时后与il - 1的刺激β,条件中收集。金属蛋白酶- 1蛋白表达的定量和人类活动是使用RayBio执行金属蛋白酶- 1酶联免疫试剂盒(美国佐治亚州RayBiotech)。结果发现使用分光光度计波长450 nm读者(nd - 1000, NanoDrop)。
2.8。西方墨点法
细胞被洗PBS和m /哺乳动物细胞溶解的蛋白质提取试剂(美国热,IL)停止蛋白酶抑制剂鸡尾酒(美国IL热),然后在14000离心机在4°C为10分钟收集细胞提取事先批准。蛋白质浓度测定与Coomassie + (Bradford)蛋白质测定试剂(美国热,IL)使用多模微型板块读者(200年无限,Tecan)。蛋白质样本解决10%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到聚偏二氟乙烯膜(默克公司,达姆施塔特,德国)。膜被封锁在10%鱼明胶阻断缓冲区(Amresco,哦,美国)1小时,然后用反孵化PAR1主要抗体的活性形式(σ,密苏里州,美国)1:2500稀释和ERK 1/2和phospho-ERK 1/2主要抗体(细胞信号技术、马、美国)1:2500稀释在一夜之间在4°C。渐变的墨迹与Tris-buffered盐水洗20 (TBST)和孵化与山羊anti-rabbit二级抗体室温1小时。膜被洗了,然后被一个增强化学发光底物使用发光成像系统(美国拉斯维加斯4000年,通用电气)。
2.9。金属蛋白酶- 1核小干扰rna转染寡核苷酸和消极的控制
金属蛋白酶- 1消音器选择预先设计siRNA (s8847 s8848, Ambion,奥斯汀美国)和消音器选择消极的控制。1(美国奥斯汀Ambion)被用来表达下调细胞中金属蛋白酶- 1的表达。细胞在6-well盘子镀前24小时与5 nM MMP-1-specific转染核或消极控制核使用lipofectamine RNAiMAX转染试剂(表达载体、钙、美国)。
2.10。伤口愈合实验
细胞被播种在细胞培养插入(ibidi、Planegg、德国)24-well盘子和培养,直到汇合的。细胞被饿死在无血清DMEM含有0.1% BSA 16小时前添加抑制剂。与抑制剂IL-1RA孵化后(2μg / ml), TIMP1/2 (45 nM), GM6001 (50 nM),和SCH79797为2小时(100海里),细胞培养插入从24-well板取出,处理100 ng / ml il - 1β。金属蛋白酶- 1 siRNA-transfected细胞组被播种在24-well盘子和培养,直到支流加入il - 1β(100 ng / ml)。倒置显微镜观察细胞迁移,和图片是同样的刺激每6小时后24小时。
2.11。在体外入侵检测
8.0入侵检测进行μ米孔隙大小基底膜基质入侵室(美国康宁,MA)。基底膜基质(美国康宁,MA)在冰融化和液化,然后30μl的基底膜基质添加到24-well transwell插入和固化37°C孵化器30分钟形成一层薄的凝胶。细胞被播种在6-well盘子和培养,直到汇合的。采用无血清细胞培养是12 - 16个小时饿DMEM含有0.1%牛血清白蛋白然后IL-1RA(处理2μg / ml) il - 1前2小时β刺激。在表示时间,细胞被孵化为36小时100 ng / ml il - 1β在这些抑制剂的继续存在。与HyQTase细胞被分离,15000个细胞在无血清DMEM加载到上人工基底膜室,并完成MSC介质被添加到众议院。经过18个小时的潜伏期在37°C, nonmigrated细胞在参议院被用棉签,和细胞迁移到下议院是固定的,与结晶紫染色(σ,密苏里州,美国)。
2.12。统计分析
使用SPSS统计分析软件(版本16.0)。定量实时PCR、ELISA和伤口愈合细胞试验数据分析了学生的t以及。值< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。il - 1β促进间充质干细胞迁移和入侵
体外迁移都使用了伤口愈合试验。结果表明,100 ng / ml il - 1β加强干细胞迁移,而il - 1β拮抗剂IL-1RA可以抑制il - 1β全身的细胞移植治疗后il - 1β18个小时(数字1(一)和1 (b))。Matrigel-coated transwell入侵检测显示,而il - 1β增强的间充质干细胞入侵,IL-1RA可以抑制il - 1β全身的MSC入侵能力(数据1 (c)和1 (d))。细胞生存能力分析表明,il - 1β500 ng / ml的浓度有细胞毒性的迹象。细胞生存能力没有显著改变100 ng / ml il - 1β治疗组比对照组(图18个小时1 (e))。MTT细胞增殖测定il - 1显示无显著变化β对msc与对照组相比(图1 (f))。这些结果表明il - 1β全身的干细胞迁移和入侵并没有受到细胞增殖的影响。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.2。il - 1β在间充质干细胞促进金属蛋白酶- 1的表达
识别的分子通路参与干细胞的迁移,il - 1的基因表达谱β治疗细胞和参与细胞芯片技术测定使用人类基因组U133 2.0数组(Affymetrix)。数组结果分析,我们发现,金属蛋白酶- 1和il - 1在间充质干细胞治疗显著调节β(图2(一个))。金属蛋白酶- 1的mRNA表达定量实时PCR证实了。图2 (b)表明,il - 1金属蛋白酶- 1的转录水平β治疗细胞高于参与细胞24小时后。确认金属蛋白酶- 1的表达是由il - 1介导的β我们进行预处理细胞il - 1β抑制剂IL-1RA。结果表明,这种抑制剂显著抑制il - 1β全身的金属蛋白酶- 1的表达。这些研究结果与我们的微阵列数据一致。
(一)
(b)
(c)
为了进一步证实金属蛋白酶- 1的表达与il - 1的干细胞治疗β,金属蛋白酶- 1蛋白表达水平的量化使用ELISA。如图2 (c)金属蛋白酶- 1表达明显高于il - 1β干细胞治疗的价格相比对照组48小时后。il - 1β全身的金属蛋白酶- 1表达被IL-1RA抑制(图2 (c))。综上所述,这些研究结果表明il - 1β在间充质干细胞促进金属蛋白酶- 1的表达。
3.3。il - 1β介导的细胞迁移取决于金属蛋白酶- 1的分泌
检查是否观察到的间充质干细胞迁移能力受到金属蛋白酶- 1的表达,MMP抑制剂TIMP1和TIMP2小干扰rna转染GM6001金属蛋白酶抑制剂和金属蛋白酶- 1被用于实验。结果表明,干细胞文化对待TIMP1和TIMP2同时抑制金属蛋白酶- 1蛋白表达(图3(一个))。伤口愈合实验表明细胞接受TIMP1和TIMP2减毒il - 1β全身的细胞迁移(数据3 (b)和3 (c))。与另一个金属蛋白酶- 1抑制剂预处理GM6001也减少了il - 1β全身的细胞迁移(数据3 (b)和3 (c))。金属蛋白酶- 1核转染的msc降低il - 1β全身的细胞迁移(数据3 (d)和3 (e))。免疫印迹显示msc预处理和TIMP1/2 GM6001减毒il - 1β全身的ERK 1/2磷酸化(图3 (f)),这表明il - 1β全身金属蛋白酶- 1表达参与激活ERK 1/2信号级联。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.4。金属蛋白酶- 1介导的il - 1β调节PAR1的激活
在最近的研究中,G-protein-coupled受体PAR1被发现被金属蛋白酶- 1裂解并激活,促进癌细胞的迁移和入侵20.,34]。在il - 1调查PAR1是否起到作用β全身的金属蛋白酶- 1表达间充质干细胞,PAR1免疫印迹分析与MMP抑制剂TIMP1和TIMP2文化进行预处理,金属蛋白酶- 1抑制剂GM6001(图4(一)),和IL-1RA(图4 (b))。结果显示明显减少活性的表达形式的PAR1(数字4 (c)和4 (d))。金属蛋白酶- 1核转染的msc敲波动至少80%的il - 1β全身的金属蛋白酶- 1释放介质(数字4 (e)和4 (f))。结果表明,金属蛋白酶- 1核转染显示转染效率高。小干扰rna转染金属蛋白酶- 1的msc、免疫印迹显示il - 1β全身PAR1表达式是减毒(图4 (g))。这些研究结果表明,金属蛋白酶- 1诱导il - 1β调节PAR1的激活。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
3.5。il - 1β-PAR1信号轴影响干细胞迁移
确定il - 1β刺激MSC迁移,伤口愈合化验进行与PAR1抑制剂SCH79797文化进行预处理。数据5(一个)和5 (b)表明,il - 1β全身的干细胞是减毒SCH79797时添加到细胞,从而证明il - 1β全身的间充质干细胞迁移是由与PAR1交互。
(一)
(b)
4所示。讨论
间充质干细胞归巢和已报告长期移植到相应的靶组织(35]。在过去的十年中,已经证实炎症细胞因子或生长因子是迁徙的线索在间充质干细胞移植到受伤的地区。这些信号包括基质细胞衍生因子(SDF) 1α转化生长因子- (TGF -)β1、单核细胞趋化蛋白- 1 (MCP),和肿瘤坏死因子(TNF)α(2,6]。
在这项研究中,我们已经表明,proinflammation细胞因子il - 1β在间充质干细胞迁移过程中发挥作用。il - 1β提高干细胞移植,但并不影响细胞增殖。一些研究表明,il - 1β可能激活下游蛋白激酶级联,导致炎性蛋白的表达(8]。此外,它已经表明,il - 1β可以刺激淋巴细胞和嗜酸性粒细胞细胞迁移9,10]。使用DNA微阵列分析,我们的结果表明,金属蛋白酶- 1在il - 1显著调节β治疗的干细胞。这证实了~ 35-fold更高层次的金属蛋白酶- 1 il - 1的记录β治疗的干细胞相比,在参与细胞使用实时PCR。金属蛋白酶- 1的mRNA表达进一步支持ELISA:干细胞治疗il - 1β被证明分泌大量的金属蛋白酶- 1到上层的文化。金属蛋白酶- 1是一种基质金属蛋白酶降解胶原蛋白I型,据报道,TGF -的条件中β1-treated脂肪干细胞可以增加纤维母细胞金属蛋白酶- 1的表达,促进细胞迁移(36]。
最近,Boire等人发现PAR1金属蛋白酶- 1受体,促进乳腺癌细胞的入侵和肿瘤发生在体外和体内20.]。施等人证明了阻塞PAR1乳沟和激活抑制前列腺癌细胞的入侵和趋化作用[37]。在我们的研究中,PAR1蛋白质的活性形式表达下降了il - 1β抑制剂IL-1RA。最近的一项研究报告中存在GM6001干细胞文化阻碍细胞迁移collagen-based入侵检测(38]。看来,金属蛋白酶- 1在细胞外基质降解过程中发挥作用,进一步直接影响细胞运动。使用MMP抑制剂TIMP1和TIMP2,金属蛋白酶- 1抑制剂GM6001,小干扰rna转染和金属蛋白酶- 1,我们表明,il - 1β全身PAR1表达被抑制。此外,使用PAR1抑制剂SCH79797,我们表明,阻止MMP-1-PAR1交互作用显著降低il - 1介导的迁移能力β在干细胞。因此,看来金属蛋白酶- 1表达水平和金属蛋白酶- 1的具体交互PAR1确定干细胞的迁移能力。此外,何鸿燊et al。21)表明,金属蛋白酶- 1中扮演一个重要的角色在间充质干细胞的迁移功能,操作通过MMP-1-PAR1信号轴。
在未来,茎细胞的导航功能可以提供重要的临床应用的基础细胞干细胞作为抗癌疗法在肿瘤39)和再生医学。几个因素影响干细胞的归巢潜力应该考虑,包括间充质干细胞的能力应对迁徙的刺激、生理障碍阻碍干细胞迁移,和身体的炎症微环境。鉴于干细胞的特点,一系列的治疗策略可以探索增强导航能力(2]。总之,这项研究的结果表明,il - 1β介导的金属蛋白酶- 1的表达与干细胞迁移,MMP-1-PAR1信号轴是参与il - 1β介导的金属蛋白酶- 1的表达在促进间充质干细胞迁移(图6)。
信息披露
本文的部分代表是2014年在海报ASCB / IFCB会议。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项工作是由科学技术部的科研补助金,台湾(大多数- 104 - 2320 - b - 010 - 009 - my3)和教育部的资助,目的为顶尖大学Hwai-Shi王的计划。