Hypoxia-Mimetic代理氯化钴不同影响人类间充质干细胞在Chondrogenic潜力

文摘

成体干细胞是一种很有前途的软骨再生的细胞来源。他们居住在一个特殊的微环境被称为干细胞利基,特点是低氧浓度的存在。二氯化钴(CoCl₂)模仿缺氧体外稳定低氧诱导因子-α(HIF-1α),这是主监管机构在细胞缺氧适应性反应。在这项研究中,CoCl的影响₂chondrogenic潜在的人类msc、牙髓隔绝,脐带,和脂肪组织调查。细胞治疗CoCl的浓度₂从50到400不等μHIF-1 m细胞的可行性α蛋白质合成,chondrogenic标记的表达进行了分析。结果表明,CoCl₂补充没有影响细胞的生存能力,而upregulation chondrogenic标记如SOX9, COL2A1, VCAN,能依赖的细胞来源。这项研究表明,缺氧,CoCl引起的₂治疗,可以以不同的方式影响msc的行为,从不同来源分离,chondrogenic潜力。这些发现应该考虑治疗软骨修复和再生基于干细胞疗法。

1。介绍

透明关节软骨有非常有限或没有内在的修复能力和较小的病变或病态外伤可能触发渐进损伤和关节退行性变(1]。早期干预是必要的,以避免创伤性关节软骨和骨软骨缺损的发展,延缓软骨退行性变和骨关节炎。

提出了新颖的细胞组织工程技术,目的是修复软骨缺损和重建透明软骨的属性。间充质基质细胞(msc),由于高增殖能力,自我更新,和潜在的分化成不同的血统,在再生医学(代表一个有前途的战略2]。msc是分开几个人体组织如骨髓(3),滑膜组织(4),脂肪组织(5,6),骨膜(7,8),牙髓(9和沃顿商学院的果冻脐带10]。

msc的微环境的特点是低氧张力,证明msc可能相当耐氧的限制(11]。氧浓度激活细胞内的变化机制的细胞死亡或负责细胞适应新环境条件(11,12]。低氧条件的适应性反应的关键是稳定的低氧诱导因子(HIF)——113]。作为一个转录因子,它起着至关重要的作用在许多基因的功能表达的适应和生存的细胞,组织和器官。转录因子HIF-1由两个亚基,HIF-1α和低氧诱导因子-β或芳基碳氢化合物核转运蛋白受体(ARNT) [14]。在常氧和缺氧条件下,低氧诱导因子-β不断生物合成、降解和回收(15]。HIF-1α在正常氧条件,尽管是生物合成,受到瞬时分解(16]。在常氧条件下,HIF-1α由氧依赖性polyhydroxylated prolyl (P4HS)和arginyl羟化酶(富士康)。一旦羟化,HIF-1α蛋白质结合冯Hippel-Lindau (VHL)肿瘤抑制蛋白识别组件的E3 ubiquitin-protein ligases-and正迅速被蛋白酶体降解。在缺氧条件下,羟基化抑制,从而导致HIF-1的稳定α和积累在细胞核中(14,17]。所有P4Hs 2-oxoglutarate加双氧酶,需要铁^{2 +}2-oxoglutarate,阿₂,抗坏血酸盐。因此,即使O小幅下降₂浓度会抑制HIF-P4Hs这样HIF-1的活动α逃避退化(17]。

最近的证据表明,缺氧是参与chondrogenic msc分化[18]。骨骨髓来源的扩张和chondrogenic诱导msc在缺氧通常导致增强chondrogenic分化,而他们在分化成脂肪形成的显示能力降低,成骨的血统(19- - - - - -21]。

在体外研究中,缺氧引起的通常是减少大气中的氧气浓度或利用模拟氯化钴(CoCl等化学制剂₂)和desferrioxamine(柴油)。化学药剂在实验室里更有吸引力,因为他们很便宜,他们维持稳定的氧张力,低氧室相比,他们更稳定。他们通过阻止人为诱导缺氧HIF-1的退化α(22]。氯化钴抑制HIF-P4Hs的活动报道,富士康,这表明它可能占领他们的铁^{2 +}结合位点和块HIF-1的退化α(17]。是证明hypoxia-mimetic代理相媲美的影响造成了大气氧含量(17]。

尽管一些研究缺氧预处理对MSC分化的影响,缺氧的影响对MSC的行为仍然是一个问题的讨论。他们对缺氧的反应条件的数据是相当有争议的,证明损害和改善效果。本研究旨在比较低氧的影响,引起CoCl₂,在msc源自人类牙髓,脂肪组织,和沃顿商学院的果冻脐带,在缺氧条件下应对chondrogenic感应。

2。材料和方法

2.1。间充质干细胞

人类脂肪间充质干细胞(ADMSCs)从英杰公司购买(生活技术,蒙扎,意大利)。人类牙髓间充质干细胞(DPMSCs)获得健康永久在矫正治疗前磨牙中提取,在知情同意(9]。人脐带间充质干细胞(UBMSCs)从组织获得足月妊娠的脐带。知情同意是获得每个病人根据国家生物伦理委员会的指导方针,和样品处理后协议博洛尼亚大学的批准。所有的细胞都维持在37°C和5%的股份有限公司₂在DMEM / F12 Glutamax®介质(Gibco,热费舍尔,蒙扎,意大利)与10%的边后卫(补充v/v)和1% (v/v青霉素和链霉素(Gibco,热费舍尔,蒙扎,意大利)。在这项研究中,所有的细胞都在段落之间使用4和7。

2.2。Immunophenotyping

DPMSCs, UCMSCs, ADMSCs检查其表面标记由FACSCalibur流式细胞仪系统概要(美国,正欲CA)已经描述(8,9,23]。短暂,msc脱离表面的烧瓶与酶消化3分钟在室温下,收集,离心机在300年5分钟。丸resuspended在缓冲区和染色的细胞被血细胞计数器计数。然后,2.5×10⁵细胞被孵化了45分钟,在黑暗中在4°C,以下抗体:异硫氰酸荧光素(FITC)——标记鼠标反人类的CD90(干细胞技术,意大利米兰),CD105, CD14,和CD19 (Diaclone、法国);R-phycoerythrin——(PE)标记鼠标反人类的CD34, CD44, CD45 (Diaclone、法国),和CD73(美国,正欲CA);和anti-HLA-DR (Diaclone、法国)。控制FITC -或PE-coupled IgG1抗体是同型的老鼠。数据评估使用CellQuest软件(美国,正欲CA)。

2.3。二氯化钴治疗和MTT试验

细胞被播种在96 -文化板块1×10的密度⁴细胞/ 24小时。培养基是改变新鲜MEM含有2%的边后卫和1%的抗生素和不同浓度处理CoCl₂从50到400不等μm . 24小时和48小时后,改变了媒介与一个新的补充0.5毫克/毫升的3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT) 3 h 37°C。产生的甲瓒被溶剂溶解溶液(0.1 N盐酸异丙醇),和光学密度是由微型板块的读者阅读570海里(680型,Bio-Rad实验室Inc .、钙、美国)。

2.4。HIF-1α蛋白表达

100年的msc治疗μM CoCl₂6小时、12小时、24小时、48小时,胞质中提取获得了通过使用里帕裂解缓冲(皮尔斯,热费希尔科学,蒙扎,意大利)补充25μmol / L蛋白酶抑制剂鸡尾酒(皮尔斯,热费希尔科学,蒙扎,意大利)和1μL (β-mercapto-ethanol (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。总蛋白质被解决在4 - 12% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS - page)和electrophoretically转移到硝酸纤维素使用湿吸水装置(表达载体,热费希尔科学,蒙扎,意大利)。奶粉的膜被封锁(表达载体,热费希尔科学,蒙扎,意大利)在室温下30分钟,然后被孵化与反人类的HIF-1α稀释1:400(表达载体,热费希尔科学,蒙扎,意大利),和反人类的肌动蛋白,稀释1:1000(细胞信号技术、莱顿、荷兰)在4°C。洗后传输缓冲区(TBS-T),每个污点是孵化antirabbit二级抗体(1:5000稀释;细胞信号技术、莱顿、荷兰)在室温下1 h和30分钟。抗体与增强化学发光信号可视化系统(皮尔斯,热费希尔科学,蒙扎,意大利)。图像通过使用图像站2000 r(美国纽约柯达)。

带微测量使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院),和特定的蛋白带的强度相等的肌动蛋白加载纠正;他们表示为相对于对照试样的强度。数据显示,一式三份的平均值±SD,代表三个独立的实验。

2.5。Chondrogenic分化

msc, micromass文化,刺激了MEM补充的边后卫和100年的2%μM CoCl₂在chondrogenic培养基培养48 h,然后是组成与2%的边后卫,MEM补充10 ng / mL的TGF -β3(微孔、米兰、意大利),100 nm地塞米松(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),100年μg / mL ascorbate-2-phosphate (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国),其(6.25μ6.25 g / mL胰岛素μ6.25 g / mL转铁蛋白,μg / mL亚硒酸)(Gibco热费希尔科学,蒙扎,意大利)7、14、21、28天。chondrogenic介质是每三天更换一次。控制样品由msc培养在MEM micromass系统补充10%的边后卫28天。

在每个治疗,细胞收集和RNA提取和实时定量PCR(存在)。

2.6。信使rna提取和存在

RNeasy迷你包(表达载体,热费希尔科学,蒙扎,意大利)被用于提取RNA的细胞球,和200 ng总RNA反转录成第一链cDNA使用上标™三世一步法rt - pcr系统(表达载体,热费希尔科学,蒙扎,意大利)。Chondrogenic mRNA表达水平标志进行了分析通过实时PCR 7500实时PCR仪(应用生物系统公司,生活技术,蒙扎,意大利)。信使rna量化,TaqMan化验(生活技术,热费希尔科学、意大利蒙扎)具体用于胶原蛋白II型(COL2A1;Hs00264051_m1),胶原蛋白类型10 (COL10A1;Hs00166657_m1)、Sox9 (Sox9;Hs01001343_g1), versican (VCAN;Hs00171642_m1)和aggrecan(能;Hs00153936_m1)。相对基因表达水平正常化的3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH;Hs99999905_m1)。 Data are presented as fold changes relative to levels in control samples by using formula 2^−ΔΔCT制造商推荐的(用户通讯号码2 P / N 4303859;应用生物系统公司)。

2.7。阿尔新蓝和红色染料O染色

刺激了msc MEM补充的边后卫和100年的2%μM CoCl₂48 h micromass文化,然后他们培养chondrogenic媒介如前所述。在每个实验的结束点,msc立即固定在4%甲醛(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)在磷酸缓冲(PBS) 24小时在4°C。然后,他们在一系列分级脱水乙醇和嵌入在石蜡(丙烯酰胺,Sigma-Aldrich)。石蜡的6μm得到一个自动旋转切片机(徕卡Microsystems Srl,剑桥,英国)和收集Superfrost玻片(卡尔·罗斯,Karlshure,德国)。样本随后处理为阿尔新蓝染色用阿尔新蓝和红色染料O染色试剂盒(Bio-Optica、米兰、意大利)。利用图像代表三个独立的实验。

2.8。统计分析

MTT和实时PCR值提出了均值±标准差,和每种类型的实验重复三次。一维方差分析Dunnett紧随其后的多重比较测试是用来评估样本之间的差异。统计分析是由GraphPad Prism 5.0软件(GraphPad软件公司,圣地亚哥,美国)。< 0.05的值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。Immunophenotyping

msc用于所有的实验特点CD105, CD14、CD19、CD34、CD45、CD73, CD90, HLADR使用流仪分析。发现这些细胞是高度积极CD105, CD73,和CD90 CD34(> 95%)和消极,CD19、CD45、CD14、HLA-DR(< 3%)(数据没有显示)8,9,23]。此外,他们能够分化成所有的间叶细胞谱系(数据没有显示)8,9,23]。

3.2。MTT试验

评估CoCl的潜在毒性₂msc细胞,MTT试验测试不同浓度的CoCl₂,从50μΜ400μ米,进行24小时和48 h。结果显示高细胞生存能力在所有三个msc检测24小时和48小时(数字1(一)和1 (b))。观察光还原的可行性后48 h和400的浓度μM(图1 (b))。100的浓度μM显示最高的细胞生存能力在24小时和48小时;因此,这个浓度是用于所有以下实验。

3.3。HIF-1α表达式

与CoCl确定治疗₂负责的upregulation转录因子HIF1吗α6 h后蛋白质的表达,12 h, CoCl 24小时和48小时₂博览会是由西方墨点法评估分析(图2)。

显然,没有区别控制和治疗观察样品通过免疫印迹,在整个msc(数据进行测试2(一个)- - - - - -2 (c))。光密度分析的蛋白质带显示时间upregulation HIF-1αDPMSCs和UCMSCs,评估在ADMSCs(图没有显著差异2 (d))。CoCl后48 h₂孵化,HIF-1的表达α在DPMSCs增加约4.4倍,UCMSCs(图2 (d))相比,在每一个控制样本。

3.4。Chondrogenic分化DPMSCs、UCMSCs ADMSCs缺氧

确定如果缺氧,引起CoCl_2,提高chondrogenic分化,DPMSCs、UCMSCs ADMSCs preincubated 100μM CoCl₂48 h,然后他们被chondrogenic诱导chondrogenic分化培养基28天。在每个实验,chondrogenic的基因表达标记SRY-box包含基因9 (SOX9),一个关键的转录因子对软骨细胞分化,II型胶原蛋白(COL2A1) versican (VCAN)和aggrecan(能),下游SOX9的目标,评估中存在(图3)。

DPMSCs显示大约三倍的转录因子的upregulation SOX9 7天后chondrogenic分化,其次是减少表达式后,14日,21日,感应(图28天3(一个))。的upregulation VCAN也观察到后7日,14日,21日,chondrogenic刺激(图28天3(一个)),而没有放大检测到相应mRNA COL2A1并能(图3(一个))。

UCMSCs显示一个依赖于时间的upregulation chondrogenic标记测试(图3 (b))。SOX9 mRNA水平达到最高水平后21天的分化,而14天后观察COL2A1 mRNA表达的区别,增加了大约5倍后28天(图3 (b))。VCAN mRNA显示光时间upregulation,而能mRNA的表达显著增加了21和chondrogenic分化(图28天3 (b))。

相反,ADMSCs显示一个常数的表达SOX9,比较能控制样品(图3 (c)),而一个upregulation表达检测COL2A1和信使rna能最终chondrogenic感应(图3 (c))。

证明没有肥厚性软骨形成,存在评估肥厚性chondrogenic标记的表达,胶原蛋白类型进行了。结果显示低信号后10 UCMSCs和DPMSCs胶原蛋白类型的分化(图28天4),而ADMSCs显示胶原蛋白类型的光但显著upregulation 10比控制样品(图4)。

3.5。阿尔新蓝和红色染料O染色

展示在细胞外基质蛋白聚糖的存在产生的msc刺激chondrogenic分化到28天,阿尔新蓝和红色染料染色。阿尔新蓝结果显示了强烈的蓝色UCMSCs和ADMSCs(图产生的细胞外基质5),而一个非常DPMSCs检测到光信号。这些数据是由番红精O染色,这展示了一个清晰的红色,相应的蛋白多糖沉积,在UCMSCs ADMSCs,虽然没有红色的信号中检测出DPMSCs(图5)。

4所示。讨论

关节软骨损伤造成运动伤害,意外创伤,和老化一般发展到更严重的关节疾病,包括骨关节炎(OA),软骨下骨的坏死,或关节炎(1,2]。透明关节软骨有或没有内在的修复能力非常有限,甚至轻微病变或损伤可能会触发渐进损伤和关节退行性变1]。目前的治疗方法,基于外科干预措施,仍不能令人满意,常常伴随纤维软骨的发展(2]。如今,修复和再生的透明软骨仍然是一个挑战。提出了新颖的细胞组织工程技术与生物工程,目的是修复缺陷组织,模仿透明软骨的属性和有助于融入本地组织。移植msc是一种很有前途的战略基于高增殖能力,自我更新和分化成cartilage-producing细胞的潜力。然而,生物障碍仍然坚持MSC-based再生关节软骨的1]。重建软骨的力学性能不如原生组织,和初始细胞群和异质性差矩阵沉积导致的功能限制msc (1]。

越来越多的证据表明,环境预处理是一种强大的方法在促进干细胞增殖和chondrogenic潜力(24]。在本机软骨细胞暴露在非常低的氧张力促进MSC生存、增殖和分化能力24]。然而,数据对缺氧的影响对MSC行为仍然是矛盾的和缺氧的作用尚不清楚。

本研究的目的是比较三个人类的行为msc、牙髓分开,沃顿商学院的果冻脐带,脂肪组织,引起缺氧环境下chondrogenic表型。

DPMSCs的选择、UCMSCs ADMSCs这项研究反映了他们的易接近的来源,简单协议隔离,没有伦理问题和简单的可用性。他们代表了干细胞和再生医学治疗的理想来源。虽然DPMSCs、UCMSCs ADMSCs看起来非常相似,他们显示特定原产地特有的组织,分散他们对缺氧的反应和组织再生。

氯化钴化学hypoxia-mimetic代理,是一个有吸引力的替代创建物理缺氧代理(25- - - - - -27]。CoCl的潜在毒性₂在本研究调查不同msc利用MTT分析。100年细胞生存能力得到的最高水平μ米的CoCl₂24小时和48小时后,在所有的三个msc测试。因此,100年μM是氯化钴的浓度在这项研究中,利用在协议与先前的调查鼠干细胞(21]。预处理100μM CoCl₂进行DPMSCs、UCMSCs ADMSCs 48 h,缺氧预处理的方法,目的是促进chondrogenic分化(24]。缺氧对细胞施加其影响的机理主要是由HIF-1监管α移植多个基因参与葡萄糖代谢,红细胞生成,铁运输、血管生成和软骨形成11,13,24]。确认CoCl引起的缺氧状态₂,HIF-1的存在α蛋白质是评估。结果显示一个依赖于时间的upregulation HIF-1αDPMSCs和UCMSCs,而未经处理的控制,而不增加HIF-1的表达式αADMSCs检测,而控制样本。因此,CoCl₂成功地模仿了缺氧条件DPMSCs UCMSCs但失败了,导致缺氧microenviroment ADMSCs。我们的数据是在协议与以前的结果在小鼠骨髓间充质干细胞(21),人类牙周韧带msc (26],DPMSCs [25由CoCl)在缺氧诱导₂引发了HIF-1α途径。

由CoCl缺氧的影响,诱导₂,随后调查chondrogenic DPMSCs的潜力,UCMSCs, ADMSCs。细胞之前CoCl对待₂48 h,然后诱导chondrogenic分化到28天显示不同的结果有关的mRNA表达chondrogenic标记分析。在DPMSCs,而转录因子表达SOX9, VCAN有增加,没有表达COL2A1和能。这些发现表明缺氧的抑制作用,chondrogenic分化,与之前的数据相一致人类牙周韧带msc和DPMSCs CoCl引起的组织缺氧₂博览会抑制成骨分化和增强干细胞标记的upregulation REX1 OCT4、负责维护具备干细胞(26]。

ADMSCs类似的结果,其中CoCl缺氧诱导的₂治疗诱导chondrogenic感应疲软,预计由于缺少upregulation HIF-1α蛋白质免疫印迹观察到。一些研究调查ADMSCs的缺氧对分化的影响产生了不一致的和对比的结果(28]。发现氧张力在2 - 5%显著影响ADMSCs的分化能力,同时保持脂肪形成的氧张力在1和1.5%,成骨,chondrogenic分化(29日]。Fotia和他的同事们(29日)报道,缺氧增强ADMSC扩散和维护multipotency地位,允许在特定谱系分化存在适当的因素。然而,他们展示了chondrogenic分化由阿尔新蓝染色没有任何定量数据的mRNA表达chondrogenic标记。其他研究已经表明,低氧张力增加了ADMSC具备干细胞标记表达和增殖率没有改变他们的形态和表面标记(30.,31日]。低氧张力进一步提高chondrogenic分化能力但减少了脂肪形成的和成骨分化潜能32- - - - - -34]。相反,Pilgaard和他的同事们(34)表明,缺氧预处理并没有表现出一个增强人类ADMSCs chondrogenic分化,与我们的结果一致。我们假设CoCl的浓度更高₂或CoCl更长的持续时间₂可能需要补充诱导对ADMSCs缺氧的影响。

在我们的研究中,UCMSCs展示最好的缺氧预处理后chondrogenic表型和chondrogenic感应到28天。所有的chondrogenic标记显示upregulation表达比未经处理的控制样本,由阿尔新蓝和红色染料染色,转录因子的高表达HIF-1α,负责upregulation下游chondrogenic基因。先前的研究表明,化学缺氧,引起100人μM CoCl₂,诱导增殖和线粒体保护和没有改变人类UCMSCs[的分化能力35]。Reppel和他的同事们(36]报道增加chondrogenic分化当沃顿jelly-derived人类msc在缺氧扩大,与我们的结果一致。

5。结论

我们的数据表明,缺氧对msc chondrogenic分化的影响依赖于细胞来源。UCMSCs更容易chondrogenic分化和nonhypertrophic软骨形成,比DPMSCs ADMSCs,这些特性可以相关捐赠组织的性质和不同的缺氧环境的脐带相比,脂肪组织和牙髓37- - - - - -39]。这些发现应该在考虑干细胞再生策略对未来的选择。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

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