连接蛋白n端肽作为一个潜在的干细胞软骨再生的刺激因素

文摘

背景。连接蛋白n端肽(垂直距离)软骨细胞外基质(ECM)可能导致软骨蛋白聚糖的合成和胶原蛋白II型细胞。软骨干细胞/祖细胞(中海壳牌)、内源性干细胞软骨,软骨变性和再生很重要。我们假设垂直距离可能刺激干细胞软骨再生的影响中海壳牌的生物学行为。方法。中海壳牌从大鼠膝关节软骨分离。我们评估促进垂直距离对扩散的影响,移民和chondrogenic中海壳牌的分化。基因和蛋白质的chondrogenic differentiation-related量化。三维的中海壳牌进行文化TGF -的存在β3或垂直距离,收获丸进行了分析评估软骨再生的垂直距离的函数。结果。垂直距离刺激中海壳牌和加速site-directional迁移的扩散。高表达SOX9,胶原蛋白II, aggrecan在中海壳牌处理垂直距离。垂直距离显示更明显的特色丸治疗的软骨样分化比TGF -β3所示。结论。垂直距离显示,软骨再生医学应用前景通过刺激增殖,迁移,chondrogenic软骨干细胞/祖细胞的分化。

1。介绍

关节软骨与内在修复能力是不够的,因为它的无血管的和无力的结构。相当大的创伤或累积损伤关节软骨损害,导致变性疾病症状和生活质量影响1]。

更高效的修复软骨的再生医学提供了各种试验。而能力形成的黄金标准是自体软骨软骨组织工程种子细胞,软骨干细胞/祖细胞(中海壳牌),分组人口位于正常和退化人工关节(2- - - - - -4),被寄予厚望的原位修复能力。它参与体内平衡的维护过程中软骨变性(5)和符合软骨再生的种子细胞的要求。

关节内注射生长因子在软骨修复被认为是有用的。(骨形成蛋白(bmp)6转化生长因子-β3 (TGF -β3)(7),胰岛素样生长因子- 1 (igf - 1) (8)等已经在以前的研究调查。但这些生长因子也表明有活动在软骨组织9,10),这对于长期影响是有害的。作为最常见的生长因子应用于软骨组织工程,TGF -β3半衰期较短,结果进退两难,当它存在于联合太久,TGF -β3将增强炎症(9),但短期应用软骨再生的可能是不够的。潜在的致肿瘤性也是一个不利的临床应用TGF -β3 (11]。链接蛋白质、糖蛋白,存在于人类椎间盘和关节软骨(12),起着重要的作用在加强aggrecan之间的绑定和透明质酸(13]。连接蛋白n端肽(垂直距离)是裂解n端16个氨基酸肽蛋白(DHLSDNYTLDHDRAIH)的链接。垂直距离被认为是链接的功能片段的蛋白质的交联(14,15]。本地和biochemistry-synthesized形式的垂直距离影响促进II型胶原蛋白的合成和蛋白聚糖在人类椎间盘(16和其他软骨细胞体外17,18),这使它另一个软骨再生医学。

在这项研究中,我们专注于垂直距离的影响扩散,迁移,chondrogenic大鼠软骨干细胞/祖细胞的分化是否垂直距离可以作为CSPC-based软骨再生的刺激因素。

2。材料和方法

2.1。多肽合成

肽垂直距离(DHLSDNYTLDHDRAIH)代表人类的共识序列n端连接蛋白质合成后的标准固相肽合成方法由浙江ONTORES生物技术有限公司(杭州)。肽是由电喷雾质谱分析的特点和纯度高于92%。质量报告是补充所示1。

2.2。隔离和中海壳牌的文化

所有动物研究依照批准的协议进行了华中科技大学动物实验委员会。从表面软骨细胞收集的女性Sprague-Dawley老鼠(年龄在8周,200克~ 250克)8小时后与0.25% II型胶原酶消化37°C和过滤150μm过滤器。然后,细胞在DMEM / F12 resuspended(美国HyClone)和稀释至4000毫升的密度⁻¹。中海壳牌通过纤连蛋白分离粘附试验如前所述[2,19]。简单地说,10厘米的菜肴被涂上一层10μ英国g / mL纤连蛋白(σ)0.1米MgCl磷酸盐(PBS)包含1毫米₂和1毫米CaCl₂(PBS +)一夜之间在4°C。2×10 ^ 4细胞被播种到涂层板10分钟粘附在37°C。然后,中型和不依从细胞被移除。美国低葡萄糖DMEM / F12 (HyClone)含10%胎牛血清(的边后卫)和1%的青霉素和链霉素,完整的培养基,添加进盘子,每隔一天再次进行进一步的文化。当它达到80% ~ 90%融合,细胞消化0.25%胰蛋白酶+ 0.02% EDTA(美国Gibco)分析或扩大文化。

2.3。流式细胞术

通道1的软骨干细胞/祖细胞在PBS resuspended浓度为1.0×10 ^ 6毫升⁻¹能整除的为200μL在试管(美国BD352052)和离心机在1500 rpm, 5分钟去除胰蛋白酶和EDTA。由此产生的细胞被孵化解决抗体CD90、CD73, CD105, CD44, CD34,或者HLA-DR 37°C为30分钟。除此之外,另一个示例是resuspended PBS和设置为校准。标记细胞被冲洗,然后被二次抗体在37°C 15分钟。抗体的信息用于本研究。细胞被洗两次,200年resuspendedμL FACS-Buffer之前他们的流式细胞术分析流式细胞仪石中剑(Becton Dickinson和公司、美国)。抗体信息如表所示1。

2.4。Multilineage分化潜力分析

中海壳牌被播种到24-well板块的浓度2×10 ^ 4 /。对于成骨分化,当达到80% ~ 90%的细胞融合,文化媒体取代0.5毫升成骨诱导分化培养基(Cyagen生物科学公司,美国)包含10%的边后卫,10 nM地塞米松,10毫米β甘油磷酸盐,0.1毫米L-ascorbic acid-2-phosphate。感应介质取代了彼此的一天。4周后,这些细胞被冲洗和固定4%甲醛。茜素红染色后,执行指令的制造商。

对脂肪形成的差异化,媒介是变成脂肪形成的微分介质(从Cyagen生物科学公司,购买美国)感应,当文化达到完全融合。三天后,脂肪形成的微分媒体B (Cyagen生物科学公司,美国)用于24小时维护。四个周期后,B细胞与脂肪形成的微分媒体孵化6天。油红O (Beyotime,中国)染色用于脂质检测,这将显示脂滴在红褐色。

2.5。细胞毒性和扩散垂直距离的测定

细胞计数Kit-8 (Dojindo、日本)分析了96 -孔板与不同的中海壳牌播种密度来决定最优协议以下实验。在细胞毒性测试中,中海壳牌被播种在96孔板的密度1×10 ^ 4 / 10%和孵化的边后卫培养基过夜。后粘附,细胞无血清培养系统对不同浓度的垂直距离。扩散试验,然而,1×10 ^ 3细胞被播种到每一个包含垂直距离好,10%的边后卫培养基培养。在两个实验中,媒介是改变了每隔一天。细胞计数Kit-8化验进行1日,3日,第五天细胞后播种。

2.6。划痕试验

中海壳牌被播种到six-well盘子和汇合的单层培养。后一个“抓”的细胞层200μL吸管,文化与PBS轻轻冲洗丢弃垃圾。采用无血清细胞培养介质有或没有48小时的垂直距离。迁移是由相衬显微镜和照片记录用计算机程序进行了分析。

2.7。趋化性测试

分析了影响垂直距离的趋化因子通过24-well microchemotaxis室(美国康宁公司)8μm-pore聚碳酸酯过滤器。加入一定量垂直距离降低车厢的趋化性室10 ng / mL的浓度或采用无血清100 ng / mL。在另一组,媒介与10 ng / mL TGF -补充β3(美国PeproTech Inc .)提供的比较。DMEM / F12在低作为负控制每个实验(基底迁移)。上室载有100人μL细胞悬液(2×10 ^ 4细胞)和孵化37°C,湿度5%二氧化碳95%。24小时后,过滤器和PBS轻轻取出,洗。nonmigrated细胞在参议院被棉签移除。那些被认为是低,迁移的细胞,与4%甲醛固定,与结晶紫染色。迁移细胞的数量在倒置显微镜下计算。

2.8。实时聚合酶链反应分析

添加不同浓度的垂直距离为7天的孵化的培养基。与试剂盒提取总RNA在不同群体(美国表达载体)。互补脱氧核糖核酸与恢复援助获得逆转录酶(Fermenta EP0442)根据制造商的指示。chondrogenic基因的表达水平(aggrecan、胶原蛋白II和SOX9)以及成骨的标记(Runx2和胶原蛋白X)被量化。实时聚合酶链反应(rt - PCR)进行使用ABI StepOnePlus实时PCR系统(应用生物系统公司,培育城市,CA)和KAPA SYBR®快速qPCR工具包(KAPA生物系统公司、美国)。相对RNA数量归一化到大量的内生控制基因,β肌动蛋白。结果被表示为一个比对照组使用比较Ct相对量化的方法。中使用的引物序列qPCR展示在表2。

2.9。免疫印迹分析

中海壳牌治疗与不同浓度的垂直距离为7天。蛋白质的培养基以及每组细胞溶解产物收集与裂解制备后缓冲区(Beyotime•瑞帕裂解缓冲,中国)冰。溶菌产物蛋白质sds - page和转移到PVDF膜分离后前面提到的例程(20.]。主要抗体SOX9(美国Abcam),胶原蛋白II型(美国罗福斯生物制品),aggrecan(美国罗福斯生物制品),或β肌动蛋白(天津Sungene生物技术有限公司,中国)应用于墨迹标签在一夜之间在4°C。这些墨迹被孵化与二次抗体(博士德生物技术有限公司,中国)1 h。的乐队是可视化增强化学发光(ECL)过程(美国新泽西州Amersham生物科学,皮斯卡塔韦)和集成密度量化使用图像软件。

2.10。Chondrogenic分化分析

中海壳牌是整除到500年μL DMEM / F12为2.5×10 ^ 5细胞。悬浮液在1500转离心5分钟15毫升管形成球形颗粒然后沉浸0.5毫升不完全培养基(Cyagen Biosciences Inc .)、美国)包含(10毫克/毫升胰岛素,转铁蛋白5.5毫克/毫升、和5 ng / mL硒),100毫克/毫升庆大霉素,50毫克/毫升L-ascorbic酸、谷酰胺2毫米,10毫米玫瑰,10 ^ 7 M地塞米松,2%的边后卫。评估中海壳牌的垂直距离对chondrogenic分化的影响,组设置为控制(没有垂直距离无论是TGF -β3),垂直距离(50 ng / mL), TGF -β3 (10 ng / mL),垂直距离(50 ng / mL) + TGF -β3 (10 ng / mL)。在14天的感应,媒介改变了每隔一天。丸一般观察和拍摄之后进行组织学和免疫组织化学分析福尔马林固定,石蜡包埋。

2.11。颗粒分析

每个颗粒的部分与二甲苯脱蜡、水化在降低分级酒精系列中,然后用dH洗了三次₂O .甲苯胺蓝染色和红色染料O染色蛋白多糖检测和细胞外基质进行评估后,传统的方法。

免疫组织化学检测、抗原检索和内源性过氧化物酶进行异种抗原被3% H₂O₂分别为和10%山羊血清。部分是孵化与胶原蛋白II(美国Abcam)和抗体SOX9(美国Abcam)一夜之间在4°C。标记部分是提交给Dako REALTM设想后检测系统制造商的指令。第二抗体是设置为负控制。苏木精用于核染色。着色后,部分与倒置显微镜观察。

2.12。统计分析

所有数据报告为平均值±标准偏差(SD)从至少三个独立技术复制。使用SPSS 18.0统计分析。两组之间的差异与学生进行了分析t测试。多个数据分析单向方差分析(方差分析)最显著的区别(LSD)紧随其后。统计上显著的差异被认为是当 。

3所示。结果

3.1。软骨干细胞/祖细胞的识别

分析了中海壳牌的细胞表面标记流式细胞仪。高水平的CD90和CD105(> 90%)被发现。CD73也积极(> 75%),而几乎没有CD34的表达或HLA-DR观察(图1(一))。multilineage分化能力测试和成骨的脂肪形成的归纳。红色染料在红O染色显示钙节点(图1 (b))和油红染色显示脂滴分布在细胞质的边缘(图1 (c))。中海壳牌在成纤维细胞样的形状,形成殖民地从一个单细胞,文化的密度非常低(图1 (d))。而孤立的中海壳牌是一群从关节软骨和软骨细胞的祖地位,代表我们认为chondrogenic差异化测试是无助的干细胞识别和结果没有显示。与其他研究人员进行的实验(21,22),我们证实这些细胞的特点,符合国际社会的标准细胞治疗(ISCT) [23]。

3.2。中海壳牌的垂直距离对细胞活力的影响

中海壳牌的增长被播种在96 -孔板在不同密度进行了分析与CCK-8化验后,1,2,3天的培养。短暂,中海壳牌在100增长缓慢,500年,1000个细胞/但激增明显当播种5000或10000细胞/。结果显示在无花果增刊1。因此,我们播种10000细胞/垂直距离是否会损害细胞生存能力或抑制毒性试验的扩散。为了调查垂直距离的促进作用在中海壳牌的扩散,每对1000细胞被播种以下测试。在文化的5天,细胞生存能力不会受到垂直距离(图2(一个))。同时,中海壳牌的扩散是由垂直距离0.1 ng / mL的浓度和1 ng / mL的第三天, (图2 (b))。0.1 ng / mL的促进作用和1 ng / mL垂直距离持续在第五天( ),这表明垂直距离加速中海壳牌不断的扩散。在第五天,10 ng / mL垂直距离还显示刺激效应, 。虽然在垂直距离组OD值在第三天,第五天隐含一个上行趋势与对照组相比,t测试显示,组间无显著差异的更高的浓度垂直距离和控制。

3.3。垂直距离提升中海壳牌的迁移

汇合的中海壳牌挠和孵化为48小时无血清培养基。垂直距离增加了10 ng / mL的浓度和100 ng / mL。每组的迁移在0小时,24小时和48小时后如图3。黑色线表示的起跑线细胞爬在孵化的48小时。在对照组,黑色线条之间的一些细胞存在。然而,当介质与垂直距离补充,中海壳牌渗透和垂直距离在100 ng / mL的差距加速这个过程比较10 ng / mL。值得注意的是,48小时后,开始在100 ng / mL垂直距离几乎是封闭与对照组无特色的萎缩。

然后执行transwell测试比较TGF - site-directional趋化作用的影响β3和垂直距离。后48小时内孵化,钱伯斯被和细胞与结晶紫染色。较低的过滤膜被拍到和拼成一个全景(图4)。紫色斑点代表通过微孔细胞交叉,显示数量的细胞迁移的趋势,< B < C < D。多的迁移中海壳牌与上面提到的方法进行了计算和分析,人物4 (e)。在对照组,1219±404细胞经过过滤,而2946±882细胞垂直距离(10 ng / mL)和4931±504细胞垂直距离(100 ng / mL)遍历到低。有1586±TGF - 129细胞β3组,但差异没有显著意义与对照组相比, 。

3.4。垂直距离监管Chondrogenic-Related基因的表达和合成的矩阵

找出如果垂直距离可以影响中海壳牌的chondrogenic分化和矩阵合成,细胞治疗与不同浓度的垂直距离在单层培养。qPCR测试表明的表达SOX9,这被认为是与软骨形成,垂直距离被提拔的剂量的1、10、50、100和500 ng / mL比未经处理的细胞(0 ng / mL)。aggrecan,群500 ng / mL显示无显著差异而其他调节的表达式, 。胶原蛋白II的mRNA比率受到50,100和500 ng / mL垂直距离(图5(一个))。因此,50 ng / mL垂直距离用于以下实验:褶皱SOX9的变化为2.34±0.15,aggrecan 1.58±0.04, col2为1.32±0.11。我们还发现Runx2的mRNA水平和胶原蛋白X没有受到垂直距离的影响,表明垂直距离没有影响成骨的归纳(图5(一个))。免疫印迹分析semiquantified SOX9的蛋白质含量,细胞内胶原蛋白II型,aggrecan孵化与垂直距离(图5 (b))。每个条带的集成光密度分析了设置β肌动蛋白作为内部参考(图5 (c))。SOX9和aggrecan明显升高垂直距离,而胶原蛋白II是增强仅在100年和500 ng / mL垂直距离。

3.5。颗粒与垂直距离或TGF -矩阵合成β3

中海壳牌整除,离心机形成颗粒。chondrogenic分化基础培养基制备,并配以50 ng / mL垂直距离或10 ng / mL TGF -β3或两者兼而有之。14天之后,球从四组显示一个光滑的表面形态(图6(a))。垂直距离+ TGF -的大小β3比他人有更多的球形。番红精O和甲苯胺蓝染色颗粒石蜡部分的演示感应(数据后粘多糖的合成6(b)和6(c))。控制相比,垂直距离和垂直距离+ TGF -片β3组中更厚的橘红色彩色图6(b),表明刺激对矩阵合成的影响。在颗粒的边缘,大多数aggrecan甲苯胺蓝染色的分布(图6(c)),中海壳牌显然是低密度的TGF -β3和垂直距离+ TGF -β3组,表明更丰富的细胞外基质合成(图6(c))。免疫组织化学方法也执行评估合成和胶原蛋白II型(图的位置6(d))和SOX9。胶原蛋白II在垂直距离和垂直距离+ TGF -β3组比控制。颗粒孵化的垂直距离,胶原蛋白II中给出一个大约径向分布模式。包含IHC SOX9的人物6(e)表明,垂直距离增强表达SOX9。在垂直距离+ TGF -β3组,然而,这一增长相比明显改善TGF -β3组,表明垂直距离的力量刺激chondrogenic中海壳牌的分化,它也可以促进TGF -的诱导效应β3所示。

4所示。讨论

中海壳牌与正常老鼠和人类软骨退行性以及膝关节(24]。它被认为参与更新的软骨细胞和软骨细胞外基质(5,25]。调节中海壳牌的再生功能,各种因素测试,例如,纤维母细胞生长因子2 (FGF-2) [26),TGF -β3、IGF (8),每个位置(27,28]。垂直距离是链接的肽裂解蛋白,存在于软骨,桥接胶原蛋白II型和透明质酸。据报道,垂直距离提升胶原蛋白II和蛋白多糖的合成从椎间盘髓核细胞(16,29日)和人类软骨细胞(30.]。然而,垂直距离在干细胞的影响,尤其是内源性干细胞软骨,有待阐明。在目前的研究中,我们首次评估垂直距离在中海壳牌的生物学行为的影响,从而有利于干细胞软骨再生。

通道1的描述中海壳牌孤立与微分附着力试验进行了分析。流式细胞仪结果表示,中海壳牌的表面标记类似于骨骨髓来源干细胞(BMSC) (31日)也同意其他研究结果32]。分化诱导化验了中海壳牌的脂肪形成的和成骨的能力,类似于之前报道的结果(19,33]。细胞计数结果kit-8建议垂直距离促进细胞增殖的浓度1、10、50 ng / mL。垂直距离也加速了中海壳牌的迁移在48小时的划痕试验。transwell文化显示趋化性垂直距离的影响,表明中海壳牌的定向迁移可能会加强与更高浓度的垂直距离。尽管TGF -β3显示趋化作用影响骨骨髓来源间充质干细胞(34,35),结果在这个实验中是缺乏统计意义。而干细胞内在细胞迁移是必要的维修,我们的研究引起了一种可能性,垂直距离可用于生物活性材料作为一种趋化因子帮助招聘。软骨形成基因的表达水平也促进了垂直距离和免疫印迹结果符合qPCR,同意该发现在以往的研究(17,36,37]。垂直距离还显示chondrogenic中海壳牌在三维感应影响文化。在软骨形成的骨架,冷凝chondrogenic分化[chondroprogenitor细胞是至关重要的38,39]。垂直距离的趋化作用效果可能有利于细胞颗粒的形成,加速细胞凝结,导致更高的组织学得分。王等人证实垂直距离调节表达SOX9的绑定BMP-RII (29日]。我们推测,软骨干细胞/祖细胞,作为过渡风格的骨骼干细胞软骨形成过程中(21),已经表达了细胞膜BMP-RII。除此之外,一个假设是,BMPRII及相关信号通路活性高于TβR-II在中海壳牌的分化,这需要进一步调查。

在目前的研究中,获得了正常大鼠软骨和功能测试体外的细胞被孤立。求出垂直距离是否能帮助体内中海壳牌的招聘或迁移,需要进一步的研究。垂直距离和TGF -之间的区别β3组transwell测定和颗粒文化需要更详细的解释,而TGF -β3也被认为是一个刺激因子在软骨组织工程40]。

垂直距离可以促进生产的组织工程软骨体外通过调节中海壳牌的新陈代谢,使应用程序在移植治疗。在关节炎的进展过程或退化,垂直距离在软骨破坏的炎症和免疫反应,加起来不平衡的ECM的软骨41,42]。因此,垂直距离的补充可能有助于延缓关节退化。允许的极限外源性生长因子如TGF -β3在体内治疗骨关节炎,我们相信,垂直距离将是一个更可取的交替。

5。结论

总的来说,垂直距离可能是一个有前途的刺激因子干细胞软骨再生的促进功能迁移,增殖,chondrogenic软骨干细胞/祖细胞的分化。垂直距离在这项研究的好处,CSPC-based细胞治疗给希望软骨再生医学带来了一个新的研究热点,仍然需要进一步调查。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Ruijun他和王Baichuan导致这项研究同样co-first作者。所有列出的作者为这手稿通过研究设计做出了重要的贡献,数据分析,或在写作和修改的过程。所有作者都阅读和批准提交的手稿。这项工作是由Ruijun担保他的完整性,Baichuan王,Zengwu邵。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金的资助81501916中国Baichuan小王和2016年国家重点研究和发展项目的yfc1100100中国Zengwu邵。

补充材料

补充1。合成的质量报告链接蛋白n端肽。

补充2。中海壳牌在不同密度的扩散速度。补充图1:中海壳牌的生长特性。不同数量的消费品安全委员会被播种到96孔板,在完全培养基培养。OD值与CCK-8试验发现在为期3天的培养。

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