人类Placenta-Derived间充质干细胞减少死亡率和血肿大小在大鼠急性期脑出血模型

文摘

脑出血(我)是一个重要的疾病,高度相关的死亡率和发病率。几项研究已经证明了间充质干细胞(msc)的有益作用于我,主要专注于自己的中长期效果。急性血肿扩大是我的一个最重要的预后因素。我们假设msc将降低死亡率和我在急性血肿大小,基于一些近期研究报告的发现它们对血脑屏障的影响和内皮完整。老鼠我模型用细菌胶原酶。一小时后我感应,老鼠被随机分为MSC-treated和对照组。死亡率、血肿体积,心室扩大,脑水肿,退化的神经元数目比较在24小时后我感应。紧密连接蛋白的表达(ZO-1 occludin)及凝血因子VII信使rna也相比。死亡率(50%和8.3%)、血肿大小、心室大小、半球扩大,退化的神经元数目显著降低MSC-treated组( ,0.038,0.001,0.022,和< 0.001,职责。),而ZO-1和occludin的表达更高( 和0.012)。政府的msc可以预防血肿扩张我的hyperacute阶段和减少急性死亡率提高大脑血管内皮的完整性。

1。介绍

Nontraumatic脑出血(我)是高度相关的死亡率和发病率,与预后显著恶化比缺血性中风(1,2]。此外,它是高度相关的急性死亡率;近50%的病人死后30天之前我的发病,其中一半在48小时内死亡3- - - - - -5]。尽管各种治疗方法克服我的极其不良预后的研究,包括神经保护药物管理和外源性凝血因子,只有对症治疗是目前被认为有效的治疗选项我(2,6,7]。干细胞疗法是目前被认为是最有前途的一个许多无法治愈的疾病的治疗策略和显示神经对各种神经损伤和退行性疾病模型的影响。各种临床前研究也表明对我有益的神经干细胞疗法的影响通过分泌神经营养因子(8,9]。

除了失去大脑实质组织,早期血肿扩大是一个重要的预后因素的我可以预测死亡率和可怜的功能性结果(1,10,11]。各种医学疗法克服不良预后由于血肿扩张,包括糖皮质激素管理,丙三醇,甘露醇,已经被研究过,但这些在临床试验中显示有益作用[12- - - - - -14]。最近,重组凝血因子VII管理,改善急性我通过限制早期血肿的预后增长通过因素的急性止血效果,显示潜在的好处在早期阶段的临床试验,但未能表现出显著的影响在三期临床试验(15,16]。干细胞治疗我的大多数研究都集中在神经元死亡,功能结果和血肿大小subacute-to-chronic阶段疾病的但不是预后的急性期或早期血肿扩张(8,9]。最近的研究结果表明,间充质干细胞(msc)的管理防止血脑屏障(BBB)破坏和内皮损伤表明,msc可能改善预后的我通过持续出血的预防急性期的强化大脑血管(17,18]。

我们旨在评估msc对我的影响,特别关注在急性期预后和血肿大小,并建议一个可能的机制。我们假设msc的政府会降低死亡率和急性期血肿大小的我通过一种机制与增强脑血管的完整性。

2。方法

2.1。实验动物

动物保健协议和实验程序批准的机构Hallym大学动物保健和使用委员会(协议号码Hallym 2013 - 126)。所有的实验都是按照指导方针和有关规定执行。成年男性Sprague-Dawley老鼠(250 - 350 g)被用于这项研究。老鼠被安置在监管环境(22±2°C,湿度55±5%,和12:12小时光:黑暗周期与灯光在上午8点)和接收标准饮食(厂家、京畿道、韩国)。食物和水都可以随意访问。

2.2。脑出血(我)模型

复制我持续出血,我们注射胶原酶intrastriatally细菌,如前所述19]。老鼠深深与异氟烷麻醉(3%感应,维护1 - 2%)70:30一氧化二氮和氧的混合使用异氟烷汽化器(VetEquip Inc .,利弗莫尔,CA)和被放置在一个立体框架(Tujunga科夫仪器,CA)。磨孔,和30-gauge针插入通过磨孔进入纹状体(腹坐标:0.2毫米后,5.0毫米,3.0毫米侧前囱)。然后我们注射胶原酶IV型(0.1 U, 1μ为5分钟(图左)1(一))。放置另一个4分钟后,针被缓慢。磨孔与骨蜡密封。后缝合的皮肤切口,麻醉剂被停止。当老鼠显示自发呼吸,他们回到恢复室保持在37°C。核心温度保持在36.5 - -37.5°C的恒温的全面控制(哈佛装置,Holliston, MA)。Sham-operated老鼠收到相同的颈部皮肤切口下异氟烷麻醉,但他们管理1μL无菌生理盐水对纹状体。

2.3。MSC制备和实验过程

人类placenta-derived间充质干细胞(PD-MSCs)孤立和特征如前所述20.]。胎盘组织获得知情同意与健康的母亲捐助者,CHA的机构审查委员会批准下盆唐医疗中心。chorioamniotic膜胎盘分开,羊膜和绒毛膜和蜕膜的内层的膜去掉。绒毛膜板一侧的细胞被膜,其余的解剖和剁碎。剁碎组织被胰蛋白酶的混合酶消化,DNase我,在37°C和胶原酶IV震动条件下30分钟。收集细胞培养在T25烧瓶MEM -αGlutaMAX补充10%胎牛血清,25 ng / mL FGF4(研发系统、明尼阿波利斯、MN),和1μg / mL肝素在37°C的氛围中5%的股份有限公司₂和3%啊₂。Fluorescence-activated细胞排序分析是用来确定细胞的表型。CD44的表达、CD73 CD90、CD105,和人类白细胞抗原(HLA) ABC和CD45的缺乏,CD34, CD31, HLA-DR评估确认MSC身份的细胞。

一个小时后我感应,动物被随机分配到两组:MSC-treated集团获得500组成μL暂停PD-MSCs (1×10⁶细胞)慢慢地通过尾静脉,5分钟和vehicle-treated组,由那些接受同样体积的生理盐水。总结了实验过程图1。死亡率在24小时后我归纳计算,和幸存的动物牺牲获得大脑样本分析在同一时间点。同样的程序重复添加更多的动物,作为统计分析的样本量不足的组织学评估在任何团体,因为死亡率。

2.4。组织准备

组织学评价,大鼠腹腔内注射麻醉的1.5 g / kg聚氨酯在无菌0.9%生理盐水的体积0.01 mL / g体重。脚趾夹是用来评估麻醉的有效性。动物和0.9%盐水其次是4%多聚甲醛灌注transcardially (PFA) PBS。4%的大脑被后缀PFA在PBS 1小时,然后沉浸在cryoprotection 30%的蔗糖。此后,整个大脑被冻结,所以切割在30低温恒温器切片机μ米厚度。

免疫印迹分析和实时聚合酶链反应(PCR),老鼠麻醉和灌注冷PBS。大脑被立即收获。

2.5。测量血肿体积

血肿体积测量的我在24小时后,老鼠被分为两组。这些团体是由vehicle-treated我集团( )和MSC-treated我集团( )。血肿体积是量化使用日冕部分28 rostral-caudal间隔每270的水平μm + 2.04毫米至相对于前囱−5.52毫米。体积测量是计算区域的总和乘以interslice距离(270μ米)。数码照片的连续切片,和血肿体积的百分比((血肿体积/大脑半球体积)×100)测量使用ImageJ (NIH的贝塞斯达,MA) [21]。这个分析是由一名调查员盲实验群体。

2.6。心室大小和半球扩大分析

调查的心室大小和半球扩大我在24小时后,老鼠被分为两组。这些团体是由vehicle-treated我集团( )和MSC-treated我集团( )。大脑冠方用低温恒温器切片机在30被削减μ米厚度。部分与甲苯基紫染色和可视化光学显微镜下(奥林巴斯显微镜IX70,奥林巴斯、东京、日本)。整个大脑区域和使用ImageJ心室测量的面积,与心室的面积表示为一个百分比的大脑区域(22- - - - - -24]。先前所描述的方法(25),脑水肿测量使用ImageJ软件半球的比例扩大,由下列公式计算:[(侧半球体积−侧半球体积)/侧半球体积)×10025- - - - - -27]。这些实验分析的盲法队列。

2.7。检测神经元死亡

神经元死亡是评价Fluoro-Jade B (FJB Histo-Chem,杰斐逊,AR)染色后24小时内我(28]。部分在PBS冲洗和安装到gelatin-coated幻灯片,然后滑温暖干燥。幻灯片是在100%乙醇浸泡3分钟,其次是70%的乙醇为1分钟和蒸馏水(DW) 1分钟。幻灯片被转移到0.06%高锰酸钾15分钟,轻轻搅拌。在DW冲洗后1分钟,30分钟的幻灯片是孵化FJB 0.001%,刚做好的通过添加20毫升0.01% FJB解决180毫升0.1%的醋酸,温柔的在黑暗中颤抖。冲洗1分钟后每三个DW的变化,幻灯片是干,脱水,二甲苯和盖玻片DPX (Sigma-Aldrich有限公司、圣路易斯、钼)。量化神经元死亡perihematomal地区我后,老鼠被分为两组。这些团体是由vehicle-treated我集团( )和MSC-treated我集团( )。部分被收集在+ 1.2毫米−1.2毫米前囱根据坐标的斯劳尼克和伦纳德(29日),和七冠部分进行了分析从每个动物使用显微镜和20 x的目标。观察者蒙面治疗条件数的数量FJB-positive(+)神经元通过取样面积4.72×4.72毫米²立即毗邻血肿3感兴趣的区域(roi)同侧半球在我之后。FJB-positive细胞的数量从21个随机选择的位置/鼠标(3字段每节×7部分鼠标)是perihematomal地区平均每平方毫米和表达为FJB-positive细胞。

2.8。免疫印迹

老鼠与冷PBS灌注6或24小时后我分析的或虚假的操作使用免疫印迹紧密连接蛋白的表达。(+ 0.8毫米2毫米日冕部分相对于前囱−1.2毫米)的同侧半球在冰冷的均质里帕缓冲区(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)。BCA蛋白质测定总蛋白浓度测定的工具包(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)。然后,40μg从每个样本的蛋白质sds - page和转移到PVDF膜(通用电气医疗集团生物科技、匹兹堡、PA)。探讨了膜具有以下主要抗体:兔子anti-occludin(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA),兔子anti-zonula occludens-1 (ZO-1) (Abcam、剑桥、马),和鼠标反β肌动蛋白(圣克鲁斯生物技术有限公司、达拉斯、TX)。β肌动蛋白是用作内部加载控制。从GeneTex二级抗体都是。免疫印迹进行一种ECL检测设备(Bio-Rad大力神,CA)。相对使用ImageJ乐队每个样本的密度进行了分析。这些实验分析的盲法队列。

2.9。实时聚合酶链反应

分析凝血因子VII (F7) mRNA的表达在6或24小时我或虚假的操作后,我们进行了实时聚合酶链反应(PCR)。总RNA从身体的同侧的隔离区域脑组织使用NucleoZOL (Macherey-Nagel Duren,德国)根据制造商的指示。互补脱氧核糖核酸合成使用PrimeScript™1 st-strand互补脱氧核糖核酸合成装备(豆类生物、志贺、日本)。信使rna是量化使用智商™SYBR®绿色Supermix (Bio-Rad)只连接™实时PCR检测系统(Bio-Rad)。热循环参数测定从制造商的指令(2分钟在95°C和40 95°C的周期10年代,60°C 10年代,30年代和72°C)。以下引物被使用:老鼠F7-specific引物(向前,GCT TCT GCC CCC标签法案TT;相反,20只猫GGG TAC柠檬酸法TT)和老鼠GAPDH-specific引物(GTC, ACC ACA猫GCC ATC交流;相反,苑ACC ACC CTG TTG CTG TA)。相对使用ImageJ乐队每个样本的密度进行了分析。这些实验分析的盲法队列。

2.10。统计分析

对比MSC-treated和vehicle-treated组进行使用t以及,除了死亡率的比较,用确切概率法。数据给出平均值±标准平均误差(SEM),和差异被认为是重要的 。IBM SPSS 24.0统计(、IBM、纽约Armonk)是用于统计计算。20的样本量计算检测显著差异在24小时后死亡的比例我MSC-treated之间的感应和vehicle-treated组织(功率= 0.8),使用G3.1电力(·海涅大学,杜塞尔多夫,德国)30.]。

3所示。结果

首先,24老鼠被分配到两组(12)。6 vehicle-treated组大鼠死亡之前24小时过去了,当一个MSC-treated组的老鼠死在24小时。六个老鼠登记和分配给vehicle-treated集团,其中,两只老鼠在24小时内死亡。最后,七老鼠vehicle-treated组和八MSC-treated组大鼠在组织学分析,包括,每组三只老鼠的人登记为免疫印迹和实时PCR(图1 (e))。

3.1。PD-MSCs降低死亡率和我在急性期血肿体积

管理PD-MSCs显著降低死亡率从50%的12大鼠)(6 vehicle-treated集团8.3%的12大鼠)(1 MSC-treated集团( ,图2(一个))。最重要的预测早死的是脑损伤后血肿的大小,我紧随其后。评估是否减少死亡率MSC-treated组与减少血肿大小,我们在24小时检查血肿大小跟着我。MSC-treated组的血肿大小显著较小(13.98±2.59%)比vehicle-treated组(23.73±2.81%, ;数据2 (b)和2 (c))。这些结果表明,PD-MSCs降低了死亡率和急性期血肿大小的我。

3.2。我后PD-MSCs减少心室扩张和脑水肿

确定管理PD-MSCs减少心室扩大和脑水肿在我之后,我们测量侧脑室和半球增大的变化,分别。心室大小和半球体积保持不变在指定时间点的动物接受虚假的手术(数据没有显示)。我在24小时后,vehicle-treated老鼠表现出较大的心室大小比sham-operated集团和心室大小减少MSC-treated组相比vehicle-treated组(13.89±1.87%和5.2±0.91%, ;数据2 (d)和2 (e))。此外,半球肿大明显小MSC-treated组(22.64±2.55%)比vehicle-treated组(31.90±2.44%, ;数据2 (d)和2 (f))。这些结果表明,减弱ICH-induced PD-MSC治疗脑水肿形成和脑积水。

3.3。我后PD-MSCs减少神经元死亡

确定的神经保护效应PD-MSCs collagenase-induced我,我们执行FJB染色检测神经元退化。MSC-treated组显著减少FJB-positive perihematomal地区细胞24小时后我比vehicle-treated组(433.22±34.17和120.36±15.22细胞/字段, ;数据3(一个)- - - - - -3 (c))。此外,相反vehicle-treated集团没有FJB-positive细胞中观察到的侧海马MSC-treated小组24小时后我(数据3 (d)和3 (e))。FJB-positive细胞中没有观察到对侧半球。这些数据表明,管理PD-MSCs有效地减少神经元collagenase-induced我受伤后死亡。

3.4。PD-MSCs增加了我后紧密连接蛋白的表达

我们调查了紧密连接蛋白的表达在6和24小时后我来评估微血管完整性的变化用免疫印迹。表达ZO-1和occludin MSC-treated组显著高于vehicle-treated小组24小时后我感应( 和0.012),而不是在6小时后我感应( 和0.558,数据4(一)- - - - - -4 (c))。这些结果表明,PD-MSCs阻止血液成分的泄漏容器破裂后大脑实质我,指示一个紧密连接的屏障功能的增强。

3.5。PD-MSCs并不影响F7 mRNA表达的水平

我们调查了F7 mRNA的表达在6 - 24小时后我或虚假的操作。F7信使rna表达水平vehicle-treated组显著高于MSC-treated小组24小时后我感应( 我感应(),但不是在6小时后 ,图4 (d))。然而,没有显著差异水平之间的F7 mRNA表达vehicle-treated和MSC-treated团体在虚假的操作(24小时后 ,图4 (d))。

4所示。讨论

在这项研究中,我们发现PD-MSC政府降低了死亡率的我通过抑制急性期血肿扩张和由不同的神经保护效应,包括改善脑积水,perihematomal神经元死亡和脑水肿。目前的研究还表明,管理PD-MSCs紧密连接蛋白的表达增加与增强脑血管的完整性。这些结果表明,PD-MSCs可能治疗急性期的治疗潜力高我。

在这里,我们表明,系统性管理PD-MSCs减少死亡率、血肿大小和脑水肿/脑积水后24小时内我感应。这表明,干细胞疗法不仅可能是有用的作为后功能恢复的治疗选择我中长期神经保护,因为它的神经营养和再生的影响,但也作为一种治疗选择减少我的急性期死亡率和严重的并发症。最近,许多试验研究了利用msc /急性重症监护医学领域,因为他们的影响减少炎症和防止系统性缺血/再灌注损伤(31日]。因此,我们的研究结果还表明,政府的msc可以作为补充治疗选择常规治疗急性期我包括手术治疗,可明显改善预后。

干细胞治疗的血肿面积缩小效果我是众所周知的从各种临床前研究的结果32- - - - - -36]。这些研究大部分集中在中长期替换丢失的脑组织的神经营养和神经再生效果管理干细胞。相比之下,我们的研究表明,PD-MSCs管理有很强的影响减少血肿大小甚至在我的急性期。这表明管理干细胞也可能直接影响抑制血肿扩张,考虑到没有足够的时间失去了组织的再生和替代。免疫印迹结果显示,紧密连接蛋白的表达明显高于MSC-treated小组24小时我感应后,表明抑制急性血肿扩张可能是由于PD-MSC-mediated增强大脑血管内完整的微脉管系统在一个相对短的时间。这一发现与先前的研究是一致的,这表明,MSC政府降低血脑屏障通透性和内皮损伤和紧密连接蛋白的表达增加了后我(17,18,37]。我在大多数情况下,血肿扩张发生在24小时内发生之后无论其程度上,这意味着可能会有一个活跃的出血过程hyperacute阶段的我1,38]。因此,我们的研究结果显示显著减少血肿的大小和增加血管完整性的时间点后24小时内我感应表明MSC管理我的早期阶段可能有效地减弱这活跃出血过程。

因为脑积水和脑水肿,也反映,引起颅内压(ICP)的增加,我的主要并发症,大多数急性期的治疗策略我专注于预防和治疗这些并发症(2,6]。我们明显下降心室大小和半球扩大MSC-treated组与vehicle-treated组相比,表明这些严重并发症的改善我可能是一个重要的机制从我PD-MSCs对急性死亡率的影响。此外,显著降低神经元死亡MSC-treated组,观察到FJB疣状,表明PD-MSCs直接神经保护效应也可能有助于改善预后。特别是,没有退化的海马神经元MSC-treated集团相比,退化vehicle-treated神经元群的存在,意味着msc也可能改善全球ICP的增加引起的缺血性损伤。然而,进一步的研究可能有必要阐明是否这个结果仅仅是减少血肿扩张和ICP的结果或由于msc的直接的神经保护作用。

一些最近的研究报道,msc(促凝血的功能39,40]。值得注意的是,一项研究显示,msc导致内源性凝血因子八世的生产(41]。因此,我们旨在确定msc将增加生产F7,已作为急性止血治疗我。然而,我们没有发现显著差异表达的F7 mRNA MSC-treated和vehicle-treated sham-operated动物,表明PD-MSCs不会引起内源性F7的增加我的模型。相反,我们表现出更高水平的F7 mRNA表达vehicle-treated组比MSC-treated组在24小时后我感应。信使rna表达的增加可能导致凝血因子消耗的增加持续出血,vehicle-treated组更明显。还需要更多的研究来确定msc对急性血肿扩张的影响与促凝血的属性或其他因素的凝血系统。

我们的研究有一些局限性。首先,我们使用胶原酶注射模型复制我急性血肿扩张,产生病理生理学完全不同于真正的疾病,通常由机械张力由于高血压或动脉瘤引起的。然而,明显影响显示在这个模型中,涉及一个强大的趋势持续的出血和血肿扩张由于连续注射胶原酶的作用,表明msc展示真正的临床治疗效果。此外,这个模型会产生一致的和可预测的我和提供最好的模仿bleeding-rebleeding现象真正的人类状况(42]。第二,我们没有评估系统管理的msc的multiorgan效果。考虑到系统性msc对炎症和缺血/再灌注损伤的影响,对其他重要器官的影响也可能导致的急性死亡率下降的结果。第三,我们的量化测量的半球和心室扩大的方法不能完全反映整体脑水肿。因此,msc ICH-induced脑水肿形成的影响和脑积水可能由于体积较小的出血。进一步的研究可能需要深入研究这种可能性。

5。结论

管理的msc可以预防血肿扩张我的hyperacute阶段和减少急性死亡率提高大脑血管内皮的完整性,除了发挥神经保护和神经营养作用见先前的研究。

信息披露

Bo年轻崔和金好俊同样贡献了第一作者。

的利益冲突

作者声明没有竞争的经济利益。

作者的贡献

Tae Nyoung涌和唱歌赢得Suh设计研究和写的手稿。博俊金帮助年轻的崔和好的设计研究和写的手稿。崔Bo年轻Sae-Hong Min,宋Hyun宋进行实验程序。Sae-Hong Min和宋Hyun Jeong帮助编写文档。Bo年轻崔和Tae Nyoung钟图做好了准备1和2,Sae-Hong Min和Tae Nyoung钟图做好了准备3。所有作者阅读和批准最终起草了手稿。

确认

这项研究受到了韩国卫生技术研发项目的资助通过韩国健康产业发展研究所(KHIDI),由卫生部和福利资助(批准号俊金正日HI16C1559)好。这项工作也支持的基础科学研究项目通过韩国国家研究基金会(NRF)由教育部(2016 r1d1a1b03934928) Tae Nyoung涌。

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