文摘gydF4y2Ba
背景gydF4y2Ba。没有批准的药物治疗肝纤维化和非酒精性脂肪肝(NASH)的晚期纤维化已迅速成为肝硬化的主要原因。因此,需要抗炎和antifibrotic疗法的发展。间充质干细胞(MSC)的基础治疗,已进行了广泛的调查各种器官的再生医学,据说可以达到治疗效果在纳什通过旁分泌作用。细胞外囊泡(EVs)发布的包含各种各样的囊泡细胞,实现功能类似于msc。这里我们研究电动汽车的治疗效果与纳什amnion-derived msc(超导公司)在大鼠肝纤维化。gydF4y2Ba方法gydF4y2Ba。纳什被四周高脂饮食诱导(HFD)和肝纤维化引起腹腔内注射2毫升/公斤50%四氯化碳(三地gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)每周两次了六个星期。AMSC-EVs静脉注射在周3和4有纳什(15的老鼠gydF4y2BaμgydF4y2Ba在星期3 g / kg)和大鼠肝纤维化(20gydF4y2BaμgydF4y2Ba克/公斤)。炎症和纤维化的程度是评估定量逆转录聚合酶链反应和免疫组织化学。AMSC-EVs炎症和纤维化反应的影响研究gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba。gydF4y2Ba结果gydF4y2Ba。AMSC-EVs显著减少枯氏细胞的数量(;)在大鼠的肝脏与纳什和炎性细胞因子的信使rna表达水平,如肿瘤坏死因子(gydF4y2Ba肿瘤坏死因子-gydF4y2Ba)gydF4y2BaαgydF4y2Ba,白介素- (gydF4y2Ba伊尔-gydF4y2Ba)gydF4y2Ba1βgydF4y2Ba和gydF4y2Bail - 6gydF4y2Ba、转化生长因子(gydF4y2BaTgf -gydF4y2Ba)gydF4y2BaβgydF4y2Ba。此外,AMSC-EVs显著降低纤维积累,KC数,激活肝星状细胞(HSC)在大鼠肝纤维化。gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba,AMSC-EVs显著抑制KC HSC激活和抑制脂多糖(LPS) / 4 toll样受体TLR4信号通路。gydF4y2Ba结论gydF4y2Ba。AMSC-EVs改善炎症和纤维发生在老鼠模型的纳什和肝纤维化,可能由衰减HSC和KC激活。AMSC-EV政府应该被认为是慢性肝脏疾病的新的治疗策略。gydF4y2Ba
1。介绍gydF4y2Ba
慢性组织损伤导致持续的疤痕反应逐渐扰乱了正常的细胞功能,最终导致失败在多种上皮器官如肺、肾和肝(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是全球慢性肝脏疾病,最常见的原因和非酒精性脂肪肝(NASH)正迅速成为一个主要的原因肝硬化,肝癌,肝移植适应症;然而,没有批准药物治疗非酒精性脂肪肝和纳什gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。肝硬化,晚期的进步肝纤维化,导致门脉高压,肝性脑病和肝衰竭(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。唯一可用的治疗方法是去除有害刺激和肝移植的器官短缺的限制,高费用,终身免疫抑制治疗的要求(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。因此,抗炎和antifibrotic疗法的发展是一个重大的未满足临床需要肝纤维化和纳什。gydF4y2Ba
间充质干细胞(msc)多功能细胞能分化成各种特殊细胞如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。MSC-based疗法被广泛调查各种器官的再生医学(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。我们之前证明系统性管理amnion-derived msc(超导公司)在大鼠导致严重结肠炎的改进(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba),放射性直肠炎gydF4y2Ba12gydF4y2Ba],胰腺炎[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba),和肝纤维化gydF4y2Ba14gydF4y2Ba),有可能通过分泌释放移植超导公司的因素。先前的研究表明,msc可以通过旁分泌作用达到治疗效果和直接分化gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。然而,大多数的移植细胞估计不是真正达到目标组织,与大多数的细胞被困在肺、肝、脾(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。此外,我们最近表明,政府的条件培养基从超导公司文化导致了严重的结肠炎大鼠的改善(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)和食管和直肠狭窄大内镜黏膜下剥离后猪(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
细胞外囊泡(EVs)组成各种各样的囊泡释放到细胞外环境的细胞(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba],它分为液(练习,30 - 120 nm),微泡(MVs, 50 nm-1gydF4y2BaμgydF4y2Ba米),凋亡的身体根据生源论路径(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。鉴于没有确定具体的交货和MV标记,细胞外囊泡的国际社会同意考虑所有实验获得囊泡作为电动汽车(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。MSC-derived EVs据报道发挥功能类似于msc包括诱导细胞增殖以及抗炎、免疫调节、antifibrotic和凋亡的影响gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
因此,本研究的目的是研究电动汽车的影响从人类超导公司获得高脂肪饮食——(HFD)诱导纳什和CCl四氯化碳(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba-)诱导大鼠肝纤维化,调查潜在机制。gydF4y2Ba
2。材料和方法gydF4y2Ba
2.1。隔离和超导公司的扩张和正常皮肤成纤维细胞gydF4y2Ba
隔离和超导公司的扩张和正常皮肤成纤维细胞(NFs),从医学伦理委员会获得批准后札幌北海道大学医学研究生院的日本,书面知情同意了所有孕妇和病人。超导公司被孤立是前面描述的(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]和我们确认,超导公司是多功能和MSC标记包括CD44表达,CD73, CD90、和CD105但不是造血标记包括CD11b CD19、CD34、CD45、和人类白细胞antigen-DR [gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。NFs是孤立如前所述[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。超导公司以最小的基本培养基培养和NFs - (MEM)gydF4y2BaαgydF4y2Ba(美国生活技术,卡尔斯巴德,CA)补充10%胎牛血清(技术),100 U /毫升青霉素,100gydF4y2BaμgydF4y2Ba和光纯化学工业,g / mL链霉素(kouichi大阪,日本)。gydF4y2Ba
2.2。隔离超导公司的电动汽车和NFsgydF4y2Ba
电动汽车是分离和纯化超导公司和NFs获得AMSC-EVs NF-EVs,分别与少量修改(如前所述gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。细胞培养是维持在37°C在湿润的气氛中95%的空气和5%的有限公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba。培养细胞达到80% - -90%融合时,培养基无血清培养系统取代洗涤后磷酸盐(PBS,生活技术)三次,和一个额外的细胞培养48小时。条件培养基是收集和离心机在4°C 2500 g 5分钟去除细胞碎片。接下来,使用0.22上层清液的过滤gydF4y2BaμgydF4y2Ba过滤器(Billerica Steritop,默克密理博,妈,美国)。滤液是超离心机在100000克70分钟4°C。颗粒与PBS稀释和离心器100000gydF4y2BaggydF4y2Ba70分钟在4°C。最后,由此产生的EV丸resuspended并存储在−80°C到使用。gydF4y2Ba
2.3。AMSC-EVs和NF-EVs的识别gydF4y2Ba
EVs决心的大小分布使用qNano系统(Izon科学,克赖斯特彻奇,新西兰)根据制造商的协议。集中EVs的蛋白质含量测定采用量子位蛋白质化验设备(技术)和量子位2.0(技术)。表达的典型电动汽车标志的研究验证了通过免疫印迹使用抗体(1:200)从HansaBioMed生命科学(爱沙尼亚塔林)。AMSC-EVs也被扫描电子显微镜(SEM)。gydF4y2Ba
2.4。扫描电镜gydF4y2Ba
EVs固定在2%戊二醛处理和SEM至少四个小时。短暂,样本在分级脱水乙醇系列,与乙酸异戊酯治疗两次,和干用日立HCP-2临界点干燥器(日立、东京、日本),紧随其后的是可选platinum-palladium溅射涂层在日立e - 1030设备(日立)。使用日立s - 4500扫描电镜标本拍摄(日立)配备了一个数字图像捕捉系统。gydF4y2Ba
2.5。动物gydF4y2Ba
本研究的实验协议是通过动物保健单位和使用委员会的北海道大学。六个男Sprague-Dawley老鼠从日本采购SLC(日本滨松),每笼和三只老鼠被安置在一个温控房间(24°C) 12小时/ 12小时光/暗周期。所有的老鼠gydF4y2Ba随意gydF4y2Ba接触到水。gydF4y2Ba
2.6。纳什模型和AMSC-EV治疗gydF4y2Ba
纳什模型是由喂养大鼠(gydF4y2Ba )gydF4y2BaHFD(东方酵母,东京,日本)4周,而对照组大鼠(gydF4y2Ba )gydF4y2Ba有一个正常的饮食(东方酵母)。AMSC-EVs (15gydF4y2BaμgydF4y2Ba克/公斤)200年暂停gydF4y2BaμgydF4y2BaL PBS静脉注入HFD老鼠(HFD + AMSC-EV集团gydF4y2Ba )gydF4y2Ba通过阴茎静脉在周3和4。相反,200年gydF4y2BaμgydF4y2BaL PBS是通过同样的路线控制注入老鼠和那些接受HFD (HFD集团gydF4y2Ba )。gydF4y2Ba所有的老鼠都牺牲在5周后HFD启动(图gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
(一)gydF4y2Ba
(b)gydF4y2Ba
2.7。肝纤维化模型和AMSC-EV治疗gydF4y2Ba
腹腔内注射引起的肝纤维化是CCl 2毫升/公斤50%gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和光纯化学工业)(kouichi resuspended泡在橄榄油每周两次了六个星期。在对照组(gydF4y2Ba ),gydF4y2Ba老鼠注射橄榄油。AMSC-EVs (20gydF4y2BaμgydF4y2Ba克/公斤)200年暂停gydF4y2BaμgydF4y2BaL PBS通过阴茎静脉静脉注射后3周三地的开始gydF4y2Ba4gydF4y2BaCCl治疗(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba+ AMSC-EV集团gydF4y2Ba )。gydF4y2Ba相反,200年gydF4y2BaμgydF4y2BaL PBS注射控制老鼠和CCl处理gydF4y2Ba4gydF4y2Ba(同gydF4y2Ba4gydF4y2Ba组,gydF4y2Ba )。gydF4y2Ba所有的老鼠都牺牲在CCl后7周gydF4y2Ba4gydF4y2Ba启动(图gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
2.8。组织学检查gydF4y2Ba
肝左叶切除、固定在40 g / L甲醛在盐水中,嵌入在石蜡,切成5gydF4y2BaμgydF4y2Ba米的部分。组织部分沾着马森的三色的。10个随机领域从每个老鼠拍摄一段(×100),和中地区整个横截面积的测量肝脏标本和使用WinROOF数字图像表示为百分数分析仪(Mitani、福井、日本)。我们跟着Ohara等的方法。gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
2.9。免疫组织化学检查gydF4y2Ba
评估活化的肝星状细胞(hsc),沾一个anti-rat组织部分gydF4y2BaαgydF4y2Ba光滑的肌肉肌动蛋白(SMA)抗体(热科学1:800年,沃尔瑟姆,妈,美国)在室温下30分钟。评估枯氏细胞的数量(;),组织部分沾一个anti-rat CD68单克隆抗体(1:50;AbD Serotec Kidlington、英国)在室温下了40分钟。10个随机领域从每个老鼠拍摄一段,和彩色区域测量整个肝脏横截面积的百分比。gydF4y2Ba
2.10。RNA分离和定量逆转录聚合酶链反应gydF4y2Ba
从大鼠肝脏或培养细胞总RNA提取使用RNeasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国),和1gydF4y2BaμgydF4y2Bag总RNA reverse-transcribed进cDNA使用PrimeScript™RT试剂盒(豆类生物、Kusatsu、日本)。聚合酶链反应(PCR)扩增使用25了gydF4y2BaμgydF4y2BaL反应混合物中含有1gydF4y2BaμgydF4y2BaL cDNA和12.5gydF4y2BaμgydF4y2BaL铂SYBR绿色PCR混合(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。gydF4y2BaβgydF4y2Ba肌动蛋白和胞质18岁小亚基核糖体RNA (rRNA)信使RNA,放大来自同一样本作为内部控制。在95°C初始变性后2分钟,两步循环使用协议:变性在95°C 15秒和退火和延伸60°C 1分钟,40周期在7700年序列检测器(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。基因表达水平比较阈值测定使用周期(ΔΔCt)方法gydF4y2BaβgydF4y2Ba肌动蛋白和18 s rRNA作为内生控制。数据序列进行了分析与检测系统软件(应用生物系统公司)。引物序列见表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
2.11。使用大鼠肝星状细胞;体外实验gydF4y2Ba
隔离肝星状细胞和大鼠肝脏;执行与修改(如前所述gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。简而言之,大鼠肝脏处理gydF4y2Ba原位gydF4y2Ba随后链霉蛋白酶/胶原酶灌注和消化gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba。接下来,肝星状细胞的分离和从其他肝细胞群;实现了一种基于密度梯度协议使用两个不同浓度的聚蔗糖PM400(美国通用电气医疗集团,芝加哥,IL)。gydF4y2Ba
2.12。西方墨点法gydF4y2Ba
探讨磷酸化抑制剂卡帕(我gydF4y2BaκgydF4y2Ba)B -gydF4y2BaαgydF4y2Ba和p65 HEK293理研生物资源中心提供的人类胚胎肾细胞(日本筑波)或细胞系来源于HEK293细胞的稳定转染人类toll样受体(TLR) 4、MD2, CD14 (293 / hTLR4A-MD2-CD14;美国圣地亚哥InvivoGen CA)被镀成6-well板块(美国纽约康宁,康宁)2×10的密度gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞/好,在完全培养基培养。第二天,培养基是改变中包含AMSC-EVs或PBS和细胞孵化为60分钟,接着用10 ng / mL脂多糖(LPS、Sigma-Aldrich圣路易斯,密苏里州,美国)两个小时。与冰冷的PBS接下来,细胞被洗,细胞溶解产物是准备使用radio-immunoprecipitation分析缓冲区包含50 mM Tris-HCl (pH值8.0),150毫米氯化钠,0.5% (w / v)钠脱氧胆酸盐,0.1% (w / v)十二烷基硫酸钠(SDS)、1.0% (w / v) NP-40替代品,和蛋白酶/磷酸酶抑制剂鸡尾酒(细胞信号技术,贝弗利,妈,美国)。等量的细胞蛋白质提取物稀释在4×Laemmli样品缓冲(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。样本在95°C加热5分钟,使用SDS-polyacrylamide凝胶电泳(Bio-Rad)分离,并转移到Immobilon-P聚乙二烯二氟化物膜(默克密理博)。膜是孵化Tris-buffered盐水0.05%渐变20和光纯化学工业(kouichi)和5% PhosphoBLOCKER阻塞试剂(美国细胞生物学实验室,圣地亚哥,CA)在室温下为60分钟。探讨了膜对phospho-I主要抗体gydF4y2BaκgydF4y2BaB -gydF4y2BaαgydF4y2Ba(1:2000)gydF4y2BaκgydF4y2BaB -gydF4y2BaαgydF4y2Ba(1:2000),phospho-p65(1: 2000)和核因子(NF -κBgydF4y2BaκgydF4y2BaB, 1: 2000),从细胞信号技术,结合抗体检测与peroxidase-conjugated AffiniPure山羊anti-mouse免疫球蛋白(H + L) (1: 10000;美国杰克逊ImmunoResearch西树林,PA)或peroxidase-conjugated AffiniPure山羊anti-rabbit免疫球蛋白(H + L) (1: 10000;杰克逊ImmunoResearch)抗体。研究电动汽车标志的表达研究,电动车被稀释在4×Laemmli样品缓冲(Bio-Rad)。样本在95°C加热5分钟,使用SDS-polyacrylamide凝胶电泳(Bio-Rad)分离,并转移到Immobilon-P聚乙二烯二氟化物膜。阻塞的膜被封锁(Nacalai Tesque,京都,日本)在室温下为60分钟。探讨了膜的主要抗体的研究(1:200年,HansaBioMed生命科学、塔林、爱沙尼亚)和检测peroxidase-conjugated AffiniPure山羊anti-rabbit免疫球蛋白(H + L) (1: 2000)。膜使用ECL '可视化检测试剂(通用电气医疗集团),并分析了这些墨迹使用ImageQuant las - 4000(富士胶片、东京、日本)。gydF4y2Ba
2.13。瞬时转染和报告基因分析gydF4y2Ba
HEK293细胞和293 / hTLR4-MD2-CD14 (1.25×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba细胞/)被镀成24-well盘子(康宁)含有500gydF4y2BaμgydF4y2BaL培养基。孵化24小时后37°C,细胞转染了25 ng荧光素酶质粒DNA, 25 ng Renilla pGL4.74 (hRluc / TK)向量(WI Promega,麦迪逊,美国)作为内部控制,500 ng质粒DNA含有NF - 5份gydF4y2BaκgydF4y2BaB响应元件使荧光素酶报告基因的转录(pGL4.32 [luc2P / NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB RE / Hygro];Promega),和/或肿瘤坏死因子(TNF) receptor-associated因子6 (TRAF6)质粒使用Lipofectamine®第(技术)。TRAF6质粒是一个礼物Koji中川博士(北海道大学)。24小时后的孵化37°C,细胞治疗10 ng / mL有限合伙人为6个小时,和使用双荧光素酶报告基因实验进行®记者分析系统(Promega)。发光强度测量使用GloMax®- multi检测系统(Promega)根据制造商的指示。转录活动规范化Renilla荧光素酶活性。所有实验进行了一式三份。gydF4y2Ba
2.14。统计分析gydF4y2Ba
数据表示为意味着±标准差(SD)。参数组中由单向方差分析比较图基的测试。组间比较是通过使用未配对的学生的gydF4y2BatgydF4y2Ba以及。所有的差异都视为重要,gydF4y2Ba 。gydF4y2Ba所有分析使用GraphPad棱镜version 7 (GraphPad、圣地亚哥、钙、美国)。gydF4y2Ba
3所示。结果gydF4y2Ba
3.1。描述AMSC-EVs NF-EVsgydF4y2Ba
首先,我们检查AMSC-EVs SEM(图gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba),qNano系统证明AMSC-EVs的直径分布范围从50到150海里,有一个峰值约100纳米(图gydF4y2Ba2 (b)gydF4y2Ba)。此外,我们确认EV标记的表达研究的西方墨点法AMSC-EVs(图gydF4y2Ba2 (c)gydF4y2Ba)。NF-EVs的大小分布范围从80到110海里,用一个峰值在大约90海里(补充图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba),NF-EVs也表示EV标记的研究(补充图gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
(一)gydF4y2Ba
(b)gydF4y2Ba
(c)gydF4y2Ba
3.2。AMSC-EVs减轻炎症反应在老鼠模型的纳什gydF4y2Ba
我们下一个评估的角色AMSC-EVs纳什的大鼠模型。比较肝脏标本6大鼠与对照组11老鼠的HFD和HFD + AMSC-EV组透露,HFD和HFD + AMSC-EV组的肝脏被放大,表现出一种脂肪外观(图gydF4y2Ba3(一个)gydF4y2Ba)。苏木精和伊红染色表明脂滴的积累和HFD浸润的单核细胞在肝脏和HFD + AMSC-EV组(图gydF4y2Ba3 (b)gydF4y2Ba)。Immunohistological检查证明;的数量,取决于KC标记CD68的表达,是HFD组显著增加;然而,AMSC-EVs显著减少的数量;(图gydF4y2Ba3 (c)gydF4y2Ba)。另一方面,CD163的表达,M2巨噬细胞的标记,没有明显不同HFD和HFD + AMSC-EV组(补充图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。定量逆转录PCR表明HFD的表达水平显著提高gydF4y2BaTnf-αgydF4y2Ba,白介素- (gydF4y2BaIl - 6gydF4y2Ba,单核细胞化学引诱物蛋白(gydF4y2BaMcp -) 1gydF4y2Ba(数据gydF4y2Ba3 (d)gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3 (f)gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3 (g)gydF4y2Ba分别)的表达式gydF4y2BaTnf-αgydF4y2Ba,gydF4y2BaIl-1βgydF4y2Ba,gydF4y2Ba和il - 6gydF4y2Ba被AMSC-EVs显著降低(图gydF4y2Ba3 (d)gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3 (f)gydF4y2Ba分别)。此外,转化生长因子的表达水平(gydF4y2BaTgf -β)gydF4y2Ba明显减少了AMSC-EVs(图gydF4y2Ba3 (h)gydF4y2Ba)。HFD组,信使rna表达水平的巨噬细胞标记等gydF4y2BaCd68gydF4y2Ba和gydF4y2BaCd11cgydF4y2Ba标记,标识M1巨噬细胞,显著增加,显著减少动物对待AMSC-EVs(数字gydF4y2Ba3(我)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3 (j)gydF4y2Ba分别)。M2巨噬细胞标志物的表达水平gydF4y2BaCd163gydF4y2Ba没有明显不同的三个治疗组(图gydF4y2Ba3 (k)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
(一)gydF4y2Ba
(b)gydF4y2Ba
(c)gydF4y2Ba
(d)gydF4y2Ba
(e)gydF4y2Ba
(f)gydF4y2Ba
(g)gydF4y2Ba
(h)gydF4y2Ba
(我)gydF4y2Ba
(j)gydF4y2Ba
(k)gydF4y2Ba
3.3。AMSC-EVs抑制肝纤维化大鼠肝纤维化模型gydF4y2Ba
我们下一个评估AMSC-EVs的影响肝纤维化大鼠模型。15在每个CCl的老鼠gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和同gydF4y2Ba4gydF4y2Ba+ AMSC-EV组与六大鼠对照组相比。而五CCl老鼠死在星期6和7gydF4y2Ba4gydF4y2Ba集团四大鼠死CCl在星期6和7gydF4y2Ba4gydF4y2Ba+ AMSC-EV组。因此,6、10和11个老鼠从控制,创新领导力gydF4y2Ba4gydF4y2BaCCl,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba+ AMSC-EV组,分别进行了分析。苏木精和伊红染色表明,粗纤维隔膜和CCl pseudolobule形成更广泛的gydF4y2Ba4gydF4y2Ba组织与控制和创新领导力gydF4y2Ba4gydF4y2Ba(图+ AMSC-EV组gydF4y2Ba4(一)gydF4y2Ba)。CCl严重纤维化中观察到gydF4y2Ba4gydF4y2Ba集团;然而,纤维积累显著减毒AMSC-EV治疗(图7周gydF4y2Ba4 (b)gydF4y2Ba)。的表达gydF4y2BaαgydF4y2Basma HSC激活的标志,CCl的显著增加gydF4y2Ba4gydF4y2Ba集团被AMSC-EV治疗(图明显减弱gydF4y2Ba4 (c)gydF4y2Ba)。CCl CD68的表达明显增加gydF4y2Ba4gydF4y2Ba集团;然而,AMSC-EV治疗减少的数量CD68-positive;(图gydF4y2Ba4 (d)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
(一)gydF4y2Ba
(b)gydF4y2Ba
(c)gydF4y2Ba
(d)gydF4y2Ba
3.4。AMSC-EVs抑制LPS-Induced激活;和肝星状细胞在体外gydF4y2Ba
阐明这些机制gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba结果,我们接下来检查AMSC-EVs对炎症反应的影响;培养和肝星状细胞。有限合伙人的表达水平显著调节治疗gydF4y2BaTnf-αgydF4y2Ba,gydF4y2BaIl-1βgydF4y2Ba,gydF4y2BaMcp-1gydF4y2Ba的;被AMSC-EV治疗(图明显减弱gydF4y2Ba5(一个)gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5 (c)gydF4y2Ba分别)。相反,NF-EVs没有抑制这些细胞因子的表达水平。此外,在肝星状细胞、治疗与LPS显著调节的表达gydF4y2BaTnf-αgydF4y2Ba,由AMSC-EVs抑制(图gydF4y2Ba5 (d)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
(一)gydF4y2Ba
(b)gydF4y2Ba
(c)gydF4y2Ba
(d)gydF4y2Ba
(e)gydF4y2Ba
(f)gydF4y2Ba
(g)gydF4y2Ba
(h)gydF4y2Ba
我们下一个检查是否AMSC-EVs抑制LPS-induced NF -gydF4y2BaκgydF4y2Ba293年B激活/ hTLR4A-MD2-CD14和HEK293细胞。我们确认AMSC-EVs剂量依赖性抑制的表达gydF4y2BaTNF-αgydF4y2Ba(图gydF4y2Ba5 (e)gydF4y2Ba)。此外,增加LPS-induced NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB转录活动被AMSC-EVs显著抑制(图gydF4y2Ba5 (f)gydF4y2Ba)。此外,LPS-induced磷酸化的我gydF4y2BaκgydF4y2BaB -gydF4y2BaαgydF4y2Ba和p65被AMSC-EVs抑制(图gydF4y2Ba5 (g)gydF4y2Ba)。而NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB超表达的转录活动调节TRAF6, AMSC-EVs没有下调NF -gydF4y2BaκgydF4y2Ba(图B转录活动gydF4y2Ba5 (h)gydF4y2Ba),这表明AMSC-EVs可能抑制LPS的早期步骤/ TLR4信号通路。gydF4y2Ba
3.5。AMSC-EVs抑制主要肝星状细胞的激活gydF4y2Ba
调查AMSC-EVs在HSC活化的影响,从大鼠肝脏和激活肝星状细胞分离天然文化。在这些细胞中,AMSC-EVs显著抑制的表达gydF4y2Baα-SmagydF4y2Ba(图gydF4y2Ba6(一)gydF4y2Ba)和显著增加矩阵metalloproteinase-2的表达(gydF4y2BaMmp-2gydF4y2Ba,图gydF4y2Ba6 (c)gydF4y2Ba)。尽管collagen1a1的表达gydF4y2Ba(Col1a1)gydF4y2Ba没有改变(图gydF4y2Ba6 (b)gydF4y2Ba),组织抑制剂metalloproteinases-1的表达(gydF4y2BaTimp-1gydF4y2Ba)倾向于减少文化被AMSC-EVs(图gydF4y2Ba6 (d)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
(一)gydF4y2Ba
(b)gydF4y2Ba
(c)gydF4y2Ba
(d)gydF4y2Ba
4所示。讨论gydF4y2Ba
在目前的研究中,我们调查了抗炎和antifibrotic AMSC-EVs在大鼠慢性肝脏疾病的影响。我们发现AMSC-EV治疗改善组织学发现和促炎因子表达式在CCl老鼠与纳什和老鼠的组织学改变gydF4y2Ba4gydF4y2Ba全身的肝纤维化。我们进一步确定AMSC-EVs抑制养殖;和肝星状细胞的激活。gydF4y2Ba
一些研究调查的影响MSC-derived EVs急性肝损伤的肝损伤模型(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba],暴发性肝衰竭[gydF4y2Ba32gydF4y2BaCCl),gydF4y2Ba4gydF4y2Ba全身的肝纤维化(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba],thioacetamide-induced肝纤维化(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。EVs含有生物活性蛋白质、脂质、mrna, microrna和扮演至关重要的角色gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。在这些电动汽车组件,蛋白质如IL6ST / gp130 TNFRSF1A / TNFR1, CXCL2 / MIP-2被证明与启动相关因素在肝脏再生(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。然而,AMSC-EVs的治疗效果在纳什和肝纤维化模型尚未报道。gydF4y2Ba
李等人证明了政府的msc可以用作临床肥胖症相关症状的治疗工具gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。他们还建议,MSC通过旁分泌溶菌产物葡萄糖耐受不良改善的效果。multiparallel支安打的概念发展的纳什最近建议(gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。在目前的研究中,我们检测炎症模型的纳什。在疾病的早期阶段;快速扩张和分泌细胞因子和趋化因子如il - 1、TNF -gydF4y2BaαgydF4y2Ba、MCP-1和主题趋化因子配体(CCL) 5 (gydF4y2Ba37gydF4y2Ba),反映出他们参与炎症反应的控制在纳什和招聘的重要作用在肝脏炎症细胞(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba,gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]。CD68是一种常见的巨噬细胞标记(gydF4y2Ba40gydF4y2Ba一般,M1巨噬细胞表达CD11c [gydF4y2Ba41gydF4y2Ba),而M2巨噬细胞表达CD163和CD206 [gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。在目前的研究中,AMSC-EVs压制;激活的情况下,特别是M1巨噬细胞,表达下调炎性细胞因子的表达(gydF4y2BaTnf-αgydF4y2Ba,gydF4y2BaIl-1βgydF4y2Ba,gydF4y2Bail - 6gydF4y2Ba)有纳什的老鼠。我们还检查上下文中的AMSC-EVs有限合伙人的角色,这是公认的一个主要因素,诱发纳什(gydF4y2Ba43gydF4y2Ba)被证明通过TLR信号(直接激活;gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]。在有限合伙人/ TLR4通路,骨髓微分蛋白质(MyD) 88被激活,导致p65 TRAF6激活和磷酸化和我gydF4y2BaκgydF4y2BaB -gydF4y2BaαgydF4y2Ba,允许NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB可能促使细胞核(gydF4y2Ba45gydF4y2Ba,gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]。我们以前报道,超导公司以及条件培养基从超导公司施加抗炎效应RAW264.7巨噬细胞(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。在目前的研究中,AMSC-EVs抑制LPS-induced炎性细胞因子的表达水平;和肝星状细胞。此外,我们发现AMSC-EVs抑制p65和我gydF4y2BaκgydF4y2BaB -gydF4y2BaαgydF4y2Ba磷酸化和NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB转录活动。然而,AMSC-EVs没有抑制NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB超表达的诱导下,转录活动TRAF6在HEK293细胞中,这表明AMSC-EVs可能抑制LPS的早期步骤/ TLR4信号通路。gydF4y2Ba
李等人CCl管理gydF4y2Ba4gydF4y2Ba(0.6毫升/公斤)腹腔注射每周两次和250gydF4y2BaμgydF4y2Bag EVs获得330年从人脐带mscgydF4y2BaμgydF4y2BaL PBS直接到鼠标的左和右叶肝CCl过去六周后gydF4y2Ba4gydF4y2Ba治疗(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。他们证明肝内注射人类脐带MSC-EVs减少表面纤维胶囊和软化他们的纹理和减轻肝脏炎症和CCl胶原沉积gydF4y2Ba4gydF4y2Ba全身的纤维化的肝脏。因此,我们的研究表明,AMSC-EVs抑制肝星状细胞的纤维积累和激活。此外,我们gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba实验表明,AMSC-EVs抑制HSC激活,这是纤维发生的关键事件(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。此外,我们表明,AMSC-EVs压制的;促进HSC激活和肝纤维化(gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]。然而,AMSC-EVs不能显著抑制基因的表达与肝纤维化的有关gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba更严重的肝纤维化模型,通过更高的管理创新领导力gydF4y2Ba4gydF4y2Ba了六个星期。增加EV注射的剂量和/或频率可能会提供一个更好的治疗效果。gydF4y2Ba
我们以前报道,超导公司CCl移植改善gydF4y2Ba4gydF4y2Ba全身的肝纤维化大鼠的抗炎作用;超导公司可能有助于他们antifibrotic效果。(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。同样,目前的研究表明,AMSC-EVs施加抗炎和antifibrotic效果。msc已经被认为是一种新颖的治疗方法治疗炎症和纤维化的肝脏疾病(gydF4y2Ba48gydF4y2Ba];然而,据报道引起栓塞血管内注入msc和死亡动物,导致增加兴趣non-cell-based疗法而不是细胞疗法由于制造过程相关的缓解和更好的安全性,这些不能存活的方法gydF4y2Ba49gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]。电动汽车是其中一个主要组件和旁分泌活动有关,和MSC-derived电动汽车所需的治疗选择游离在再生医学(gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]。此外,通过用电动车代替MSC移植,许多相关的安全问题和限制可以减轻(gydF4y2Ba53gydF4y2Ba],MSC-EVs可能提供特定优势等患者安全低触发先天和适应性免疫反应倾向gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
5。结论gydF4y2Ba
AMSC-EVs改善模型大鼠炎症和纤维发生纳什和肝纤维化,可能由衰减HSC和KC激活。AMSC-EV政府应该被视为一个新的治疗慢性肝病的治疗策略。gydF4y2Ba
缩写gydF4y2Ba
| 超导公司:gydF4y2Ba | Amnion-derived间充质干细胞gydF4y2Ba |
| 创新领导力gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:gydF4y2Ba | 四氯化碳gydF4y2Ba |
| 创新领导力:gydF4y2Ba | 主题趋化因子配体gydF4y2Ba |
| DMEM:gydF4y2Ba | 杜尔贝科修改鹰的媒介gydF4y2Ba |
| 电动汽车:gydF4y2Ba | 细胞外囊泡gydF4y2Ba |
| 例:gydF4y2Ba | 外来体gydF4y2Ba |
| 的边后卫:gydF4y2Ba | 胎牛血清gydF4y2Ba |
| HFD:gydF4y2Ba | 高脂肪饮食gydF4y2Ba |
| 保险公司:gydF4y2Ba | 人血清白蛋白gydF4y2Ba |
| HSC:gydF4y2Ba | 肝星状细胞gydF4y2Ba |
| 我gydF4y2BaκgydF4y2BaB -gydF4y2BaαgydF4y2Ba:gydF4y2Ba | 抑制剂gydF4y2BaκgydF4y2BaB -gydF4y2BaαgydF4y2Ba |
| IL:gydF4y2Ba | 白介素gydF4y2Ba |
| 腰痛:gydF4y2Ba | Lipopolysaccharide-binding蛋白质gydF4y2Ba |
| 有限合伙人:gydF4y2Ba | 脂多糖gydF4y2Ba |
| MCP-1:gydF4y2Ba | 单核细胞化学引诱物蛋白1gydF4y2Ba |
| MEM:gydF4y2Ba | 最小的重要媒介gydF4y2Ba |
| 硕士:gydF4y2Ba | 间充质干细胞gydF4y2Ba |
| MMP的:gydF4y2Ba | 基质金属蛋白酶gydF4y2Ba |
| MV:gydF4y2Ba | 微泡gydF4y2Ba |
| MyD88:gydF4y2Ba | 髓样分化蛋白88gydF4y2Ba |
| 非酒精性脂肪肝:gydF4y2Ba | 非酒精性脂肪肝病gydF4y2Ba |
| 纳什:gydF4y2Ba | 非酒精性脂肪肝炎gydF4y2Ba |
| 尼克-弗瑞:gydF4y2Ba | 正常皮肤成纤维细胞gydF4y2Ba |
| PBS:gydF4y2Ba | 磷酸盐gydF4y2Ba |
| SD:gydF4y2Ba | 标准偏差gydF4y2Ba |
| 扫描电镜:gydF4y2Ba | 扫描电子显微镜gydF4y2Ba |
| SMA:gydF4y2Ba | 平滑肌肌动蛋白gydF4y2Ba |
| TBS:gydF4y2Ba | Tris-buffered盐水gydF4y2Ba |
| TGF:gydF4y2Ba | 转化生长因子gydF4y2Ba |
| TIMP:gydF4y2Ba | 的金属蛋白酶组织抑制剂gydF4y2Ba |
| 肿瘤坏死因子:gydF4y2Ba | 肿瘤坏死因子gydF4y2Ba |
| TRAF:gydF4y2Ba | 肿瘤坏死因子receptor-associated因素。gydF4y2Ba |
数据可用性gydF4y2Ba
所有的数据用于支持本研究的结果包括在本文中。gydF4y2Ba
伦理批准gydF4y2Ba
隔离超导公司和发展纳什和肝纤维化模型使用协议执行医学伦理委员会批准的北海道大学医学院毕业,札幌和日本北海道大学动物保健单位和使用委员会,分别为日本札幌。gydF4y2Ba
的利益冲突gydF4y2Ba
Goki须收到百时美施贵宝的谢礼,MSD KK, AbbVie。直坂本已收到酬金从基列科学和研究经费,百时美施贵宝,MSD KK,大冢制药,Abbvie,赢家,武田。gydF4y2Ba
作者的贡献gydF4y2Ba
莫为所有实验、数据分析和写作手稿。所以和NS导致了概念,设计和手稿的最终批准。HH, KYa KYu, HN, GS, QF, OM导致装配数据和数据分析。所有作者阅读和批准了手稿。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
这项研究是由日本的转化研究网络计划为医学研究和发展机构。我们感谢作者Hirano Tomoe Shimazaki,而木村的技术援助。gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
补充图1:NF-EVs的表征。(A)与qNano粒子的大小分布测量系统。(B)与anti-CD81抗体免疫印迹分析。NF:正常皮肤成纤维细胞;电动汽车:细胞外囊泡。补充图2:在老鼠AMSC-EVs HFD-induced脂肪肝炎的效果。(一)CD163的表情。gydF4y2Ba 与控制。酒吧,200gydF4y2BaμgydF4y2Bam。超导公司:amnion-derived间充质干细胞;电动汽车:细胞外囊泡;HFD:高脂肪饮食。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba)gydF4y2Ba