微rna - 132,由间充质干细胞液,促进心肌梗死血管生成

文摘

背景。治疗缺血性疾病,血管生成需要改善缺血性地区通过各种策略。考虑到微rna - 132 (mir - 132)行为调节内皮细胞在血管生成和小分子核糖核酸的安全和有效的交付在活的有机体内很少实现,理想mir - 132交付的工具可以为缺血性疾病带来的承诺。作为一种天然生物分子的载体,液越来越发达的microrna的转移是一种理想的工具。与此同时,间充质干细胞能释放大量的液囊。因此,本研究旨在探讨是否MSC-derived液可用于mir - 132交付治疗心肌缺血。方法。MSC-derived液electroporated mir - 132模拟和抑制剂。电穿孔后,mir - 132液和DiI和HUVECs添加标签。的内化DiI-labelled液被荧光显微镜检查。mir - 132的表达水平液和HUVECs量化实时PCR。mir - 132目标基因的mRNA水平在HUVECs RASA1被实时PCR量化。荧光素酶报告实验进行检查针对mir - 132和RASA1之间的关系。mir - 132液的影响内皮细胞的血管生成能力被管形成试验评估。基底膜基质堵塞试验和心肌梗死模型被用来确定mir - 132液能促进血管生成在活的有机体内。结果。mir - 132模拟是有效electroporated和高度检测MSC-derived液。mir - 132的表达水平高HUVECs preincubated mir - 132 mimic-electroporated液低HUVECs preincubated mir - 132 inhibitor-electroporated液。RASA1的表达水平,mir - 132目标基因,是相对地与mir - 132表达HUVECs用液预处理。荧光素酶报告实验进一步证实,RASA1 mir - 132的直接目标。液含有mir - 132、作为microrna的车辆转让、显著增加管内皮细胞的形成。此外,皮下注射HUVECs用mir - 132预处理液裸体小鼠显著增加他们的血管生成能力在活的有机体内。此外,移植mir - 132液在小鼠的缺血性心脏明显增强的新血管形成peri-infarct区和保护心脏功能。结论。研究结果表明,mir - 132的出口通过MSC-derived液代表一个新策略来提高缺血性疾病的血管生成。

1。介绍

在急性缺血性心肌缺血等疾病,血液流向心脏受损。船舶需要再生挽救缺血级联。Neoangiogenesis可以提高通过激活内源性祖细胞,提供外源性干细胞和/或治疗性血管生成等分子信使rna或小分子核糖核酸1,2]。

小分子核糖核酸,一类小非编码rna(包含约在18到22岁的核苷酸),调节基因的表达直接绑定到3未翻译区(3utr)目标mrna和诱导转化的抑制和/或降解。小分子核糖核酸被认为参与生物发展,细胞分化,细胞凋亡,以及其他许多生理和病理过程3]。最近,多个证据表明,mir - 132线调节内皮细胞的许多流程包括血管生成反应(1,4,5]。2010年,Anand等人证明upregulation mir - 132积极控制病理性血管生成针对血管内皮生长因子A (VEGF-A)通过抑制p120RasGap (RASA1) [4]。Katare等人进行的一项研究报道,最近周皮细胞祖细胞表达和分泌mir - 132起来从而促进内皮血管生成通过调制methyl-CpG-binding蛋白2 (MeCP2) [1]。此外,mir - 132的强大的proangiogenic效果已被证实在小鼠后肢缺血模型。研究表明,mir - 132可能发挥他们proangiogenic效果提高Ras-mitogen-activated蛋白激酶(MAPK)信号通路通过直接抑制RASA1和Spred15]。

细胞外液是纳米囊泡(直径30 - 100 nm)和CD9是积极的,CD63、研究。类型的膜泡,液已经被认为是一个工具,促进细胞间的沟通和调节受体细胞的功能虽然提供蛋白质,RNA和其他分子成分(6]。液有许多非凡的属性,比如稳定性、生物相容性、低免疫原性,运载工具。液的广泛分布在血液、尿液、支气管肺泡灌洗液,母乳,滑液,胸膜腔积液,腹水证明液耐受性良好在生物体液(7]。运载工具的另一个高度期望的属性是家里目标位置的能力。越来越多的证据表明,取决于他们的细胞来源、表面抗原,和内容,液可以瞄准特定细胞类型(8,9]。这些属性的应用提供一个理由液治疗运载工具在大范围的疾病,如心血管疾病、肾损伤、免疫疾病、神经系统疾病和癌症(9,10- - - - - -13]。

液细胞类型特定的内容和变化从不同病理条件下14,15]。需要考虑适当的细胞类型和丰富的液的优化。最近,据报道,间充质干细胞(msc)能够分泌大量的功能液。研究也表明,MSC-derived液有显著proangiogenic功能心肌梗死(MI)和后肢缺血模型10,16]。

在这项研究中,我们提出,mir - 132,由MSC-derived液,可以发挥在心肌梗死血管生成的影响。我们调查的血管生成影响mir - 132 electroporated液来自msc在体外和在活的有机体内,以及底层机制。我们对待HUVECs mir - 132液,发现mir - 132是调节受体细胞,而目标基因RASA1 HUVECs表达下调。mir - 132 HUVECs两液促进血管生成在体外和在活的有机体内。此外,移植mir - 132液在小鼠的缺血性心脏明显增强的新血管形成peri-infarct区和保护心脏功能。我们的研究代表了一种潜在的血管再生和战略有重要意义对缺血性疾病的新治疗方法。

2。材料和方法

2.1。动物

老鼠购自南京大学实验动物中心(中国南京)。动物们被安置在特定的无菌条件下,用12小时光/暗周期和免费的食物和水。动物实验是苏州大学的伦理委员会批准。所有的努力都是尽量减少动物痛苦。

2.2。细胞培养

骨骨髓来源间充质干细胞(bmsc)孤立基于先前报道的过程(17];骨髓细胞被刷新股骨和胫骨骨腔的用1毫升注射器低糖杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)。骨髓细胞都是通过一个70μm细胞的过滤器。获得的骨髓细胞被播种到培养皿和孵化37°C在湿润的气氛中含有5%的股份有限公司₂与C57BL / 6小鼠间充质干细胞生长培养基(Cyagen,广东,中国)。bmsc的表现型(P4-P6)被确定通过流式细胞术,利用抗体鼠标CD31、CD44、CD105和本来。人类脐静脉内皮细胞(HUVECs;中国科学院上海细胞库,中国)在EGM2补充5%胎牛血清培养根据制造商的指示。所有实验进行之前通过7。

2.3。隔离和净化MSC-Derived液

msc在DMEM / F12培养补充10% exosome-free的边后卫。48小时后,液分离得到BMSC上层清液如前所述[10]。短暂,得到上层清液和离心机在200 g×30分钟在4°C去除细胞碎片。后来,上层的涨跌互现,总外来体隔离试剂(美国表达载体)一夜之间在4°C。使离心后10000×g 1 h,小球然后仔细resuspended在200年μl PBS和立即使用或储存在−80°C。分析这些液特征表面标记蛋白液的成分进行免疫印迹和外来体形态观察和透射电子显微镜(TEM) (JEOL jem - 1230)详细如前所述。

2.4。为液装载mir - 132

Resuspended液稀释在基因脉冲发生器电穿孔缓冲区(Bio-Rad实验室、CA) 1: 1的比例。1μ摩尔的鼠标mir - 132模拟(纽约Ambion)或抑制剂添加到200μl的外来体样本。混合物被转移到冷0.2厘米电穿孔试管和electroporated 150 V / 100μF电容使用基因脉冲发生器II系统(Bio-Rad实验室、CA)如前所述18]。删除后自由浮动的microrna的模仿,液使用超速离心法分离。最后的颗粒(外来体)resuspended在PBS和存储−80°C。

2.5。外来体标签和内化

液(250μg)与1标签μM DiI的亲脂性的染料(表达载体)。孵化后30分钟37°C,多余染料与PBS被清洗,并将液被超速离心法分离(如上所述)。收件人HUVECs (3×10⁵)与DiI-labelled孵化液(10μ为2 h g),固定在4%多聚甲醛(PFA) 10分钟在室温下,用PBS为三次,孵化与DAPI(1: 500年,英杰公司)在室温下5分钟,并受共焦显微镜使用蔡司LSM与100 x 780共焦显微镜放大( )。

2.6。管状结构形成分析

2×10⁴/好HUVECs(每组三个复制)被播种在基底膜基质(BD生物科学)96孔板和治疗的空白液,mir - 132模拟electroexosomes,分别或electroexosomes mir - 132抑制剂。孵化后37°C 6 h,倒置显微镜观察管形成的(德国徕卡DMI6000B)和网络结构的累积管长度是量化使用ImageJ软件(4 x放大)。

2.7。基底膜基质堵塞血管生成试验

基底膜基质堵塞血管生成进行了化验如前所述[19];2.5×10⁵HUVECs服用30μg(液)或车辆控制(DMEM),预拌与基底膜基质(1毫克/毫升,BD生物科学)、DMEM和皮下注入SCID雄性老鼠(6周, 在腹股沟区域)。14天之后,动物牺牲使用过量的麻醉剂。插头是切除和执行后续的免疫荧光测定。

2.8。急性心肌梗死模型和评估心脏功能

急性心肌梗死(AMI)生成在老鼠如前所述20.]。简而言之,C57BL / 6 j小鼠(女,~ 20克)与氯胺酮麻醉(80毫克/公斤,IP)和机械通风。左冠状动脉前降的(小伙子)与6 - 0的结扎缝合,和动物们被分成四组:生理盐水控制,mir - 132, Exo-null,外面的132。小伙子结扎后,每个老鼠收到PBS的心肌内的注入,mir - 132,正常的外来体,或mir - 132 - electroporated外来体,分别。总共有20μl包含PBS的盐水,mir - 132,或液(600μg)是由心肌注射移植结扎站点附近的自由墙左心室。

上执行超声心动图心脏功能是由3天,7日和28 MI后,使用Vevo 2100系统(VisualSonics Inc .,多伦多,加拿大)和一个80 MHz调查。左心室的参数是从二维图像使用M-mode审讯记录在震区视图中。最后,老鼠牺牲收获心脏组织的免疫组织化学分析。

2.9。免疫组织化学分析

进行免疫组织化学染色法检测血管基底膜基质密度插头和心脏组织如前面所描述的21]。新鲜的组织样本固定在4%多聚甲醛(PFA),然后嵌入在10月,切成6μ米厚片。阻塞后3%牛血清白蛋白(BSA)为30分钟,随后被孵化的部分在一夜之间在4°C的主要抗体CD31。二次抗体山羊anti-mouse Alexa 594 (1: 500;生命技术)是用于检测。细胞核与4,复染色6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)。图像被使用荧光显微镜观察(奥林巴斯)。

2.10。Dual-Luciferase记者分析

阐明RASA1是否mir - 132的目标基因,TargetScan (http://targetscan.org)是用来预测microrna分子调节RASA1,和mir - 132被认定为潜在的RASA1调节器。野生型(WT)和突变体种子区域的mir - 132 3utr RASA1基因被克隆到pMIR-REPORT荧光素酶报告质粒(美国表达载体)。质粒与WT或突变体3utr DNA序列是cotransfected mir - 132模拟(100海里;Sangon生物科技有限公司、上海、中国)或负控制模拟成HEK293T细胞(写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)。在37°C 24小时培养后,细胞化验使用dual-luciferase试验系统(美国麦迪逊Promega)根据制造商的指示。所有化验都至少重复三次。

2.11。定量rt - pcr检测

总RNA分离液或HUVECs使用试剂盒试剂(美国英杰公司)如前所述22),使用微rna逆转录系统执行反转录(GenePharma、上海、中国)或PrimeScript RT试剂盒(豆类、日本)。mir - 132的表达水平,分析了SYBR绿色试验根据制造商的指示,使用U6控制。RASA1,定量rt - PCR (Q-PCR)混合使用SYBR PCR执行主人的ABI起义步检测系统(美国应用生物系统公司)根据制造商的指示。引物用于RASA1如下:意义,5-TTATGATGGGAGGCCGCTATT-3 ,和反义:5-CTGCATTGGTACAGGTTCCTT-3 。GAPDH是作为内部控制。2−ΔΔCT法确定相对mRNA的表达。每个试验进行了一式三份。

2.12。免疫印迹分析

西方墨点法进行量化具体bmsc蛋白表达水平和BMSC-derived液。样本细胞溶解与含有蛋白酶抑制剂的缓冲区里帕鸡尾酒(美国罗氏),蛋白质含量是由BCA化验(美国罗氏公司)。相等数量的蛋白质被加载并运行在10% sds - page凝胶,然后转移到聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)。每个膜被5% BSA和随后孵化一夜之间在4°C anti-CD9 anti-CD63,分别。洗后,膜与peroxidase-conjugated孵化山羊anti-mouse二级抗体(美国表达载体)。图像分析与图像污点量化进行了定量拉斯维加斯4000微型生物分子成像(通用电气医疗集团,乌普萨拉,瑞典)。

2.13。统计分析

的所有数据在体外实验获得至少三个独立的实验。在在活的有机体内研究中,超过6每组中使用的样本。的结果意味着±SD除非另有指示,并使用GraphPad棱镜5软件进行了分析。统计分析使用的小动物——一张长有学生以及或单向方差分析与事后测试来确定组之间的显著差异。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。描述的bmsc和BMSC-Derived液囊

msc被孤立于C57BL / 6小鼠骨髓内如前所述。msc通常是纺锤状(图和附着在塑料碗1(一))。流式细胞仪是用来识别msc的表面抗原。结果表明,msc对CD31不利,但本来就积极,CD44, CD105(图1 (b))。液分泌bmsc的孤立中描述的材料和方法和生物化学和生物物理分析。隔离液的生物化学分析显示外来体蛋白质的存在CD63, CD9(图1 (c)),而没有CD63的表达和CD9是bmsc检测。电子显微镜分析液表现出典型的杯状容器形态和确认的尺寸范围小于150纳米(图1 (d))。此外,一个重要mir - 132超表达是检测到存在与mir - 132(图electroporated msc1 (e))。

3.2。mir - 132液由HUVECs有效了

液和HUVECs贴上CM-DiI染料和孵化在体外。使用一个倒置荧光显微镜,我们提供了定性的证据表明HUVECs占用DiI-labelled液源自bmsc(图2(一个))。接下来,我们执行qPCR评估HUVECs mir - 132的表达。我们观察到显著增加mir - 132表达的HUVECs mir - 132模拟electro-Exos,相比空白HUVECs和HUVECs mir - 132抑制剂electro-Exos(图2 (b))。值得注意的是,RASA1的表达,mir - 132的目标基因,显著下调(图2 (c))。荧光素酶报告实验被用来进一步确认目标mir - 132和RASA1之间的关系。结果表明,mir - 132显著下降的相对荧光素酶记者活动野生型RASA1 3utr,而突变RASA1 3utr没有显著变化,这表明mir - 132可以直接绑定到3utr RASA1(图2 (d))。

3.3。mir - 132 electroporated液促进血管生成在体外

我们调查是否mir - 132 electroexosomes可以提高内皮细胞的血管生成的行为在体外。管长度和网格的数量增加HUVECs mir - 132处理模拟electroexosomes 12 h,相比接受空白液和mir - 132缓蚀剂electroexosomes(数字3(一个)- - - - - -3 (c))。就是明证管形成试验,我们的研究表明,中mir - 132可以提高proangiogenic外来体对内皮细胞的影响。

3.4。mir - 132 electroporated液促进血管生成在活的有机体内

最后,我们利用人工基底膜塞检查在活的有机体内血管生成的行为。基底膜基质含有HUVECs HUVECs处理空白的外来体,或HUVECs mir - 132处理模拟electroexosome皮下注入SCID雄性老鼠( 分别在腹股沟区域。14天之后,人工基底膜切除和照片来评估血管的存在。包含mir - 132的基底膜基质插头外来体表现出明亮的红色指示blood-perfused船只,而空白exosome-containing插头提出光黄颜色与有限的新血管的形成(图3 (d))。此外,免疫荧光染色显示,船舶的数量包含mir - 132的插头液(29.33±2.86 /高通滤波器)也显著高于消极控制(6.33±2.05 /高通滤波器)和那些包含空白液(20.33±2.05 /高通滤波器)(数据3 (e)和3 (f))。

3.5。mir - 132 electroporated液保护心脏功能,促进血管生成在小鼠心肌梗死模型

我们评估了在活的有机体内疗效mir - 132液的小鼠心肌梗死模型。Preinterventional左心室射血分数(LVEF)和部分缩短(FS)值在所有组相似(数据没有显示)。显著减少LVEF和FS saline-treated小鼠观察7天,MI后28天。与saline-treated老鼠相比,mir - 132和正常的外来体组部分获救MI-induced减少LVEF和FS,虽然mir - 132外来体组LVEF明显增加(7天:30.18±0.94和48.04±1.27, ,28天:31.56±0.83和51.97±1.32, 、职责)和FS(7天:12.21±1.16和19.87±1.17, ,28天:11.80±0.25和21.33±0.64, resp)。相比之下,saline-treated老鼠在7天,MI(数据后28天4(一)和4 (b))。心被切除MI后28天。心脏组织的毛细血管密度进一步检查,免疫组织化学染色。相比saline-treated集团(19±2.45 /高通滤波器),无论是mir - 132(33.33±3.40 /高通滤波器)和正常的外来体组织(32.67±3.09 /高通滤波器)有更高的血管密度。更重要的是,梗塞面积的毛细血管密度显著增加mir - 132外来体组(50±1.63 /高通滤波器)、(数据4 (c)和4 (d))。这些数据表明,mir - 132 electroporated液能有效地保护心脏功能,促进血管生成在小鼠心肌梗死模型。

4所示。讨论

在本文中,我们表明,液含有mir - 132,作为一个媒介,microrna的马车和转让,显著增加管形成在体外和基底膜基质neoangiogenesis插头和心肌梗死。从力学上看,mir - 132促进血管生成的表达下调目标基因的表达水平在HUVECs RASA1。这些研究结果极大地扩展我们目前了解液对血管生成和显示液给鼓舞人心的希望的车辆治疗缺血性疾病的分子治疗。

缺血性心脏病(IHD)是全球发病率和死亡率的主要原因由于衰老、肥胖、糖尿病和其他共病疾病(23]。IHD的有效的治疗方法之一是诱导血管再生,因此,增加氧气供应,抑制心肌细胞凋亡,减少心肌纤维化。小分子核糖核酸是小非编码rna作为蛋白编码基因的负调控。好了,小分子核糖核酸促进生理和病理血管生成(4,24]。大量的治疗策略基于小分子核糖核酸进行了心肌梗塞等缺血性疾病的治疗(2,20.,22]。

细胞间通讯发生直接(通过缝隙连接相邻细胞)或间接(在很长的距离,通过可溶性因子和细胞外囊泡,包括液)。这些囊泡作为车辆的蛋白质、RNA和其他分子组分调节细胞间的沟通。以前的研究报道,microrna的表达改变液源自msc可以保护缺血再灌注损伤,促进血管生成在急性心肌梗死(10,25]。所有的这些发现表明,液,自然治疗运载工具,发挥着重要的作用在血管生成10,26]。此外,液可以很容易地存储在−20°C至少6个月没有失去生物活性(27]。液可能更容易生产和标准化的剂量和生物活性。

根据之前的研究,我们选择mir - 132功能的得失HUVECs用electroporated预处理液,调查的角色exosome-transferred proangiomiRs血管生成。外生mir - 132模拟和抑制剂成功electroporated MSC-derived液囊,这是表明,加载可以被HUVECs液。装载液有效地交付mir - 132模拟成HUVECs,导致增加mir - 132,和功能提升管基底膜基质中形成和neoangiogenesis插头和心肌梗死。相反,在液抑制mir - 132的表达来自msc导致血管生成减少。这些发现表明,细胞外mir - 132是加载到液,转移到内皮细胞和血管生成中发挥了至关重要的作用。

此外,调查mir - 132的分子机制可能促进血管生成,我们专注于目标基因RASA1。RASA1被报道是一种进化保守的目标mir - 132 (5]。先前的研究已经表明,RASA1作为至关重要的负调节血管萌芽和血管分支。此外,其他研究显示,RASA1行为调节内皮细胞在血管生成HUVECs通过灭活Ras-mitogen-activated蛋白激酶(MAPK)信号通路5]。我们的研究结果表明,增加mir - 132的表达导致HUVECs RASA1水平显著降低。这与先前的观察是一致的数据4]。为了证实mir - 132和RASA1之间的交互,我们执行dual-luciferase记者分析,证明RASA1 HUVECs mir - 132的是一个真正的目标。

总之,我们发现mir - 132 electroporated液促进血管生成在体外和在活的有机体内。MSC-derived液可以被视为一个潜在的治疗性血管生成候选人特别是缺血性疾病。液源自msc具有理论优势作为药品,,在不久的将来,液可能获得偏好在整个细胞疗法在再生医学的学科。

缩写

硕士:	间充质干细胞
小姐:	心肌梗死
3utr:	3未翻译区
VEGF-A:	血管内皮生长因子A
RASA1:	p120RasGap
MeCP2:	Methyl-CpG-binding蛋白2
MAPK:	Ras-mitogen-activated蛋白激酶
DMEM:	杜尔贝科鹰介质的修改
HUVECs:	人类脐静脉内皮细胞
透射电镜:	透射电子显微镜
PFA:	多聚甲醛
小伙子:	左前降枝动脉
DAPI:	4,6-Diamidino-2-phenylindole
BSA:	牛血清白蛋白
WT:	野生型
PVDF:	聚乙二烯二氟化物
LVEF:	左心室射血分数
FS:	部分缩短
死因:	缺血性心脏病。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

伦理批准

实验协议是苏州大学的伦理委员会批准(参考编号SZUM2008031233)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

腾马Yueqiu陈,陈Yihuan Qingyou孟贡献同样这项工作。所有作者了,阅读,和最后的手稿提交批准。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(81770260号,81400199),中国国家临床重点专科的心血管手术,和江苏心血管外科临床研究中心(BL201451)和江苏省自然科学基金(BK20160346和BK20151212)。

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