文摘

延迟的激肽释放酶治疗脑梗塞后可以改善神经功能。然而,适当的kallkrein治疗缺血性中风后没有被照亮。在这项研究中,我们比较长期的结果在三个激肽释放酶治疗方案开始老鼠脑缺血后不同时间点。此外,保护机制涉及神经发生,血管生成,AKT-GSK3βvegf信号通路进行了分析。人体组织激肽释放酶是通过尾静脉注射每天从8 h, 24小时,36小时后右大脑中动脉闭塞(MCAO)直到28日天。三个治疗方案防止神经功能障碍,但激肽释放酶治疗从8 h MCAO后最好的功效。此外,血管舒缓素治疗后8 h MCAO显著增强细胞增殖包括神经干细胞和神经干细胞诱导分化为成熟的神经元。激肽释放酶治疗从8 h也促进了血管生成比其他两种治疗方案,这是与AKT-GSK3有关βvegf信号通路。因此,我们确认三个延迟激肽释放酶治疗提供防止脑梗塞而且表明激肽释放酶治疗8 h开始有一个更好的效果比在24 h和36 h。这些发现提供了实验数据导致更好的临床应用外源性血管舒缓素。

1。介绍

中风是全世界死亡和残疾的主要原因1]。像其他国家一样,缺血性中风是最常见的类型的中风在中国(2]。根据美国中风协会的指导方针的早期管理急性脑缺血患者,静脉rtPA管理仍是唯一推荐的药理治疗急性缺血性中风后4.5小时内(3]。超过4.5小时后急性缺血性中风治疗方法正在寻求改善神经功能恢复,减少残疾。

作为一个重要的元素的激肽释放酶激肽系统(乐),组织激肽释放酶可以分裂种激肽原到细胞分裂素(如缓激肽和胰激肽)。组织激肽释放酶的生物学功能主要是由细胞分裂素结合的高亲和性细胞分裂素B1和B2受体(4]。B2受体是既定的表达,而B1受体表达在正常情况下处于非常低的水平,引发炎症或压力。完整的细胞分裂素可以绑定到激肽B2受体的代谢物kininase我,比如des-Arg9-BK des-Arg10-kallidin,绑定到细胞分裂素B1受体。此外,血管舒缓素也可以直接激活B2受体。所有组件的kk大脑中表达。缺血性中风后,kk激活激肽的表达,细胞分裂素B1,激肽B2受体是调节(5- - - - - -7]。人体组织激肽释放酶基因转移后缺血再灌注损伤对脑缺血损伤提供神经保护的激肽B2受体大鼠MCAO模型(8]。此外,血管舒缓素政府推迟了系统性的基因传递8 h MCAO后也有效地降低神经功能缺损评分和脑梗塞而不影响血压9]。同样,延迟激肽释放酶蛋白质管理焦脑梗塞后24小时显著降低高血压大鼠神经赤字(10]。因此,与tPA相比,组织激肽释放酶有有益的影响在实验小鼠中风模型广泛的几天时间窗口。更重要的是,在人类尿多中心双盲临床试验,血管舒缓素(HUK)也是有效治疗中风患者发病后48小时内(11]。数据表明,组织激肽释放酶疗法是一种很有前途的治疗急性缺血性中风。基于3000多例IV期临床研究在中国,激肽释放酶治疗效果达到88%,如果患者治疗与人类在2天内尿激肽释放酶。因此,HUK已通过中国FDA的中风患者的新药物。

然而,一些详细信息延迟激肽释放酶治疗没有探索,如缺血后不同时间点治疗是否会导致疗效差异,如果是这样的话,时间点延迟激肽释放酶的治疗将产生更好的保护。因此,在目前的研究中,我们比较延迟激肽释放酶治疗的影响从8 h, 24小时,36小时在脑缺血性中风发作后小鼠模型。此外,从的角度来看神经发生和血管生成,效果差异的潜在机制探索。这项研究提供了实验数据导致更好的临床应用外源性血管舒缓素。

2。材料和方法

2.1。动物大脑中动脉阻塞(MCAO)手术

动物实验进行按照到达的指导方针。程序的使用实验动物机构批准的动物保健和使用委员会南通大学,江苏,中国。在动物研究,指导方针有关实验动物管理事务的监管制定1988年随访。共有95个雄性ICR小鼠体重25 - 30 g被用于这项研究。MCAO行手术如前所述。简单地说,老鼠麻醉与三溴乙醇腹腔内注射2.5%。通过下腹正中切口,右颈总动脉,颈内动脉和颈外动脉手术暴露出来。一个6 - 0尼龙缝线与硅涂层(Doccol公司,雷德兰兹,CA)插入通过颈外动脉颈内动脉树桩和温柔地先进封闭大脑中动脉。获得血液再灌注,使灯丝被撤回闭塞后1.5小时。体温是37.0°C和37.5°C之间保持在手术过程中加热垫。脑血流量是由激光多普勒监测flowmetry,只有那些老鼠90%的血液流动在MCAO封锁,85 - 95%恢复血流再灌注期间被用于进一步的实验。sham-operated老鼠相同的手术,但缝合不插入。 Mice that died within 6 hrs after cerebral artery occlusion procedure were excluded from the study. All experiments were performed in a randomized manner. Evaluation of neurological deficits and brain loss was performed by an investigator blinded to the experimental treatments.

2.2。实验小组和人体组织激肽释放酶和BrdU标记

雄性ICR小鼠( )重25 - 30 g被分为五组:组1,sham-operated老鼠(骗局, )。80年总共MCAO老鼠,再灌注后6 h内5小鼠死亡。其余MCAO老鼠被随机分配到4组再灌注后8 h:组2,老鼠遭受MCAO不激肽释放酶治疗(MACO) );组3,老鼠遭受MCAO +激肽释放酶治疗连续28天每天从8 h后再灌注(KLK 8 h, );4组,老鼠遭受MCAO +激肽释放酶治疗每日连续27天开始再灌注后24小时(KLK 24小时, );组5,老鼠遭受MCAO +激肽释放酶治疗每日连续27天从36 h后再灌注(KLK 36 h, )。组织激肽释放酶(广东天普医药制药有限公司,中国)与生理盐水溶解。老鼠组3,4,5收到丸的kellikrein每日通过尾静脉注射剂量为2.4×10⁻²PNAU /公斤。BrdU,纳入的DNA细胞分裂s阶段期间,用于标签增殖细胞。BrdU(75毫克/公斤,Sigma-Aldrich)连续5天每天两次腹腔注射48 h后再灌注开始在所有的老鼠。

2.3。神经功能评估和大脑区域损失测量

在所有的动物中,行为测试的电池进行了14岁和28天MCAO后一名调查员蒙蔽的实验性治疗。评估神经功能、修改神经严重程度评分(mns)应用12]。mns包含电机、感觉、平衡和反射测试。神经功能评分在0 - 18(正常评分,0;最大的分数,18)。更高的分数表明一个更严重的伤害。此外,杆测试是用来评估鼠标运动障碍。北极测试是适应松等人与少量修改13]。总之,鼠标放置头部向上杆的顶部附近,这是磁带来创建一个粗糙表面覆盖着。花费的时间将完全向下(T /转)和总时间到地板上,四个爪子(T /地板)记录。如果动物无法完全达到地板的时间也归因于T /。每只动物5日测试试验,平均得分是作为最后一杆测试成绩。

删除和拍摄后完整的大脑在MCAO后28天,大脑区域损失决心使用甲苯基紫染色评估剩下的区域由四个20μm日冕部分减少低温恒温器。部分是安装在gelatin-coated显微镜载玻片,孵化在1.0%醋酸甲苯基紫(σ,圣路易斯,密苏里州)8分钟然后脱水顺序在70%,95%和100%乙醇和二甲苯浴在室温下。大脑的损失百分比计算的区域侧半球-侧半球/整个大脑部分×10014]。

2.4。组织学和免疫荧光细胞计数

老鼠深麻醉,贲门的灌注生理盐水,斩首,大脑被吸附在液态氮冷冻低温恒温器切片在14天,MCAO后28天。Cryosections (20μ米)和丙酮固定/甲醇10分钟−20°C和洗3次与PBS 5分钟。BrdU双重染色,部分被孵化2 N盐酸为30分钟37°C,紧随其后的是0.1米的孵化硼酸缓冲在室温下10分钟,洗6乘以10分钟TBS,封锁在TBS 10%正常山羊血清和0.1% Triton 30分钟,孵化与初级抗体BrdU(1: 800年,Sigma-Aldrich),兔子anti-Nestin(1: 100年,Sigma-Aldrich),鼠标anti-NeuN(1: 500年,Chemicon),和鼠标anti-Tuj1 (1: 50, Abcam)在4°C在TBS 1%正常山羊血清和0.1% Triton一夜之间,洗2 * 5分钟TBS和1次15分钟与TBS 1%正常山羊血清和0.1% Triton,孵化与二次抗体(1:400)为2 h洗2 * 5分钟与PBS和DAPI孵化3分钟,用水洗了2次。部分安装和可视化在共焦显微镜(莱卡),和显微照片进行进一步分析。的负染法NeuN Tuj1,部分是孵化没有主要的抗体。

抗原阳性细胞的量化进行了六10μ200 m日冕部分/动物,间隔μ米(4每鼠标领域;4 - 6小鼠每组)。细胞计数高功率(40目的)在显微镜下(日本奥林巴斯IX51)。数据被表示为阳性细胞数量/毫米²每节BrdU或double-positive细胞。所有与ImageJ图像分析软件进行了量化。

2.5。免疫印迹分析

身体的同侧的皮层组织的小鼠大脑中均质prechilled缓冲区包含50 mM Tris-HCl (pH值7.4),2.0毫米EGTA, 2毫米Na3VO4, 50 mM氟化钠,0.5毫米AEBSF 10μ10 g / ml抑肽酶μg / ml亮抑酶肽和4μg /毫升抑肽素a .匀浆的蛋白浓度测定用皮尔斯660 nm蛋白质化验设备(热费希尔科学Inc .)。样本解决10%十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(页面)和electrotransferred到PVDF膜(微孔,贝德福德,MA)。与5%脱脂牛奶阻塞后,屁股被探测的主要抗体,比如VEGF (1: 1000;美国Abcam)、anti-AKT (1: 1000;细胞信号技术,美国),anti-pSer473-AKT (1: 1000;细胞信号技术,美国),anti-pSer9-GSK3β(1:1000;细胞信号技术,美国),anti-GSK3β(1:1000;细胞信号技术,美国),或anti-GAPDH (1: 2000;美国σ),水洗,然后用相应的孵化HRP-conjugated二级抗体。protein-antibody复杂的可视化是通过使用皮尔斯ECL免疫印迹基质(热科学)和暴露于HyBlot CL放射自显影法电影(Denville科学公司Metuchen NJ)。特定的免疫染色使用多计量化软件V3.0(富士图电影有限公司)。

2.6。统计分析

分析的数据是单向方差分析其次是图基的事后测试或未配对的双尾t测试使用软件Graphpad棱镜5。数值数据提出了意味着±SD, 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。在不同的时间点延迟激肽释放酶治疗的长期预后在老鼠脑缺血模型

激肽释放酶的功效比较在不同的时间点开始,老鼠的神经功能评估在MCAO后14 d和28 d /再灌注损伤(图1(一))。我们发现所有外生组织激肽释放酶治疗从8 h, 24小时,36小时(即。,KLK 8 h, KLK 24 h, and KLK 36 h) after ischemic stroke can ameliorate the neurological deficits, but the KLK 8 h group has lower scores (better neurological outcome) than the KLK 24 h and KLK 36 h groups (Figures1 (b)- - - - - -1 (d))。在神经严重程度得分没有显著差异KLK 24 h和KLK 36 h组。

删除后,拍摄一些老鼠在不同组的整个大脑在MCAO后28 d,大脑失去使用甲苯基紫染色(图进行了分析1 (e))。结果表明,大脑失去地区KLK 8 h和KLK 24 h组而不是KLK 36 h组与MCAO组相比显著降低。大脑与神经系统功能一致,损失KLK 8 h组的面积更小比KLK 24 h和KLK 36 h组(数字1 (e)和1 (f))。这些数据表明,尽管三个激肽释放酶的治疗方案都可以减弱神经赤字在脑缺血小鼠模型中,激肽释放酶治疗从8 h有最好的效果。

3.2。激肽释放酶治疗从8 h后缺血提高Peri-Infarction地区更多的细胞增殖和侧SVZ

几项研究已经报道延迟缺血后血管舒缓素治疗增强了神经和血管生成,参与神经功能的改善。我们接下来问长期结果之间的差异这三个激肽释放酶治疗方案与神经发生相关联。使用BrdU标记增殖细胞,我们发现同侧SVZ的BrdU-positive细胞数量和peri-infarction缺血性动物高于那些虚假的集团(数字2和3)。与MCAO组相比,外生的管理组织激肽释放酶从8 h, 24小时,36小时后缺血性中风可以促进细胞增殖在侧SVZ(数字2(一部)2(b))和peri-infarction地区(数字3(一部)3(b))。更重要的是,我们还发现,有更多BrdU-positive KLK 8 h组的细胞比KLK 24 h和KLK 36 h组侧SVZ和peri-infarction地区(数字2(b)和3(b))。然而,没有明显区别KLK 24 h和KLK 36 h组(侧SVZ, 127.17±12.54和131.67±9.58, ;peri-infarction地区,99.33±9.93和85.5±4.04, )。结果表明,更多的细胞增殖灶脑梗死后KLK 8 h集团可能带来更好的神经的功效。

3.3。激肽释放酶治疗从8 h后缺血诱发更多的神经干细胞的增殖

巢蛋白中间丝蛋白,是一种神经上皮干细胞的标记。巢蛋白神经上皮干细胞的标记,我们使用双immunolabeling巢蛋白和BrdU显示神经干细胞的增殖。所有的激肽释放酶治疗方案显著升高BrdU的数量⁺/巢蛋白⁺细胞侧SVZ相比MCAO组(数字2(H-J)和2(c) )。越是观察神经干细胞KLK 8 h组比KLK 24 h和KLK 36 h组(图2(c), )。然而,没有明显区别KLK 24 h组和KLK 36 h组(47.83±3.76和44.83±2.71, )。

3.4。激肽释放酶治疗从8 h后缺血提高更多的神经干细胞的分化成熟的神经元

接下来,我们使用NeuN Tuj-1,两个成熟神经元的标记,检查是否激肽释放酶治疗可以从增殖神经干细胞诱导分化成熟的神经元。与MCAO组相比,治疗外源性组织激肽释放酶两种BrdU都增加了⁺/ NeuN⁺细胞(数据3(H-J)和3(c) )和BrdU⁺/ Tuj-1⁺细胞(数据4(H-J)和4(b) peri-infarction地区)。负控制染色NeuN或Tuj-1可用的辅助材料(所示在这里)。的BrdU⁺/ NeuN⁺细胞和BrdU⁺/ Tuj-1⁺细胞出现更多比KLK KLK 8 h组24 h和KLK 36 h组(图3(c) ;图4(b) )。然而,没有明显区别KLK 24 h组和KLK 36 h组(BrdU⁺/ NeuN⁺细胞,27.17±2.32和25.17±2.41, ;BrdU⁺/ Tuj-1⁺细胞,27.67±2.8和25.33±2.25, )。

3.5。激肽释放酶治疗从8 h后缺血Peri-Infarct地区促进更多的血管生成

血管生成也扮演着重要的角色在缺血后的长期结果。在这项研究中,分析了血管生成peri-infarction地区免疫染色和血管性血友病因子(vWF),内皮细胞标记。与MCAO组相比,三个激肽释放酶治疗方案显著增加标记的表达船舶peri-infarction地区(数字5 (c)- - - - - -5 (f),所有 ),表明激肽释放酶可能刺激内皮细胞增殖,促进了新血管的形成。在三个kellikrein治疗组中,KLK 8 h组有更多的新船比KLK 8 h和KLK 36 h组(图5 (f), )。然而,没有明显区别KLK 24 h组和KLK 36 h组(301±21.09和295±23.7, )。

3.6。通过AKT-GSK3延迟激肽释放酶治疗促进血管生成βvegf信号通路

几项研究已经报道,抑制炎症,氧化应激,并增加没有和VEGF的形成受激肽释放酶在血管生成增强。算出的分子机制,激肽释放酶治疗从8 h后缺血血管生成,我们探索AKT-GSK3β激肽释放酶治疗后vegf信号通路。结果表明,激肽释放酶治疗显著促进VEGF表达peri-infarct区与MCAO组(数据相比6(一)和6 (b))。符合血管生成在不同的激肽释放酶治疗组变化趋势,KLK 8 h有更多比其他两个治疗组VEGF表达水平。此外,我们发现在AKT-GSK3上游信号分子βvegf通路也激活激肽释放酶治疗后,也就是说,增加AKT GSK3 (Ser473)和β(Ser9)磷酸化,从而GSK3β活动减少。数据显示,血管舒缓素治疗可以激活AKT-GSK3推迟βvegf信号通路,参与agiogenesis增强。更重要的是,血管舒缓素治疗的更好效果8 h后缺血与AKT-GSK3的激活βvegf通路。

4所示。讨论

先前的研究已经显示延迟激肽释放酶基因传递或蛋白质注入8 h, 24小时或不到48 h后缺血是有效地减少神经赤字10,15]。然而,目前还不清楚这些时间点延迟激肽释放酶治疗会产生更好的保护作用。在这项研究中,我们确认延迟政府外生激肽释放酶蛋白从8 h, 24小时,36小时后缺血性中风发病预防神经功能障碍。更重要的是,血管舒缓素治疗8 h后缺血开始呈现更好的长期结果比激肽释放酶治疗从24 h和36 h。此外,延迟激肽释放酶的分子机制保护治疗神经发生和血管生成有关。

在这项研究中,两个神经功能测试应用于评估延迟激肽释放酶的影响的神经恢复缺血后14天、28天。第一个是修改神经严重程度评分(mns)包括电动机、感觉、平衡,反射测试。另一个是极测试,可以进一步评估运动机能。虽然推迟激肽释放酶治疗从8 h, 24 h, h和36都可以减少mns和地板,把时间,与之前的研究一致,治疗从8 h最好神经复苏比其他两个时间点。此外,我们还发现激肽释放酶8 h显著降低大脑的损失相比,治疗24 h和36 h。有趣的是,血管舒缓素治疗卒中后从36 h只减少了大脑神经赤字并没有减少损失。这可能解释说,脑梗塞病灶形成和不可逆转的中风后36小时内发病。事实上,一些药物治疗缺血性中风可以改善神经系统的功能,而不是减少梗死体积(16- - - - - -18]。

比较延迟激肽释放酶的影响治疗后在不同的时间点开始,我们接下来探索机制保护会计之间的差异三个激肽释放酶的治疗方案。一些分子机制与kallikrein-enhanced保护、抑制细胞凋亡、炎症等,减少氧化应激。神经发生和angionesis发挥重要作用在长期的神经恢复。神经发生的机制,我们使用BrdU,胸苷模拟,标签增殖细胞。SVZ BrdU-positive细胞和peri-infarction皮层脑缺血引起的。延迟激肽释放酶治疗从8 h, 24小时,36小时显著提高BrdU-positive细胞的数量与MCAO组表明延迟血管舒缓素预防中风与细胞增殖有关的提高。并联的增加BrdU-labeled细胞,BrdU /巢蛋白⁻阳性细胞也增加了所有延迟的SVZ激肽释放酶治疗组,也建议推迟激肽释放酶治疗促进内源性神经干细胞(nsc)扩散。nsc分化为成熟神经元后发挥作用。

通过使用colabeling成熟神经元的BrdU标记NeuN或Tuj-1,我们发现外源性血管舒缓素治疗从8 h, 24小时、36小时明显升高BrdU的数量⁺/ NeuN⁺和BrdU⁺/ Tuj-1⁺细胞peri-infarction皮层。这些数据表明,延迟治疗可以提高nsc增殖和分化成神经元。虽然在所有时间点延迟血管舒缓素治疗可以促进神经发生,更重要的是,血管舒缓素治疗8 h后缺血开始增加更多的SVZ NSC细胞和成熟神经元peri-infarction地区比其他两个时间点治疗。这些结果表明,更多的神经发生激肽释放酶治疗从8 h后缺血可能有助于其更好的长期结果。

缺血后血管生成也扮演着重要的角色在长期功能恢复(19]。之前的研究表明,血管舒缓素促进血管生成在不同的外围组织,如下肢缺血、心肌梗死和肾缺血20.,21]。在这项研究中,我们发现,与MCAO组相比,延迟治疗激肽释放酶在所有时间点开始显著增加缺血后血管密度在14天在peri-infarction区域,建议推迟激肽释放酶脑缺血的治疗能促进血管生成。这些结果与之前的报道相一致。类似于神经发生,激肽释放酶治疗8 h可以诱导血管生成比,24小时,36小时。激肽释放酶基因已被记录,它可以促进新血管形成在肢体缺血和心肌梗死(20.,22- - - - - -24]。激肽释放酶也被证明能刺激血管生成局部脑梗塞后(10,15]。我们的数据表明,延迟激肽释放酶治疗的有益作用是通过增强对血管生成的peri-infarction区,和独特的治疗效果kallikein卒中后在不同的时间是按照血管增殖的程度。

PI3K-AKT激活中起着重要的作用在血管生成调节VEGF表达(25]。VEGF是一个著名的内皮特异性血管生成因子通过刺激调节血管生成的蛋白水解活性以及内皮细胞增殖和迁移26]。

的确,以前的报告显示激肽释放酶基因转移防止急性期心肌梗死通过促进新血管形成和改善心脏功能增加一种蛋白激酶和GSK3βGSK3磷酸化,从而减少β活动。在这项研究中,我们发现所有延迟激肽释放酶蛋白治疗显著调节VEGF表达peri-infarct地区,并联AKT GSK3β磷酸化。值得注意的是,延迟激肽释放酶治疗8 h诱导比激肽释放酶激活这个途径治疗开始在其他两个时间点。这些结果表明,延迟治疗可以激活AKT-GSK3激肽释放酶蛋白质βvegf通路,这可能与血管扩散增强有关。

在这项研究中,我们表明,激肽释放酶从8 h后缺血性发作比这更有效的在24 h和36 h。结果表明,延迟血管舒缓素管理,早些时候注入是更好。但是,以确定适当的交货时间,应该做进一步的研究通过比较延迟治疗早期治疗(例如,4 h或更早)。

总之,我们的研究表明,尽管延迟系统的交付外源性血管舒缓素从8 h, 24小时,36 h提供防止脑梗塞、激肽释放酶治疗从8 h后缺血有更好的长期结果比激肽释放酶从24 h和36 h。此外,外源性血管舒缓素治疗的长期结果差异开始在三个时间点是与神经发生和血管生成的程度密切相关。这些发现将有助于选择合适的时间更好的临床应用外源性血管舒缓素。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

赵耀辉经济学倪和Kefu Cai的贡献同样工作。

确认

这项工作是由南通城市的应用研究项目(批准号BK2012081)、南通大学科学研究基金(批准号09年r20),江苏海外研究政府奖学金。

补充材料

-控制图3和图4。(补充材料)