治疗效果的VEGF Gene-Transfected bmsc移植在薄的子宫内膜在老鼠模型中

文摘

客观的。骨间充质干细胞(bmsc)移植对薄的子宫内膜有治疗效果在动物研究和临床试验。本研究旨在评估移植是否VEGF-transfected bmsc (VEGF-BMSCs)有更好的治疗效果在子宫内膜和子宫内膜接受综合治疗相比,可再生。方法。Sprague-Dawley (SD)老鼠被用于这项研究。子宫内膜薄模型建立了以95%乙醇注入子宫。VEGF-BMSCs通过尾静脉静脉注射或bmsc移植。子宫内膜厚度、形态和pinopodes评估通过苏木精和伊红(他)染色和扫描电子显微镜(SEM)。标记的蛋白质和mrna表达子宫内膜细胞和子宫内膜接受治疗后测定。生育能力测试是为了评估胚胎移植效率。结果。VEGF-BMSCs移植显著增加子宫内膜厚度与bmsc组和对照组。之间没有显著差异在子宫内膜厚度VEGF-BMSCs组和虚假的操作组。重要的是,在蛋白质水平的表达细胞角蛋白,维生素,VEGF,制药业和整合素α_νβ₃在VEGF-BMSC组与对照组相比显著增加和BMSC组4天,干细胞移植后8天。因此,mRNA的表达生活和整合素α_νβ₃与对照组相比显著调节和BMSC组治疗后4和8天。pinopodes是更好的VEGF-BMSCs组和虚假的操作组相比bmsc组和对照组。胚胎移植的数量是最大的骗局操作组,其次是VEGF-BMSCs集团bmsc组和对照组。结论。移植的VEGF gene-transfected bmsc可能是一个更好的治疗比干细胞疗法治疗子宫内膜薄。

1。介绍

一层薄薄的子宫内膜往往意味着受损的子宫内膜接受,被认为是一个关键因素在植入失败(1- - - - - -4]。目前,没有统一的定义“子宫内膜薄”。许多研究表明,最小需要6毫米的胚胎植入子宫内膜厚度(5]。一些治疗方法,如雌激素,阿司匹林,pentoxifylline,和子宫内膜损伤,一直试图改善子宫内膜的再生。然而,进步不是很明显,可用的治疗(6- - - - - -8]。这仍然是一个巨大的挑战,找到一个有用的治疗子宫内膜薄(9]。

直到现在,最有前途的治疗子宫内膜薄或Asherman综合症(AS)似乎是干细胞治疗。有许多动物和人类的报告关于干细胞移植的治疗效果在子宫内膜薄。大量的动物实验表明,薄的子宫内膜干细胞移植后明显改善(10- - - - - -13]。临床报告表明,不孕妇女子宫内膜薄或有显著增加干细胞治疗后子宫内膜厚度和增强的怀孕率(14- - - - - -17]。

据报道,薄的子宫内膜病理生理的特点如下:径向流阻抗增加动脉在腺上皮有不利的影响,导致降低血管内皮生长因子(VEGF)水平。最后,血管发育不良及血流量受损引起的子宫内膜是(18]。VEGF是一种血管生成因子和血管生成中发挥重要作用通过血管分支的旧或新血管的萌芽。最近,干细胞移植作为治疗讨论薄的子宫内膜。因此,本研究旨在调查是否VEGF gene-transfected bmsc (VEGF-BMSCs)对薄的子宫内膜有更好的效果。

2。材料和方法

2.1。动物

七十九周Sprague-Dawley (SD)大鼠体重150 - 250克被用于实验。动物实验都是在严格执行的“国家卫生研究院的指导实验室动物保健和使用”。本研究回顾和批准的机构审查委员会和湘雅医院的伦理委员会,中南大学。

2.2。bmsc的收集和文化

骨髓是吸气,准备从一个成年人的股骨和胫骨,男/女,SD大鼠。骨髓是消化、培养和过滤根据一项研究[19]。达到至少80%融合时,干细胞收集0.05% trypsin-EDTA (Gibco)。bmsc的密度培养3000 - 6000 /厘米²,第四到第六章节bmsc用于转染和移植。

2.3。质粒,转染鼠BMSC做准备

人类VEGF_165年集成到pCR3.1质粒,发表之前。1μg hVEGF的质粒DNA_165年每100000个细胞用于转染,空pCR3.1结合3μL (metafectene每100000人作为对照组细胞。这些细胞被转移到bmsc培养基6小时后,一夜之间。移植前510⁶干细胞是悬浮在盐水的浓度50000细胞/μl

2.4。组

标准化的实验室条件,包括空调房间和充足的水和食物,是应用于老鼠。根据我们的初步研究,一层薄薄的子宫内膜鼠模型是由老鼠的向子宫腔注入无水乙醇(20.]。一百大鼠随机分为四组,其中包括对照组(iv-injected盐水建模、尾静脉6 - 8小时后 ),BMSC集团(iv-injected BMSC建模、尾静脉6 - 8小时后 ),VEGF-BMSC集团(in-injected VEGF-BMSCs建模、尾静脉6 - 8小时后 ),和虚假的操作(操作没有建模、 )。

扫描电子显微镜(SEM)和生育能力测试,老鼠与过量10%水合氯醛麻醉和杀害(1.125 g / kg) 4天( )和9天( )后阴道塞的外观。老鼠与过量10%水合氯醛麻醉和杀害(1.125 g / kg)综合治疗后三个发情周期。阴道涂片观察确定发情周期。子宫被切除后,老鼠被牺牲掉了。为进一步研究,把老鼠的子宫并存储在液态氮和/或福尔马林。

2.5。苏木精和伊红染色(他)

根据之前的研究[他染色了21]。幻灯片5μ米厚度完全覆盖在二甲苯两次,患者在一系列的乙醇浓度逐渐降低。幻灯片是冲洗去离子的软化水,在苏木精染色约50秒,清洗和去离子的软化水再一次,最后在伊红染色3秒。子宫内膜的幻灯片与一系列的乙醇脱水二甲苯和安装Permount安装介质后的颜色反应。子宫内膜形态学和子宫内膜厚度检测和对比组。

2.6。免疫组织化学

免疫组织化学,子宫被存储在4%多聚甲醛和嵌入在石蜡。串行幻灯片约6μm是准备,deparaffinized在二甲苯中,与不同浓度乙醇制成冻干,用水冲洗。内源性过氧化物酶被3%的氢过氧化物酶。幻灯片服用软骨素ABC裂合酶(0.15 U /毫升)和屏蔽10%正常山羊血清1小时。整合素的表达细胞角蛋白、波形蛋白α_νβ₃、白血病抑制因子(生活)蛋白质是由孵化滑鼠子宫的兔多克隆抗体细胞角蛋白、波形蛋白,整合素α_νβ₃一夜之间,生活在4°C。幻灯片与二次孵化抗体1:3000稀释后涂1小时的解决方案。然后,幻灯片简要沾苏木精解(15秒)(吉尔。3;σ)和评估一个显微镜(尼康)。

2.7。西方墨点法

总蛋白提取自子宫组织根据协议,和蛋白质的浓度与精密红化验证实(细胞骨架Inc .)。等量的蛋白质沾在装货染料和12% sds - page分离。蛋白质被转移到聚乙二烯二氟化物(PVDF)膜和孵化与5%牛血清白蛋白(BSA)。膜被暴露在抗vegf抗体(1:500),anti-cytokeratin抗体(1:500),anti-integrin anti-vimentin抗体(1:500)α_νanti-integrin抗体(1:300)β₃抗体(1:300),anti-LIF抗体(施用)一夜之间。这些墨迹洗了三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐和二次孵化anti-rabbit免疫球蛋白g (1: 3000;细胞信号技术)在室温下1小时。蛋白质含量检测使用西方SuperSignal Pico(皮尔斯生物技术)。反β肌动蛋白抗血清(σ)是作为内部标准团体之间。

2.8。实时聚合酶链反应

收获的子宫中总RNA收集使用的萃取试剂(试剂盒;Gibco)和溶解在水中diethylpyrocarbonate对待,和由分光光度计测量浓度(uv - 1601)。为了确定一个常数表达式看家基因的RNA拔牙、实时PCR GAPDH也执行。任何可能的DNA污染与DNase我(0.2 U /删除μL;Ambion)。定量PCR反应进行快速实时PCR系统和生物系统7500 Taqman调查。使用2ΔΔct方法定量表达水平进行了分析。PCR探针集使用如下:

VEGF:感觉5 - - - - - -注册会计师CAG亚美大陆煤层气有限公司GGG AGC AGA AAG-3 ,和反义5 - - - - - -GCA AGT ACG TTC GTT TAA CTC-3 ;

生活:有5 - - - - - -GTC AAC TGG CTC AAC柠檬酸ACG-3 ,和反义5 - - - - - -CTG GCA GCC CAA CTT CTT颈- 3 ;

整合素α_ν:感觉5 - - - - - -GTC AGC CCA GTC GTG TCT TAC a - 3 ,和反义5 - - - - - -GGG CTT棉酚有条件现金援助CTT ATC TCA-3行动 ;

整合素β₃:感觉5 - - - - - -GTG广汽公司治理文化AAC AAC GCA-3 ,和反义5 - - - - - -ACC亚美大陆煤层气有限公司GTA ACG CCA GGA 3 。

2.9。扫描电子显微镜(SEM)

老鼠安乐死,子宫是解剖和纵向切开。子宫是淹没在2.5%戊二醛,继续在这个解决方案中24小时。然后标本在磷酸缓冲冲洗几次,固定在4%锇磷酸盐溶液,在丙酮脱水在蒸馏水溶液浓度增加,并保持在100%的丙酮。然后样本与二氧化碳临界点干燥,干挂载和涂有黄金,并通过扫描电镜检查。

2.10。生育能力测试

子宫内膜接受评估,测试他们的能力获得受精卵子和留住怀孕的胚胎。老鼠交配1:1的比例与成熟的雄性老鼠,安乐死9天后,阴道塞的外观,和每个子宫检查胎儿的数目。

2.11。统计分析

统计软件SPSS 16.0 (IBM)应用于目前的研究。测量数据的存在可能是意味着±SD。一个片面的t以及用于比较组之间的差别。免疫印迹,蛋白质乐队的密度与Image-J软件进行了分析,并提出了相对蛋白质含量的比率目标蛋白质β肌动蛋白。实时PCR、相对mRNA水平获得了通过比较目标mRNA的GAPDH相同的凝胶。一个P小于0.05 ( )被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。BMSC表型

bmsc,从大鼠骨髓获得吸入物、生长在先前发表的文化媒介。流式细胞仪分析表明,CD90和CD73 bmsc表达,而造血CD45标记和CD34呈阴性。bmsc已经向脂肪细胞和成骨细胞分化的能力。

3.2。组织病理学观察

老鼠在bmsc和VEGF-BMSCs组数量明显增大的子宫内膜腺体,和更厚的子宫内膜与对照组相比。的子宫内膜层VEGF-BMSC组显示一个相对完整的结构,子宫内膜腺体,毛细血管和子宫内膜厚度增加。子宫内膜的对照组完全损坏,显示广泛凝固性坏死,细胞凋亡在几乎整个层子宫内膜和子宫肌层的层。

对照组的子宫内膜厚度,BMSC集团VEGF-BMSC集团和虚假的操作组如下:218.7±20.6μ米,598.7±37.7μ米,658.0±40.0μm和682.3±38.2μm,分别。VEGF-BMSC组有明显的子宫内膜厚衬与对照组相比,BMSC集团并没有显著区别VEGF-BMSC组和虚假的操作组(图1)。

3.3。蛋白质VEGF的表达、细胞角蛋白、波形蛋白,整合素α_νβ₃,生活

免疫组织化学结果表明,细胞角蛋白,整合素α_νβ₃,仍是主要表达在子宫内膜上皮细胞的细胞质中,和波形蛋白主要是局部子宫内膜基质细胞的细胞质中。的表达细胞角蛋白、波形蛋白、整合素α_νβ₃,生活在VEGF-BMSC组和BMSC组明显高于对照组和略弱于那些虚假的操作组的没有意义。(图2,补充图1)。

西方墨点法应用于考试这些蛋白的表达在子宫内膜干细胞移植后4天,8天。波形蛋白,整合素α_γβ₃,人生如果蛋白表达逐渐增加的控制,BMSC, VEGF-BMSC,分别和虚假的操作组。VEGF-BMSC组显示这四个蛋白的表达明显高于相比对照组( )。VEGF-BMSC组VEGF表达水平最高,其次是BMSC,虚假的操作组和对照组。VEGF-BMSC组中细胞角蛋白的表达水平略高于BMSC组和虚假的操作组没有显著性差异,并与对照组相比显著升高。相比与干细胞移植后8天,第四天没有显著差异表达的蛋白质。(图3,补充图2)。

3.4。信使rna的表达VEGF,整合素α_νβ₃,生活

子宫内膜接受mRNA表达的标记4和8天治疗后如图4并补充图3。VEGF-BMSC组表现出VEGF mRNA的表达显著高于BMSC组和对照组和类似的水平与虚假的操作组。生活mRNA表达VEGF-BMSC组显著高于BMSC组和对照组,类似与虚假的操作组。整合素的α_νβ₃mRNA表达VEGF-BMSC组和BMSC组相似,都与对照组相比显著升高。

3.5。Pinopodes的子宫内膜

在对照组中,子宫内膜薄。丰富的微绒毛,没有发达pinopodes腔的细胞观察。bmsc组和VEGF-BMSCs组,微绒毛逐渐减少的数量和长度。光滑纤细的从细胞顶膜形成的预测,pinopodes转换。我们可以观察到pinopodes是发展中国家和一些短表面的微绒毛VEGF-BMSCs组和虚假的操作组。之间没有明显差异VEGF-BMSCs组和虚假的操作组的数量pinopodes(图5)。

3.6。胚胎植入后VEGF-BMSCs / bmsc移植

胚胎移植效率的最佳指标是评估VEGF-BMSCs / bmsc移植的治疗效果。为了检测效果的bmsc / VEGF-BMSCs薄子宫内膜和子宫内膜接受,我们看了不同组的大鼠胚胎移植效率。虚假的操作组显示胚胎移植效率最大,其次是VEGF-BMSCs集团BMSC组和对照组。虚假的操作组表现出明显提高胚胎移植效率与bmsc组和对照组相比,并没有显著区别虚假的操作组和VEGF-BMSCs组。(图6,补充图4)。

4所示。讨论

有很多实验研究显示的有利影响VEGF gene-transfected干细胞移植在许多疾病,例如骨缺陷,中风,心肌梗死、急性肾损伤,和支气管肺的发育不良。(22- - - - - -25]。

目前,没有报道VEGF gene-transfected干细胞移植作为治疗子宫内膜薄或。我们都知道,血管生成是必要的为月经后子宫内膜的再生和发展中扮演着重要的角色的成功的胚胎植入子宫内膜接受(26,27]。大量的研究探讨了子宫内膜血管生成的监管和显示,子宫内膜的血管化是由VEGF,在人类子宫内膜中表达的是28- - - - - -32]。因此,薄的子宫内膜的病理生理学是受损的血管生成和减少子宫的血流量。

我们先前的研究已经证明,BMSC移植能促进子宫内膜薄的生长,提高子宫内膜接受(12,13]。这是认为VEGF gene-transfected BMSC将是一个更好的治疗子宫内膜薄。目前的研究是第一次实验,评估了VEGF-BMSCs移植对薄的子宫内膜的影响在老鼠模型中。

在我们的研究中,我们发现老鼠VEGF-BMSC组比对照组有较厚的子宫内膜和BMSC集团和细胞角蛋白和波形蛋白的表达VEGF-BMSC组比对照组和BMSC集团。我们发现表明,静脉输液VEGF-BMSCs促进子宫内膜的再生细胞和子宫内膜薄有更强的治疗效果。

我们不仅检查了子宫内膜再生还评估了子宫内膜接受。目前的研究发现,整合素的mRNA和蛋白表达α_νβ₃和生活大大减少在薄薄的子宫内膜老鼠没有BMSC或VEGF-BMSC移植,几乎和BMSC / VEGF-BMSC治疗规范化整合素的表达α_νβ₃和生活。子宫内膜功能的重要监管机构、整合素和生活被认为是子宫内膜接受的标记,在胚胎植入发挥重要作用[33,34]。整合蛋白属于跨膜糖蛋白家族,整合素α₁β₁,α₄β₁,α_νβ₃被发现在20到24天的子宫内膜coexpressed人工月经周期(35,36]。这三个整合蛋白被认为是子宫内膜接受标记,和α_νβ₃被发现是重要的胚胎过程中附件。生活所表达的受体是胚泡以及子宫内膜,以最大的生活mRNA和蛋白的表达发生在子宫内膜上皮植入窗口,所以它被认为发挥重要作用在植入37]。

除了蛋白质子宫内膜接受的标志,我们也观察到pinopodes,光滑的蘑菇型预测的顶端表面出现子宫内膜和被认为是子宫内膜接受标记(38]。pinopodes观察一段时间,24至48小时,在植入哺乳动物(39),这取决于卵巢激素,尤其是孕激素。大鼠子宫内膜,pinopodes清晰地区分开的窗口的外观感受性与数字上升怀孕的4天,5天丰度(406天,快速下降(38,41]。结果表明,有发达的pinopodes虚假的操作组,bmsc集团和VEGF-BMSCs集团,没有pinopode对照组。pinopodes的功能还不清楚。pinopodes可能有一些受体的表面粘附分子,这是必不可少的胚胎植入(42]。体外研究发现胚胎对子宫内膜上皮细胞,并提议pinopode改善附件胚泡在子宫内膜着床的过程(43]。

因此,生育测试表明,胚胎移植效率明显高于在bmsc组和VEGF-BMSCs组与对照组相比。研究已经证实,UC-MSCs能促进子宫内膜胚胎植入子宫内膜增殖和恢复能力(44]。这与我们的研究结果是一致的。我们发现VEGF-BMSC移植不仅促进子宫内膜的再生,而且改善子宫内膜接受能力,展示一个更好的治疗效果与bmsc单独治疗。

我们的数据,显示出更强的信使rna和蛋白质的表达细胞角蛋白、波形蛋白,整合素α_νβ_3,和生活,表明,干细胞移植可能不仅对子宫内膜的再生带来有益的影响,也为改善子宫内膜接受带来好。

Asherman综合征或子宫内膜薄,干细胞移植似乎是最有前途的治疗。一些动物研究显示显著增强msc移植后的子宫内膜厚度和接受到的老鼠模型子宫内膜薄(10- - - - - -13]。所有实验组显示改善bmsc的纤维化再生能力水平,阐明子宫内膜薄老鼠充满bmsc [12,13]。发现移植细胞可以迁移到子宫宫内或尾静脉注射后受伤。所以迁移到受伤的网站和/或免疫调节效应的可能机制是干细胞的影响(10,11]。干细胞不仅促进子宫内膜细胞分化、增殖和血管化10),但也减少了纤维化,确保组织修复。最后,干细胞移植修复子宫内膜功能,最终提高生育率11]。

干细胞治疗子宫内膜薄或也应用于人类。干细胞治疗人类的第一份报告是在2011年出版的(14]。自体骨髓基质干细胞移植入子宫内膜腔与耐火材料薄的子宫内膜(3.6毫米)(14]。最后,适合胚胎植入子宫内膜。另一项研究[16]调查6的女性,发现移植自体bmsc显著提高胚胎植入。随后,Santamaria et al。15)移植自体CD133 + bmsc为11和5子宫内膜萎缩(ET < 5毫米)妇女和显示子宫内膜功能修复细胞疗法后两个月。鼓舞地,最近的一项研究[17]发现,移植自体月经血液基质细胞(menSCs)可能增加严重的子宫内膜厚度;建议自体menSCs移植可能是最严重的可能选择。上述研究表明,干细胞在子宫内膜再生治疗有效。

本研究首先探讨VEGF的影响gene-transfected BMSC移植的子宫内膜薄,鼓舞人心的结果。然而,也有一些局限性。首先,目前的研究没有调查VEGF-BMSCs治疗子宫内膜薄的作用机理。其次,安全的VEGF gene-transfected bmsc移植是不清楚,因此临床应用之前很长一段路要走。第三,目前只是评估子宫内膜的再生和子宫内膜接受治疗后没有观察胚胎着床和妊娠。

5。结论

总之,VEGF gene-transfected bmsc移植将是一个比bmsc移植治疗子宫内膜薄。进一步的研究,评估VEGF-BMSC安全的治疗,其作用的机制,需要在未来。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

伦理批准

老鼠协议是动物实验和福利伦理委员会批准的中南大学(2015007)。

的利益冲突

无利益冲突与提交的手稿。

作者的贡献

赵j .和李y . p .导致设计实验。赵j .和燕y进行动物实验,获取和分析数据。黄x参与了文章的修改。所有作者文章的最终批准。

确认

作者感谢亦可博士,他在医学遗传学国家重点实验室工作,中南大学的中华人民共和国,在实验中,他的伟大的帮助,也感谢大家在湘雅医院生殖医学中心,中南大学,为自己的科学建议和鼓励。这项工作得到了国家自然科学基金(批准号81401269)。

补充材料

图S1:大气气溶胶的子宫内膜细胞和子宫内膜接受免疫组织化学标记。A, B, C, D代表对照组,BMSC集团VEGF-BMSC组和虚假的操作组。图S2:相对水平的标记为子宫内膜细胞和子宫内膜接受西方墨点法。A, B, C, D代表对照组,BMSC集团VEGF-BMSC组、和虚假的操作组治疗后4天,8天。图S3:放大曲线、融化曲线和PCR的标准曲线。图S4:胚胎移植效率的对照组,BMSC集团VEGF-BMSC组和虚假的操作。(补充材料)

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