影响移植Heparin-Poloxamer水凝胶结合牙髓干细胞和bFGF在脊髓损伤修复

文摘

脊髓损伤(SCI)是一种严重的中枢神经系统创伤性疾病,也没有有效的治疗方法,因为它复杂的病理生理学。组织工程策略包含支架、细胞和生长因子可以为科学提供了一种有前途的治疗方法。水凝胶的三维网络结构和仿生微环境可以支持细胞增长和嵌入持续释放的生物大分子。牙髓干细胞(DPSCs),来自颅神经嵴,具有间充质干细胞(MSC)特点及有能力提供神经保护和神经营养属性科学治疗。基本成纤维细胞生长因子(bFGF)能够促进细胞的存活和增殖能力,也有有益的影响SCI后神经再生和功能恢复。在此,热敏的heparin-poloxamer (HP)水凝胶含有DPSCs和bFGF准备,和HP-bFGF-DPSCs对SCI后神经元修复的影响被功能恢复评估测试,免疫印迹,磁共振成像(MRI),组织学评价,免疫组织化学。结果表明,移植惠普水凝胶含有DPSCs和bFGF有显著影响脊髓修复和再生,并可能为神经元的修复提供一个有前途的战略,SCI后功能恢复,和组织再生。

1。介绍

脊髓损伤(SCI)是一种常见的中枢神经系统疾病,导致部分或完全丧失运动和感觉功能的1]。SCI的病理过程可分为两个阶段:第一阶段包含的主要机械损伤脊髓导致直接损害和损失的轴突,神经细胞和血管和第二阶段包括二次损伤会引起神经炎症反应导致的,血脑屏障破坏,氧化应激和细胞凋亡2,3]。这个复杂的病理生理学阻止脊髓组织再生和修复。同时,功能恢复SCI后常规疗法已经很少被提升到一个满意的水平的限制必要神经元前体细胞中是至关重要的更新和胶质细胞再生4,5]。因此,一个有前途的战略发展的促进功能恢复SCI后仍然是一个重大挑战。

有一些研究表明,干细胞移植将为科学提供一种有效的方法治疗由于其神经分化的潜能。这种潜在的可以提供新的神经细胞以取代死亡细胞和产生大量的营养因素,例如,神经生长因子(神经生长因子),脑源性神经营养因子(BDNF)、神经胶质细胞line-derived神经营养因子(GDNF)和生成3 (NT-3),为了促进神经生存和再生(6]。牙齿干细胞(DSCs),例如,牙髓干细胞(DPSCs),从人类脱落乳牙干细胞(棚),干细胞从顶端的乳头(scap),牙科毛囊干细胞(DFSCs)和牙周韧带干细胞(PDLSCs),被认为是一个有吸引力的来源的间充质干细胞(msc)和展览干细胞自我更新和multilineage分化潜能等特点(7,8]。DPSCs,第一个dental-related干细胞,是孤立的从2000年的第三臼齿Gronthos博士(9]。DPSCs拥有的特点发现了msc multidifferentiation潜力,神经和免疫调节等属性和表达MSC-like标记,如CD73 CD90、CD105, CD146, CD166 STRO-1 [10,11]。此外,来自颅神经嵴,DPSCs也可以表达巢蛋白等神经标记,β微管蛋白三世,胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和microtubule-associated protein-2 (MAP-2) [6,12,13]。研究表明,当感应,DPSCs可以分化成neuronal-like和oligodendrocyte-like细胞,导致轴突再生和修复SCI后(14,15]。证据也表明DPSC移植可以通过分泌BDNF促进运动功能恢复,GDNF, NT-3 SCI后。因此,DPSCs有能力提供有益的科学治疗策略由于其神经元分化潜力和神经保护和神经营养属性(16,17]。然而,它不太可能实现一个完整的恢复神经元函数SCI后DPSC-alone策略因为很难保证一个有效的细胞密度和受伤的网站的增长。最近,研究者和临床医生提出,组织工程技术包括支架、细胞和生长因子将提供一个有前途的战略SCI治疗(18,19]。

人类基本的纤维母细胞生长因子(bFGF)是纤维母细胞生长因子家族的一员,可以调节细胞增殖和生存在体外(20.]。此外,bFGF是神经系统中高度表达,证实bFGF可以提供神经保护受伤神经元轴突和促进功能恢复后SCI (19,21]。然而,随着生物大分子蛋白质、bFGF很难通过血脊髓屏障,和bFGF是弱势群体的快速扩散和半衰期时间短22]。为了克服这些缺点,原位交付系统应设计局部扩散bFGF在SCI受伤的网站。

生物材料支架是组织工程的关键组件之一为细胞粘附和移植提供一个平台和允许交付生长因子,以确保细胞的生存和增殖23]。此外,一些研究表明,生物材料支架相互作用的细胞有一个调节细胞功能和行为的能力。例如,基体刚度矩阵的拓扑,结构,机械力,和生化特性的生物材料支架形式不同的组织微环境调节细胞生长、增殖、迁移和分化24- - - - - -27]。因此,理想的支架应该低/无毒性,cytocompatibility好,和组织相容性,结构稳定性和模拟3 d生物微环境(23]。最近,水凝胶被认定为吸引力的组织工程支架由于类似的三维网络结构的天然细胞外基质的能力来适应细胞和生物活性分子,和能力保持支架的结构和孔隙度(28- - - - - -30.]。

在这项工作中,我们设计了一个新颖的热敏的heparin-poloxamer (HP)水凝胶含有bFGF和DPSCs,可送到脊髓受伤的网站,以确保高密度的DPSCs bFGF在复苏和持续的影响。我们先前的研究表明,惠普控制相变温度的变化的特点,提出一个解决方案状态在4°C和成为一个水凝胶状态在人体温度(31日]。此外,惠普具有高度的亲和力等生长因子(GFs)神经生长因子(神经生长因子)和酸性成纤维细胞生长因子(aFGF),也能够防止GFs蛋白酶降解[32,33]。此外,惠普水凝胶显示三维多孔结构和伟大cytocompatibility [30.,34]。因此,在这项研究中,我们使用惠普作为组织工程支架和移植惠普水凝胶含有bFGF和DPSCs进入脊髓受伤的网站为了调查DPSCs的影响结合bFGF在SCI后神经再生和功能恢复。

2。材料和方法

2.1。隔离和DPSCs文化

影响第三臼齿没有龋齿,牙周病,收集或根尖周的疾病从健康志愿者(18 - 30岁)在口腔颌面外科学系,温州医科大学口腔医院、温州,中国。齿面被75%的酒精消毒和牙髓组织被牙科机头,然后切成小块(约1毫米×1毫米×1毫米),洗了三次磷酸盐(PBS) 2.5%的抗生素。果肉组织投入1.5毫升EP管和消化3毫克/毫升胶原酶I型(美国Gibco)和4毫克/毫升dispase(σ,德国)30分钟37°C。然后细胞悬液和果肉组织培养在37°C公司5%₂调湿大气α修改鹰的介质(α美国Gibco mem)补充20%胎牛血清(美国Gibco的边后卫),100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素(美国Gibco)。后的培养基代替文化前5天,然后每3天更换一次常规培养基。

2.2。流式细胞术

DPSCs的特点通过流式细胞术,并识别过程DPSCs被形容为以前的方法(35]。短暂,90%融合后,第二通过DPSCs以流式细胞术使用人类CD73的抗体(BD Pharmingen™,美国),CD90(美国BD Pharmingen),存在(美国BD Pharmingen), CD19(美国BioLegend), CD14(美国BioLegend), HLA-DR(美国BioLegend)根据标准协议。数据评估CytoFLEX流血细胞计数器(美国加州贝克曼库尔特)。

2.3。Multilineage分化

成骨的multidifferentiation DPSCs的潜力进行了分析,脂肪形成的,chondrogenic和神经源性分化重组。分化的过程描述如下:

成骨分化:60% - -70%融合后,培养基是小心翼翼地从每个,取而代之的是2毫升的吸气OriCell TM间充质干细胞成骨分化培养基(美国Cyagen),介质是改变每3天。经过2周的分化,细胞被固定为4%甲醛30分钟和染色茜素红S 5分钟。最后,这些细胞被可视化和分析光显微镜下(TS100、尼康、日本)。

脂肪形成的分化:当细胞约100%汇合的或postconfluent生长介质小心地吸气,OriCell TM脂肪形成的间充质干细胞分化培养基(美国Cyagen)添加根据制造商的指示。年底分化,细胞被固定为4%甲醛30分钟和沾油红O 30分钟。这些细胞被可视化和分析通过光学显微镜(TS100、尼康、日本)。

Chondrogenic分化:DPSCs收集密度为2.5×10⁵细胞每口井和离心机在1000 rpm在室温下5分钟。然后小球被孵化chondrogenic介质在37°C, 5%的公司₂湿润的气氛。每3天chondrogenic介质被改变。30天后,chondrogenic丸是收获,与4%甲醛固定并与阿尔新蓝染色,然后可视化和分析了光学显微镜(TS100、尼康、日本)。

神经源性分化:DPSCs镀上盖滑落在6-well板块4×10的密度⁴细胞每口井和孵化公司37°C的5%₂湿润的气氛。1天之后,细胞培养基是改变神经元的诱导培养基和血清DMEM-high葡萄糖包含10⁻⁷50 M地塞米松,μ50 g / mL抗坏血acid-2-phosphate,μ吲哚美辛,10μg / mL胰岛素,和0.45毫米3-isobutyl-1-methyl-xanthine 6天,然后神经诱导介质改变每3天。最后,这些细胞被评估与巢蛋白免疫荧光染色(1:1000年,Sigma-Aldrich,美国),NeuN(热费希尔1:200年,美国),GFAP(1: 200年,Sigma-Aldrich,美国),β微管蛋白III (1: 2000,Sigma-Aldrich,美国)。

2.4。CCK-8化验

确定bFGF的效率影响DPSCs体外,细胞增殖是由CCK-8评估分析(Dojindo、熊本、日本),下面的方法(36]。人类基本的纤维母细胞生长因子(bFGF)所提供的合成和生物技术和制药工程重点实验室,温州医科大学。DPSCs镀到96孔板的密度为2.0×10³每口井的细胞培养αmem补充10%的边后卫,100 U /毫升青霉素,100μg / mL链霉素,作为对照组。实验组是培养基含有bFGF和bFGF的最终浓度被设定为20毫微克/毫升(37]。细胞培养基是改变了每隔一天。后1、3、4、5、6、7天的孵化,10μL CCK-8解决方案添加到每个好,5%的另一个1小时孵化有限公司₂在37°C。OD值在450海里的吸光度测量光度学的标仪(美国热费希尔Varioskan勒克斯)。

2.5。制造HP-bFGF HP-bFGF-DPSC水凝胶

泊咯沙姆407年获得Badische苯胺苏打水为Ga(上海,中国)。准备heparin-poloxamer (HP)是在我们以前的工作描述如下31日]。首先,407年泊咯沙姆diaminoethylene解决方案被用来准备monoamine-terminated泊咯沙姆(MATP)。然后,MATP与肝素钠盐反应1-ethyl-3 - (3-dimethylaminopropyl)碳化二亚胺(EDC)和N-hydroxysuccinimide (NHS) 4-morpholine乙烷磺酸(MES)缓冲区1天以形成酰胺债券通过407年泊咯沙姆胺组与肝素的羧基的耦合。最后,混合与去离子水透析约72小时,冻干的冷冻干燥机为了获得最终的产品。

根据冷HP-bFGF水凝胶制备方法如前所述[38]。短暂,冻干惠普粉与bFGF混合解决方案在4°C下温和搅拌2小时,然后混合物被储存在4°C在一夜之间获得一个透明的解决方案,导致惠普和bFGF加载。

惠普的准备/ HP-bFGF装满DPSC水凝胶,DPSCs离心法分离和收集的1000 rpm 5分钟和resuspended完成αmem培养基。然后DPSC悬浮液加入惠普/ HP-bFGF彻底解决方案和混合在4°C,保持在37°C, 5%的公司₂孵化器获得HP-DPSC HP-bFGF-DPSC水凝胶。

2.6。惠普和HP-bFGF水凝胶的形态

惠普和HP-bFGF水凝胶的形态观察通过扫描电子显微镜(SEM, h - 7500、日立、日本)与加速15千伏电压。惠普和HP-bFGF水凝胶擦在铜网格,在液态氮冷冻。然后,水凝胶在临界点干燥,真空冷冻干燥48小时。标本的表面与黄金sputter-coated SEM观察。平均表观孔隙大小(dpore)是衡量从SEM图像高分辨率的成像处理系统(hlpas - 1000,温州医科大学,温州,中国)。

2.7。生活/死亡分析

可行的百分比DPSCs在水凝胶被生活/死可行性/细胞毒性评价工具(美国CA英杰公司)根据制造商的指示。与惠普和后DPSCs cocultured HP-bFGF水凝胶为48小时,样本孵化与试剂37°C 15分钟,然后观察到荧光显微镜(Eclipse 80 i、尼康、日本)。

2.8。动物模型的SCI和HP-bFGF-DPSC水凝胶的应用程序

72 Sprague-Dawley雌性老鼠(200 - 250克)是购买从中国科学院动物中心(上海,中国)和安置在动物保健设施在手术之前14天。所有实验的指导中国国家卫生研究院和动物保健和使用委员会温州医科大学。实验被分成6组,包括惠普、HP-bFGF, HP-DPSCs, HP-bFGF-DPSCs, SCI和虚假的对照组。bFGF的工作浓度被设定为3μ克/μL (39]。动物是由腹腔麻醉管理10% chloralic一再出现的问题在一个剂量的3.5毫升/公斤体重。麻醉后,回头发剃,皮肤和70%的酒精消毒的解决方案。切口延长后的中间暴露了脊柱,进行椎板切除术在T9脊椎节段水平。脊髓完全暴露和中度损伤是由血管夹剪裁2分钟(30克部队、奥斯卡、中国)。SCI后,10μL(包含3μ克/μL bFGF在适用)的惠普,HP-bFGF HP-DPSC, HP-bFGF-DPSC水凝胶原位注射微量调节注射器。动物在SCI模型组接受相同的手术和注射无菌生理盐水的解决方案(10μL /动物)。假针灸对照组相同的手术,但脊髓血管夹并未受伤。术后动物是传统安置和膀胱是手动清空一天两次。

2.9。功能恢复分析

所有动物的功能恢复评估低音部,贝蒂,和Bresnahan (BBB)评分法,斜面测试,路透社计分法,和足迹测试如前所述29日,40,41]。BBB评分方法,从0(无运动)21日(正常步态),进行在第一天评估运动功能改善,3、7、14、21、28。斜面的测试,所有的动物都在同一时间点执行。的最大角的斜面动物呆了5秒被记录为每个老鼠,和用于每一组的平均得分是。路透社评分方法,从0(正常)11(没有感觉),执行评估上面的感觉功能恢复的同时,包括牵张反射,疼痛收缩反射回来的感觉,肌肉紧张,肌肉力量。足迹分析是在28天用红色染料染色后爪子的动物。所有功能化验记录由两个独立观察员盲实验协议。

2.10。免疫印迹分析

体内蛋白质的免疫印迹分析收集在7和21天,脊髓段(0.5厘米长)挫伤震中的解剖和存储在-80°C尽快。根据蛋白质提取,脊髓组织均质在修改里帕缓冲区包括蛋白酶抑制剂鸡尾酒(10μL / mL,通用电气医疗集团生物科学,美国宾夕法尼亚州)和离心机在12000 rpm。上层清液收集蛋白质分析。量化了提取bicinchoninic酸试剂(BCA,热科学的皮尔斯,美国)。蛋白质(80μg)被添加在10% sds - page凝胶电泳,然后转移到聚(亚乙烯基二氟化物)薄膜(PVDF、微孔、德国)。膜被封锁的5% (w/v美国)牛奶(BD)与0.05% Tween-20 tris-buffered盐水(TBST) 90分钟和孵化与以下主要抗体为16个小时在4°C: bcl - 2(圣1:300年,美国),伯灵顿(美国1:1000年,春秋国旅),Caspase-3 (Abcam 1: 1000年,英国),MBP(圣1:300年,美国),和GAP-43 (Abcam 1: 1000年,英国)。那么辣根peroxidase-conjugated二级抗体被添加到膜的另一个1小时在室温下。检测目标蛋白被ChemiDoc XRS执行⁺成像系统(Bio-Rad)。所有的测试进行了一式三份。

2.11。磁共振成像(MRI),组织学评估,和免疫组织化学分析

28天后,动物麻醉和分析MRI观察脊髓的再生。动物实验都使用通用电气执行标记HDxT 3.0 t超导核磁共振成像仪(美国通用电气医疗系统)在第二附属医院,温州医科大学。从每个动物使用一个高分辨率的矢状面图像得到旋转回声t2加权MRI序列(TR / TE: 2560/92毫秒,视场:9厘米,收购矩阵:320×256,NEX: 4.0,切片厚度:1.5毫米,频带宽度:41.67 kHz)。在核磁共振扫描过程中,动物被放在thermostat-heated摇篮维持体温在37°C。

组织学评价后28天,动物安乐死和组织感兴趣的和4%多聚甲醛灌注0.01 PBS (pH = 7.4)。段脊髓在T8-T10 6小时与4%多聚甲醛固定,脱水,增加浓度的乙醇和嵌入在石蜡,切成段,4 - 6毫米,厚度和彩色hematoxylin-eosin(他)。HE-stained组织样本在部分T8-T10光学显微镜观察到(TS100、尼康、日本)。免疫组织化学,主要抗体的部分治疗GAP-43 (Abcam 1: 300年,英国)一夜之间在4°C和孵化与辣根peroxidase-conjugated二级抗体2小时37°C。然后3的部分被封锁,3′-diaminobenzidine (DAB)。所有部分都观察到荧光显微镜(Eclipse 80 i、尼康、日本)。

2.12。统计分析

所有数据都在平均值±标准错误。独立样本t以及用于数字1 (b),2 (b),2 (d)。否则,使用单向方差分析。 被认为是具有统计学意义。使用SPSS 19.0统计分析(SPSS,芝加哥,IL)。

3所示。结果

3.1。DPSCs文化和识别

DPSCs是一种msc和拥有的属性msc等表达MSC-like标记和multidifferentiation潜力。图3(一个)表明DPSCs显示一个典型的呈形态和在第四天开始增殖,覆盖整个T-25厘米²在第八天瓶。第一段DPSCs (P₁)也有伟大的扩散和存活率。确定DPSCs、流式细胞术和multilineage分化进行调查MSC-like DPSCs的特征。如图3 (b)流仪分析,结果表明DPSCs积极表达MSC-like表型标记,例如,CD73, CD90、和存在,但负面造血干细胞表面抗原的表达如CD14、CD19和HLA-DR。由于multilineage分化(图3 (c)),DPSCs有能力形成矿化结节茜素红S染色在成骨诱导培养基,观察脂滴和油红O染色的脂肪形成的分化。此外,DPSCs还显示阳性结果chondrogenic分化与阿尔新蓝染色。

神经源性分化,DPSCs测定神经表面标记的表达巢蛋白等NeuN, GFAP和β微管蛋白III。结果表明,DPSCs巢蛋白阳性,NeuN, GFAP和β微管蛋白3(图1(一))。对照组之间有显著差异,neurogenic-induced组的荧光强度β微管蛋白3 ( )、巢蛋白和GFAP ( ),但NeuN组(图显示没有区别1 (b))。

3.2。bFGF提升DPSCs体外的增殖

的扩散DPSCs cocultured bFGF在体外被CCK-8试验(图评估4)。结果表明,细胞成长从第一天到第七天bFGF和对照组。的可行性DPSCs对照组之间无显著差异和bFGF组在第一天和第三天。然而,从第四天到第七天,bFGF细胞增殖的组比对照组要高得多。第四天,bFGF组的细胞增殖率达到最高水平相比其他组。

3.3。形态学的惠普和HP-bFGF水凝胶和Cytocompatibility DPSCs的水凝胶

水凝胶的水凝胶的微观形态学和cytocompatibility DPSCs被SEM和生活/死亡分析评估,分别。在图2(一个)惠普和HP-bFGF水凝胶,SEM图像显示多孔结构,和水凝胶的内部孔隙相互联系。同时,HP-bFGF水凝胶的孔隙大小是小于惠普的水凝胶更多的统一。和毛孔的数量在HP-bFGF水凝胶也高于惠普水凝胶(图2 (b))。如图2 (c)生活/死亡试验结果表明,水凝胶有很好的cytocompatibility DPSCs,和无数DPSCs彩色绿色,被认为是活着的。此外,的可行的DPSCs HP-bFGF水凝胶不仅仅是在惠普水凝胶(图2 (d))。

3.4。DPSCs结合bFGF SCI后增强的运动和感觉功能恢复

SCI后的运动和感觉功能恢复被BBB等级量表评估,斜面测试,足迹测试,分别和路透社评定量表。所有动物的后腿SCI后立即失去了功能,没有运动。根据BBB评分,斜面的考试分数和路透社的分数(数字5(一个)、(b)和(c)),后腿的功能在所有实验小组在第一天没有改善。从第三天到28天,运动功能评分BBB和斜面测试也逐渐增加,并减少路透社的感官功能分数被观察到,这表明感觉功能的恢复。后腿的功能恢复:HP-bFGF-DPSCs组> HP-DPSCs组> HP-bFGF组> HP组> SCI组。HP-bFGF-DPSCs集团最有益的SCI后对运动和感觉功能恢复的影响相比,有显著性差异的其他实验群体在21天或之前(补充表1)。同时,促进功能恢复后SCI HP-bFGF-DPSC组和HP-DPSCs组之间没有显著差异,在28天显示类似的效果。如足迹测试(图所示5 (d)),结果与实验观察的BBB,斜面,和路透社测试,表明HP-bFGF-DPSCs组有最好的效果在28天后腿的功能恢复。HP-bFGF-DPSCs集团协调爬行的动物尾巴复活了,类似于被观察到在虚假的对照组。相反,动物瘫痪,拖着后腿在SCI和惠普组。

3.5。蛋白表达Apoptotic-Related因素和SCI后神经元标记

在这部作品中,蛋白表达apoptotic-related因素(如伯灵顿,bcl - 2,和Caspase-3)和神经元标记(例如,MBP, GAP-43)被免疫印迹检测在7和21天,分别。在所有的实验小组,结果表明,蛋白质的伯灵顿(proapoptotic因素)和Caspase-3(主要凋亡蛋白)表示最在SCI模型组,但至少在HP-bFGF-DPSC组接近对照组。值得注意的是,bcl - 2给出了相反的结果的凋亡因子的蛋白质表达谱(图中提到的组6(一))。此外,HP-DPSC组织还显示高bcl - 2的表达和低表达的伯灵顿,Caspase-3 HP-bFGF-DPSC集团的类似。bcl - 2的结果,伯灵顿,Caspase-3表达式还表示,HP-bFGF-DPSC组相比有显著差异其他实验群体排除HP-DPSC组(图6 (b))。如图6 (c)MBP, GAP-43的蛋白质表达水平在所有实验组HP-bFGF-DPSC组> HP-DPSC组> HP-bFGF组> HP组> SCI组。几乎达到类似水平作为对照组,HP-bFGF-DPSC组显示最高的蛋白表达,其次是HP-DPSC集团,而SCI模型组最低蛋白表达(图6 (d))。综上所述,移植的惠普拥有DPSCs水凝胶和bFGF可以防止细胞凋亡,促进新的神经元再生在SCI的后来术后早期阶段。

3.6。核磁共振、组织学评价,免疫组织化学

根据功能恢复的结果分析和免疫印迹,影响神经修复和再生的顺序在所有实验群体是SCI后HP-bFGF-DPSC组> HP-DPSCs组> HP-bFGF组> HP组> SCI模型组。因此,我们选择实验组HP-bFGF-DPSCs HP-DPSCs, HP-bFGF,最好对康复的影响神经元SCI后,执行以下实验分析:核磁共振、组织学评估和免疫组织化学。根据核磁共振结果,脊髓修复和再生SCI后可以很容易地观察到。在图7(一),一些缺陷在受伤部位的脊髓HP-bFGF和HP-DPSC组,成为小于在SCI建模阶段。几乎相同的对照组,缺陷是很难看到HP-bFGF-DPSC组脊髓受伤部位,表明发生了伟大的组织修复。这表明HP-bFGF-DPSCs有能力支持神经元再生和SCI后组织修复。如图7 (b),他染色显示灰质和白质受损的结构在实验小组。与对照组相比,观察灰质的大规模杀伤性HP-bFGF集团,但腹侧运动神经元(VMNs)和一些血管再生受损区域的观察。在HP-bFGF-DPSC集团丰富的血管和VMNs形成和受灾地区的规模减少,表明良好的组织修复和再生的影响。量化腹侧运动神经元的数量(VMNs)和保存组织的百分比在脊髓的灰质描绘HP-bFGF-DPSCs组相似的组织与对照组相比,更比HP-DPSC组(图7 (c))。

根据GAP-43的免疫组织化学染色,积极的表情经常被观察到在实验(图组7 (d))。GAP-43正区域的强度是HP-bFGF-DPSC组> HP-DPSC组> HP-bFGF组。和HP-bFGF-DPSC组和对照组之间的差异在统计学上并不显著(图7 (e))。与先前的数据结果是一致的,这表明惠普的结合,DPSCs, bFGF提供了一个有前途的战略和有益的影响促进神经元再生和SCI后组织修复。

4所示。讨论

脊髓损伤(SCI),伴随着运动和感觉功能障碍和残疾,这通常是由创伤引起损害,导致增加socioeconomical成本和损害生活质量的受伤1]。很难促进神经修复和再生SCI后由于限制在必要的前体细胞和炎性细胞因子的分泌4]。牙髓干细胞(DPSCs)源自颅神经嵴和显示neural-related neural-related标记的特征包括(1)表达没有preinduced分化(6,42];(2)拥有MSC-like生物属性;和(3)有能力分化成neuron-like细胞和分泌多种神经营养因子(NFs)为了提供功能神经元和神经保护促进神经生长和再生6,9,12,14]。同时,DPSCs也形成血管和免疫调节特性来增强血液流动和提高神经再生,分别为(43,44]。在这个工作中,DPSCs显示典型的MSC-like形态,例如,成纤维细胞的纺锤体形状和表达了neural-related标记,例如,巢蛋白,NeuN, GFAP和β微管蛋白III。分化后,DPSCs演示了一个增强的表达神经标记和表达有显著差异β微管蛋白3 ( )、巢蛋白和GFAP ( )(数据1和3(一个))。结果表明,DPSCs可能是一种有前途的治疗缺陷的细胞来源等神经系统科学。尽管DPSCs疗法有先天优势的科学与其他来源的干细胞相比,例如,良好的可用性,低免疫原性,和noninvasiveness,它不太可能恢复SCI的运动和感觉功能使用单一DPSCs策略,因为周围的细胞保留和存活率受伤的网站无法保证。组织工程构建包含细胞、生长因子和支架可以提供一个组合策略促进轴突和SCI后神经元的修复和再生。

人类基本的纤维母细胞生长因子(bFGF),刺激刺激,显示等多种生物功能促进细胞增殖、细胞分化和自我更新45,46]。在我们的研究中,体外研究已经证实,bFGF可以提供DPSCs有利于生存和增殖的影响。与对照组相比,组bFGF细胞增殖率达到最高水平的第四天,逐步减少从第五天到第七天。这一现象的减少可以很大程度上归因于这样一个事实:DPSCs融合在第四天,大约90% -100%和培养皿底部完全覆盖着单层细胞。继续全面融合后的细胞培养对细胞生长有负面影响的存在抑制细胞接触,导致细胞增殖率的下降组bFGF在5 - 7天47]。然而,bFGF组的细胞增殖总是高于对照组在体外测定。此外,研究表明,bFGF促进轴突再生的能力,提供神经保护和改善行为影响体内SCI后(19,21]。其他实验还表明,bFGF可以提高神经元的存活和禁止在受伤的SCI(细胞凋亡48,49]。作为一种高分子蛋白质,半衰期很短,bFGF通常是清洁的组织很快通过酶促降解和扩散22]。因此,nanoliposomes等新交付系统和生物材料支架可以提供承诺策略来克服这些限制(30.,33]。

水凝胶已被视为一个有吸引力的生物材料支架用于组织工程由于其独特的结构来模拟天然细胞外基质,控制释放的生物活性分子,以适应种子细胞(23]。3 d网络水凝胶支架适用于细胞粘附、生长、增殖。与此同时,水凝胶具有仿生环境,可用于加载和封装生物大分子防止快速扩散和酶促降解[30.,33,34]。因此,水凝胶可以作为替代细胞外基质为组织再生提供一个工程脚手架SCI后(30.]。在这项研究中,我们开发了惠普热敏的水凝胶是无毒的,三维多孔结构。惠普的水凝胶制备肝素和泊咯沙姆,高亲和力与生长因子通过heparin-SH组。根据我们之前的研究(29日),惠普水凝胶有能力提供保护剂加载和提供生物大分子如aFGF和神经生长因子,促进轴突再生和新血管形成在SCI后受伤的网站。此外,惠普有良好的生物相容性等神经细胞株PC12体外。因此,在本研究中,惠普水凝胶被用作支架负载和交付bFGF和DPSCs SCI后原位政府因为它的三维网络结构,良好的生物相容性和高亲和力。

生活/死亡试验进行调查cytocompatibility DPSCs惠普水凝胶的体外研究。因为它的无毒性,性质温和,惠普与DPSCs水凝胶已被证明具有良好的兼容性。移植的影响惠普水凝胶含有bFGF和DPSCs神经元轴突再生和修复分析了SCI后功能恢复测试,免疫印迹,磁共振成像,他和免疫组织化学。功能恢复的结果显示,动物HP-bFGF对待,HP-DPSCs, HP-bFGF-DPSCs更好的结果比惠普和科学团体。同时,运动和感觉恢复程度的HP-bFGF-DPSC组是最好的实验人群,表明应用DPSCs结合bFGF有对神经功能的恢复和再生的影响超过bFGF-alone和DPSC-alone应用程序。bcl - 2作为凋亡因子和伯灵顿Caspase-3 pro-apoptotic因素调节细胞生存和增殖。研究建议bFGF可以防止bcl - 2细胞凋亡的表达上调和下调表达的伯灵顿为了促进细胞增殖的50,51]。DPSCs发现调节Caspase-3的表达分泌和生产许多免疫调节因子(52]。在我们的研究中,HP-bFGF-DPSC集团展示了伯灵顿的bcl - 2表达的最高和最低的表达和Caspase-3,这是符合功能恢复的结果分析。此外,GAP-43 neural-related标记和MBP HP-bFGF-DPSC组也有最高的表达式。

核磁共振的结果被用来反映修复的程度脊髓SCI后体内。HP-bFGF-DPSC显示最好的对脊髓再生的影响。的受损区域HP-bFGF-DPSCs几乎消失了,取而代之的是新再生组织,这是类似于对照组。他染色显示HP-bFGF-DPSC组有更多的新细胞再生和血管比HP-bFGF HP-DPSC集团。的受伤部位HP-bFGF-DPSCs组最小的其他实验群体相比,与对照组相似。GAP-43的免疫组织化学染色显示HP-bFGF-DPSCs组最GAP-43积极的表达,表明DPSCs结合bFGF促进神经再生有强于单一bFGF或DPSCs策略。综上所述,所有结果表明,惠普的水凝胶,DPSCs,和bFGF有更多的对神经再生的影响,功能恢复,和组织移植修复比惠普bFGF-alone或DPSC-alone策略,它可以是一个有前途的策略促进神经再生和SCI后组织修复。

5。结论

本研究首次发现的一个最优组合支架,细胞,生长因子对SCI后神经再生和功能恢复。我们的研究结果清楚地表明,移植惠普水凝胶含有DPSCs和bFGF导致对SCI的治疗非常有益的影响。因此,这项研究提供了一种新的治疗策略对于神经元修复临床需求得不到满足,SCI后功能恢复和组织再生。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

利华国际罗、Abdullkhaleg阿里Albashari和晓燕王同样贡献了这个工作。

确认

这项工作是由下列机构和赠款支持。利华国际罗:温州医科大学授予(QTJ16026),中国。剑肖:中国国家自然科学基金(81372112),浙江省级项目高层创新卫生人才的培养,中国。你们菁:UQDVCR格兰特(610709),澳大利亚昆士兰大学的。

补充材料

成对的补充材料提供了结果统计分析功能行为得分之间的组织。BBB评分: , , ;路透社分数: , , ;角得分: , , 。(补充材料)

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