慢性炎症可能增强平滑肌瘤参与开发的祖细胞

文摘

虽然平滑肌瘤的病因尚不清楚,祖/未分化的细胞群被描述的失调可能参与子宫的发病条件。此外,炎症参与一些肿瘤的发展。这项工作的目的是理解如果祖细胞维持慢性炎性微环境,提高平滑肌瘤的发展。人类平滑肌瘤细胞从12和12正常子宫肌层样品相同的患者体外分离和详尽的特征(形态、增殖、cytofluorometry分化、rt - pcr、免疫荧光、免疫组织化学、免疫印迹分析)。选择细胞因子(ELISA)和炎症相关的基因(rt - pcr)分析识别健康的子宫肌层祖细胞(mpc)和平滑肌瘤祖细胞(lpc)。结果表明,(我)mpc和lpc的分享具备干细胞特性,如immunophenotype multidifferentiation试验,(ii) lpc的倍增时间较短,一个具备干细胞基因的表达显著升高( ),(3)lpc的分泌水平显著升高( )慢性炎症相关的细胞因子和数量显著降低( )与急性炎症相关的细胞因子。尽管样本量有限,比较平滑肌瘤和正常子宫肌层组织从每个病人允许正常化的患者的差异。证明慢性炎症相关细胞因子表达模式的lpc的可能发挥作用的风险增加不良产科结果(不孕、自发流产和早产)在女性受平滑肌瘤。这些女性应该确认为“高风险”,怀孕前和怀孕期间进行专门管理。

1。介绍

子宫平滑肌瘤(子宫肌瘤)良性肿瘤起源于子宫肌层和女性生殖系统最常见的肿瘤(1,2]。他们造成长时间出血、骨盆疼痛、复发性流产、不良产科结果和不孕的重要原因3- - - - - -5]。他们的起源和病理生理学尚不清楚。各种各样的因素,从遗传畸变6)到一个未分化的细胞群,可能会导致他们(7,8),已被调查。后者支持的假设是子宫组织重塑发生在生命在生理9)和病理条件(10]。

一个可能的解释发展的平滑肌瘤是间充质干细胞活性的调节异常(9]。先前的研究[11,12)提出,未分化的细胞参与子宫肌层的病态,并平滑肌瘤发病可能受损的函数的结果,未分化的细胞的增殖和分化在卵巢激素的影响下的子宫肌层(13,14]。此外,平滑肌瘤的单克隆,源自一个改变细胞强烈执行这一假设[1,15,16]。未分化细胞一直在寻求正常子宫肌层和平滑肌瘤组织通过各种各样的技术来解决不同的问题(17- - - - - -20.]。微环境的作用已经提出了许多肿瘤类型,包括平滑肌瘤(21- - - - - -24),炎症似乎发挥不了太大作用。如果不解决,条件导致急性炎症可能成为慢性炎症,有利于肿瘤的发生和发展。慢性炎症是由细胞因子分泌的免疫系统以及未分化细胞(25- - - - - -29日),与肿瘤细胞参与复杂的相声。这些细胞因子影响增殖、纤维化和血管生成,从而维持子宫肌瘤的形成和增长(30.- - - - - -32]。考虑到(我)未分化细胞的存在可能与平滑肌瘤发病,(ii)炎症可能维持平滑肌瘤,和(3)由未分化细胞分泌细胞因子创建一个炎症微环境,本研究从子宫肌层进行分离和描述未分化细胞(子宫肌层的祖细胞,mpc)和平滑肌瘤组织(lpc的平滑肌瘤祖细胞)和评估选择炎症相关细胞因子的表达。此外,凋亡的表达(ABC家族中的一员认为是干细胞标记)和αsma、1型胶原、纤连蛋白(细胞外基质的主要组成部分参与肌瘤开发)进行了测试。

2。材料和方法

2.1。道德声明

所有病人提供他们的书面知情同意参与这项研究,机构伦理委员会批准,进行符合赫尔辛基宣言。

2.2。人体组织集合

平滑肌瘤和正常子宫肌层样本收集从12育龄妇女(范围-年)接受为症状性子宫肌瘤2月到2016年11月在安科纳“Salesi医院”。我们调查了正常子宫肌层和平滑肌瘤组织相同的12患者组织学证实平滑肌瘤的诊断。所有组织样本收集在手术室手术条件下从一个训练有素的操作员。切除子宫后,最大的一个小片段(3 - 5毫米)平滑肌瘤和一个(3 - 5毫米)从正常子宫肌层由cold-blade手术刀切除。样品被放置在MSCGM介质(间充质干细胞生长介质,Lonza,巴塞尔瑞士)和发送到我们的实验室进行处理。我们报道的尺寸(厘米),地形网站(前、后、左侧面,对侧,和宫),和位置的浆膜下、校内或粘膜下肌瘤的样本。样品的去除没有改变在任何情况下组织病理学分析。显示所有的病人一般情况良好;没有人有肌瘤切除术或子宫手术,接受药物治疗或口服避孕药在前三个月,或有证据表明生殖道感染,子宫内膜异位,或卵巢疾病。都有负面的宫颈阴道拭子采集手术之前,在增殖阶段执行的周期。 Adenomyosis or other uterine disorders demonstrated on histopathological examination were exclusion criteria.

2.3。细胞培养

组织片段(2 - 3毫米³)首先受到机械消化然后酶II型胶原酶消化与0.2% (Sigma-Aldrich、米兰、意大利)为4小时37°C;随后,部分消化的解决方案是放在6-well板块包含MSCGM介质中提高未分化细胞的生长和维护文化同样使用媒体在37°C在95%的空气和5%的公司₂。生长介质改变了24小时后删除的细胞,然后每周两次。细胞形态学评估通过相差显微镜检查(徕卡DM IL;徕卡Microsystems GmbH是一家位于德国)和生存能力通过一个自动化的细胞计数器(表达载体、米兰、意大利)。所有进一步的分析涉及独立化验标本每个参与者的前五个段落。

2.4。倍增时间

评估倍增时间,8×10⁴细胞/网上镀使用一种算法(http://www.doubling-time.com):DT =t×lg2 / (lgNt−lgN0) N0镀细胞的数量,Nt是收获细胞的数量,t是文化在时间(33]。

2.5。描述平滑肌瘤祖细胞和子宫肌层的祖细胞

细胞的特点是测试塑料依从性(34]。Immunophenotype和multipotency评估如前所述[27]。简单地说,immunophenotyping 2.5×10⁵细胞被染色了45分钟与异硫氰酸荧光素(FITC)共轭对HLA-DR抗体(正),CD14、CD19、CD34、CD45、CD73, CD90、CD105 OCT4、SOX2, NANOG, KLF4。因为它是报道(35),许多成纤维细胞的间叶细胞标记还发现,我们分析了CD9的水平(正),两个细胞所表达的不同子集。

差异化分析,细胞诱导骨细胞、软骨细胞、和脂肪细胞使用STEMPRO®骨和软骨形成和脂肪生成工具(GIBCO表达载体),分别。成骨分化被冯Kossa评估,碱性磷酸酶(ALP)染色;脂肪形成的分化是由油红染色检测;软骨形成,细胞培养在颗粒的文化系统和部分暴露在Safranin-O的解决方案。细胞培养在MSCGM仅被用作消极的控制。

具备干细胞基因的表达(OCT4,SOX2,NANOG,KLF4)分析了实时多聚酶链式反应(rt - PCR)和cytofluorometry如上报道;总RNA分离出1×10⁶细胞通过4日通过使用5 ' PerfectPure RNA净化(5 ',汉堡,德国)和retrotranscribed cDNA (GoScript™逆转录系统,Promega,意大利)。所有样品都测试一式三份的看家基因RPLP0 GAPDH和数据标准化。的两个,GAPDH是最稳定的,用于后续的正常化。放大后,融化曲线。直接检测PCR产品被测量监控我SYBR绿色生产的荧光染料(伊娃•格林PCR反应混合液,Bio-Rad)绑定双链DNA后每一个周期。这些测量被谋害周期数字。参数阈值(Ct)被定义为周期的数量才发现一个真正的信号高于背景荧光。

的信使rna检测lpc的计算是X-fold对mpc 2(表示为1)^−ΔΔCt方法(33),ΔCt = Ct(感兴趣的基因)−Ct(管家基因)和Δ(ΔCt) =ΔCt (lpc)−ΔCt (mpc)。X-fold计算为选定的基因在所有样本的lpc的十二个,mpc的样本。随后,意味着±SD从三个独立的实验一式三份的计算和显示。所有的引物序列表1。

2.6。通过免疫印迹分析凋亡表达

凋亡,ABC转运蛋白的大家庭的一员,在人类干细胞具有多药耐药性,调查由西方墨点法两种细胞类型。短暂,里帕缓冲区(150毫米氯化钠,10毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.2,0.1% SDS, 1.0% Triton x - 100, 5毫米EDTA, pH值8.0)含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(美国罗氏应用科学,印第安纳波利斯)被用于蛋白质提取从1×10⁶细胞在4日通过。蛋白质浓度测定用布拉德福德试剂(Sigma-Aldrich、米兰、意大利)。总蛋白提取(40μg)减少在德勤(0.5)10分钟在70°C和样品上运行4 - 12%梯度预制NuPAGE Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶1 h在200 V。Electroblotting执行使用iBlot®印迹干燥系统(表达载体)。一夜之间,膜被孵化与主anti-MRD1抗体(圣克鲁斯生物技术、海德堡、德国,1:400)其次是孵化二级抗体结合辣根过氧化物酶。免疫反应性的蛋白质是可视化使用化学发光底物(圣克鲁斯生物技术)。反β肌动蛋白(圣克鲁斯生物技术)是内生控制和正常的人类肺成纤维细胞(NHLFs)消极的控制。

2.7。的表达αsma、1型胶原、纤连蛋白

众所周知,即使所有间充质干细胞具有原始MSC ISCT最低标准定义的特性(梭形、multilineage分化和表面标记表达式),原产地组织留下的印记在孤立的细胞会表达一些特定的蛋白质,最好他们组织学来源的特点是(36- - - - - -38]。出于这个原因,为了更好的孤立的细胞特征,的表达αsma、1型胶原、纤连蛋白表达检测了间接免疫荧光(IIF)和免疫细胞化学(ICC)。

IIF, 1.5×10⁴细胞通过第三是电镀的,固定的,permeabilized,一夜之间和治疗用鼠标反主要抗体:anti-collagen I型(1:1000),anti-cellular纤连蛋白(1:400)和反α所有从Sigma-Aldrich sma(1: 400年,米兰,意大利)。山羊anti-mouse FITC-conjugated抗体(Sigma-Aldrich)二级抗体。

33342核可视化使用赫斯特(Sigma-Aldrich, 1: 1000)在蔡司Axiovert 200倒置显微镜(卡尔蔡司,耶拿,德国)。

国际刑事法庭,1.5×10⁴细胞从1×10⁶细胞通过第三是电镀的,固定的,permeabilized,一夜之间和孵化在4°C anti-collagen I型(1:1000),anti-cellular纤连蛋白(1:400)和反αsma(1: 400)单克隆抗体。使用streptavidin-biotin-peroxidase细胞应用技术(LSAB普遍过氧化物酶装备,Dako Cytomation,米兰,意大利)和孵化3 3-diaminobenzidine。幻灯片和迈耶的苏木精复染色。

2.8。ELISA和rt - pcr分析炎症相关细胞因子的表达

选择急性和慢性炎症相关细胞因子,白细胞介素6、IL12,干扰素-γ肿瘤坏死因子-αIL2、IL4 IL5、使用IL13 IL10 TGF -β11、IL17A和g - csf,研究了通过rt - pcr(如上所述)报道和ELISA (Multi-Analyte ELISArray装备,试剂盒,米兰,意大利)如前所述[39]。简单、中等条件的每个样本72小时mpc (1×10⁵细胞通过5)和lpc (1×10⁵细胞通过5)是用于测试。样品被分发到96 -微量滴定板和孵化在室温下2小时。洗涤后,avidin-HRP-conjugated抗体被添加到板和孵化30分钟。最后,捕获的细胞因子被添加底物检测的解决方案。450纳米的OD决心使用微量滴定板读者(Multiskan去标仪、热科学)。

由平滑肌瘤细胞分泌细胞因子的水平报告的比例水平测量相应的子宫肌层的样品。之后,意味着±SD从三个独立的实验一式三份的计算和显示。量化的mRNA表达在mpc和lpc的计算与2^−ΔCt感兴趣的方法,ΔCt = Ct(基因)−Ct(管家基因)。ΔCt计算为选定的基因在所有msc的12个样品。随后,意味着±SD从三个独立的实验一式三份的计算和显示。

其他Th1 / Th17-related可溶性表达的因素(IL22、NFKB1 IL23A, STAT3, CCR5, IL17RA, CX3CL1, CXCL12, CXCL5)也评估了rt - pcr,和mRNA计算如上所述。所有的引物序列表1。

2.9。统计分析

从至少三个独立实验的统计分析数据使用SPSS 19.0软件执行(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。所有数据是平均数±标准差。对两个示例比较,意义是由学生的计算t以及使用SPSS 17.0软件。值≤0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。样品收集

十二个3 - 5毫米的样本收集正常子宫肌层的平滑肌瘤和12个样品。中值平滑肌瘤的大小是5厘米(范围3 - 8厘米);3的前4后,2侧,1侧,2宫。位置在2例subserousal,校内4,粘膜下剩下的六个。

3.2。细胞隔离和表征

平滑肌瘤和正常子宫肌层相同的12名患者的样本用于建立细胞培养。第二段,细胞群是异构(图1(一)、前面板),可能是因为它是由分化和未分化的细胞;细胞表现出不同的形态,从圆形spindle-like和大小不同。之后,细胞出现均匀,成形态、(图1(一)底部面板)和cytofluorometric分析显示只有一个细胞群的存在。所有后续实验上分别进行细胞样本。从样本中未发现差异的两个组织团体,没有成对分析是必要的和值是12个样品的平均值。

倍增时间稳定第五段,几乎相同的两个细胞组;然后增加,增加更大的子宫肌层细胞(图1 (b))。

具备干细胞评价标准被Dominici等人证明了细胞坚持塑料和他们强烈CD73阳性,CD90、和HLA-DR CD105和消极,CD14、CD19、CD34、CD45、标记CD9(表的关键2)。

成骨细胞也能够区分,chondrogenic和脂肪形成的血统(图2)。

两种细胞类型表示NANGO OCT4、SOX2 KLF4,测试通过rt - pcr和cytofluorometry,更高的表达式在平滑肌瘤细胞(图3)。

因为所有的实验证实了他们的未分化状态,两个细胞类型被指定,分别作为子宫肌层祖细胞(mpc)和平滑肌瘤祖细胞(lpc)。

3.3。凋亡,αsma、1型胶原、纤连蛋白表达

免疫印迹反应乐队举行示威游行(分子量170 kDa,对应于凋亡)在货币政策委员会和LPC的车道。光密度分析表明MDR1expression lpc的价格高(图4),而没有信号中检测出NHLFs(负控制)。

mpc和lpc的阳性αsma、1型胶原、纤连蛋白IIF(图5)和IIC(图6),这两种细胞类型之间没有显著差异。尽管超过90%的mpc和lpc的强烈积极的所有三种蛋白质,胶原蛋白1型的染色是比其他两个微弱。

3.4。炎性细胞因子的表达谱

炎症相关的细胞因子的表达和分泌,通过rt - pcr(图分别评价7(一))和ELISA(图7 (b))。

mpc相比,lpc的表现出显著( )高水平的Th2通路细胞因子(IL4, IL5 IL10,和使用IL13), IL10显示增加了40%,显著( )低水平的Th1 / Th17细胞因子(白细胞介素6、IL12 IL17A,干扰素-γ、g - csf和TGF -β1)。

最后,IL2和TNF -α表达mpc和lpc的之间没有明显不同。因为mRNA水平和ELISA Th1 / Th17差别显示一个强大的对这些通路在平滑肌瘤细胞因子,其他可溶性因素属于这些通路的表达是评估通过rt - pcr和降低在lpc的(图7 (c))。

4所示。讨论

子宫平滑肌瘤非常常见的病变不清楚病因。一些假设已经制定和诱发因素描述(40]。负责调查的因素显著可塑性子宫导致人口祖/未分化细胞的识别,促使其失调的假说可能参与子宫疾病的发展(8,41,42]。已有多种方法被应用于识别和描述祖细胞(17- - - - - -20.,43]。

由于炎症是一个公认的几种肿瘤发病机制,炎症微环境的作用也被平滑肌瘤发展的探索。总体的假设是平滑肌瘤引起免疫环境的一部分,是慢性炎症28]。此外,慢性炎症状态增加雌性激素反过来会增加平滑肌瘤增长(44]。慢性炎症是由特定的免疫细胞因子分泌,持续未分化,肿瘤细胞(25,26),似乎是利用肿瘤细胞逃避宿主免疫系统(25]。未分化细胞微环境中发挥核心作用,调节各种免疫细胞的细胞功能包括B和T淋巴细胞、自然杀伤细胞、单核细胞和树突细胞(45- - - - - -50]。据推测,这个角色是由短期和远程信号之间复杂的相互作用可能导致广泛的分子介质,包括可溶性细胞因子和生长因子(51]。

然而,未分化的细胞和炎症之间的相关性在平滑肌瘤发病从未被探索。在目前的工作,这个问题是通过隔离和广泛的调查描述未分化的祖细胞从12个标本的正常子宫肌层和12平滑肌瘤样本。示范的茎状的immunophenotype和分化为成骨细胞的能力,软骨细胞,脂肪细胞使他们指定mpc和lpc的。第一5通道,mpc和lpc的显示一个稳定和可比DT;随后,倍增时间增加。mpc的这个增量高于lpc的(75.36±4.19和61.55±1.32小时,职责)。DT增加与减少扩散,在培养细胞衰老的表现;因为衰老是更大更多的分化细胞,lpc的似乎不如mpc分化。尽管这一发现不同意那些常et al。16),它是符合lpc的具备干细胞基因的高表达(SOX2,OCT4,KLF4)和凋亡(免疫印迹和密度测量分析可以证实这一点)。凋亡是ABC转运蛋白家族的一员,据信由天然保护干细胞免受基因损害外源性物质(52,53]。ABC家庭成员被认为是干细胞标记和可用于干细胞净化;治疗细胞与特定染料(Rhodamine123或赫斯特33342年),干细胞显示减少保留的跨膜蛋白能够注入这些染料的细胞(54]。等不同的角色已被归因于凋亡药物流出和保护细胞对凋亡细胞死亡引起的各种原因,并调节信号转导途径提高细胞生存(54]。

祖细胞被国际刑事法庭通过进一步特征的表达αsma、1型胶原、纤连蛋白。他们的表情是强劲和类似的mpc和lpc的,尽管对1型胶原染色较弱。现在也接受了,祖/水库间充质细胞是一个异质的细胞;即使细胞被Dominici满意所有的三个基本标准,祖显示生物属性,根据推导的组织可能有所不同。特定的分子、受体为特定组织,可能是由未分化细胞表达。在这种情况下,子宫肌层的特点是丰富的αsma、1型胶原、纤连蛋白。我们找到了一个可以表达这三个分子在mRNA水平;有趣的是,祖细胞平滑肌瘤不hyperexpress这些因素与子宫肌层细胞相比即使众所周知他们参与纤维化的发展。这个明显的矛盾可能驻留在这一事实的积累细胞外基质(ECM)在平滑肌瘤可能扩散的细胞特异表达的结果;在肌瘤,ECM更丰富,因为更升高产生细胞的数量。体外实验研究使用相同数量的细胞来源于子宫肌层和平滑肌瘤55]。1型胶原蛋白的表达低于其他两个分子;这可能取决于低分泌的TGF -β1采用免疫酶联试验观察。TGF -β1实际上是被称为一个伟大的促进胶原蛋白1型生产(56,57]。

至于炎症的作用,能够很好的接受,平滑肌瘤发病可能与活动性炎症(21)和未分化细胞参与微环境的形成。由于这个原因,一组12个急性和慢性炎症相关细胞因子在lpc的评估,mpc mRNA表达和分泌。

虽然白细胞介素6、TNF -α干扰素-γ、g - csf和TGF -β1,与平滑肌瘤发展(58,59),在这两种类型的细胞中都有表达,最值得注意的发现是明显不同的表达Th2和Th1 / Th17通路在lpc的和mpc。事实上,lpc的表现出明显的表达IL4, IL5, IL10,使用IL13 (Th2通路)和显著降低Th1 / Th17通路细胞因子的表达。特别是,他们分泌少TGF -β1,单独或结合白细胞介素6,参与幼稚t细胞的分化Treg t细胞和Th17 t细胞,进而分泌TGF -β1和IL17。Treg t细胞积极参与抑制组织炎症,和他们的抑制可能增强炎症微环境的维护,支持平滑肌瘤的发展。IL12和干扰素-γ,它允许幼稚细胞Th1 t细胞的分化,在lpc的低,而分泌IL4, IL5,使用IL13,哪个驱动器Th2 t细胞的分化,在mpc较低;这也适用于IL10,随后产生。

Th1 / Th17差别来支持对这些通路在lpc的细胞因子,其他可溶性因素相同的子组(IL22、NFKB IL23A, STAT3, CCR5, IL17A, IL17RA, CXCL12, CX3CL1, CXCL5) rt - pcr进行评估。这个面板的分子与不同的功能(趋化因子、细胞因子、转录因子和信号通路的分子)提供了一个通用的图片Th1 / Th17的参与途径。所有的分子都在lpc的表达下调,确认的upregulation Th2概要文件。Th2细胞和细胞因子与慢性炎症有关,而Th1 / Th17通路相关的急性炎症。Th2通路的upregulation lpc的可能反映了长期的炎症状态,通过旁分泌作用发挥也保持未分化的细胞,它创建一个基质支持平滑肌瘤的发展。

这些观察结果表明慢性子宫肌层的炎症和子宫leiomyomatosis之间的关系,不孕,不良产科结果(60]。事实上,肌瘤引起的一种慢性炎症反应和改变子宫肌层收缩性可能会阻碍胚胎着床,影响生育(61年- - - - - -63年]。在调用的机制来解释增加子宫肌层的收缩性是一个多余的细胞因子,生长因子,神经降压素,神经肽,脑啡肽、催产素调节器,和慢性炎症的肌瘤囊64年- - - - - -66年]。

改变endometrial-myometrial结(EMJ)似乎扮演着一个关键角色,植入失败和复发性流产。EMJ,内三分之一的相邻子宫内膜,子宫肌层提供了巨噬细胞和子宫自然杀伤细胞,对于子宫内膜decidualization midluteal窗口中植入的67年]。可想而知,校内/粘膜下肌瘤不仅身体破坏EMJ [68年- - - - - -70年),但也导致慢性炎症,类固醇受体的改变,最终植入失败。慢性促炎效应所平滑肌瘤祖细胞可以解释为什么即使小肌瘤或早期弥漫性leiomyomatosis阻碍胚胎植入。炎症刺激似乎也改变孕激素受体激活;在子宫肌层的细胞,因此,transrepressive活动提供支持的假设组织炎症,可能参与流产和早产(71年]。

总之,目前的数据表明,(i)祖细胞被发现在平滑肌瘤和正常子宫肌层,(2)这些祖细胞显示一个微分表达式与急性和慢性炎症相关的细胞因子,和(3)慢性炎症相关细胞因子的upregulation平滑肌瘤祖细胞可能有利于形成微环境适合平滑肌瘤发病和发展。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突,关于这篇文章的出版。

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