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Saifun Nahar, Yoshiki Nakashima, Chika Miyagi-Shiohira, Takao Kinjo, Naoya Kobayashi, Issei saisei, Masami Watanabe, Hirofumi Noguchi, Jiro Fujita那 “使用威斯康星大学解决方案和Hank的平衡盐溶液保存小鼠脂肪组织衍生间充质干细胞的比较“，干细胞国际那 卷。2018那 文章ID.1625464那 9. 页面那 2018． https://doi.org/10.1155/2018/1625464
使用威斯康星大学解决方案和Hank的平衡盐溶液保存小鼠脂肪组织衍生间充质干细胞的比较
Saifun公司纳哈尔那1 Yoshiki中岛美嘉
那2
知花宫城Shiohira那2
kakao kinjo.那3.
小林直那4.
Issei Saitoh.那5.
Masami Watanabe.那6.
Hirofumi野口勇那2
和
藤田次郎1
1琉球大学医学院感染、呼吸和消化学系，日本冲绳903-0215
2琉球大学医学研究生院再生医学系，日本冲绳903-0215
3.日本冲绳琉球大学医学院健康科学学院基础实验科学系，冲绳903-0215
4.冈山西大寺医院，冈山704-8192，日本
5.儿童牙科，医学研究生院和牙科科学，新泻大学，新泻951-8514，日本的事业部
6.冈山大学医学研究生院泌尿科，牙科和药学，冈山700-8558，日本
摘要
在细胞分离之前保存脂肪组织是维持临床应用的脂肪组织源性间充质干细胞(ADSCs)细胞活力的重要步骤之一。汉克平衡盐溶液(HBSS)是临床上主要的ADSC保存溶液之一。然而，这一步已知会导致细胞存活率下降。威斯康辛大学(UW)的解决方案被移植医生公认为一种优秀的器官保存方案。我们的目的是研究UW溶液保存ADSCs活力的有效性。我们从小鼠腹股沟脂肪垫中收集脂肪组织，比较UW溶液和HBSS保存过夜，检测分离后的细胞活力。我们发现，在UW溶液中，每克脂肪组织中获得的活细胞数量高于hbss保存的组织。
1.介绍
间充质干细胞（MSCs）[1是再生医学中细胞治疗的一个来源。MSCs具有自我更新和形成分化细胞的能力，包括脂肪细胞、软骨细胞、神经元细胞和骨细胞[2］．间充质干细胞也调节生物功能，如生长因子的释放[3.]，并有免疫抑制作用。中MSC的若干来源，脂肪组织来源的间充质干细胞（ADSC中）4.那5.]已成为临床应用中著名的治疗工具[6.-8.］．
大多数使用ADSCs的临床研究人员遵循自己独特的分离ADSCs的方案，并且没有最佳的储存介质来保存采集后的脂肪组织。使用ADSCs进行细胞治疗的设备使用保存溶液有几个原因。首先，将组织从手术室运送到细胞处理中心可能需要几个小时到一天的时间。其次，一些临床研究人员认为，使用混合储存介质和青霉素/链霉素过夜保存是必要的，以防止细菌感染。因此，储存溶液的选择对于维持临床使用的ADSCs的功能至关重要。然而，当ADSCs在保存液中保存12-24小时后，细胞存活率下降[9.］．
汉克的平衡盐溶液（HBSS）[10.那11.]和磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液是用于存放某些类型细胞上最常见的解决方案。HBSS的基本功能是保持pH值和渗透平衡，以及提供与水和无机离子的细胞。HBSS还含有葡萄糖，其提供了细胞的能量。与此同时，一些研究报告说，美国威斯康星大学（UW）解决方案[12.-14.]对某些类型的细胞具有比其他类型的保存液更好的组织保存能力[15.］．
在这里，我们比较了UW溶液和HBSS保存的ADSCs的细胞活力。
2.材料和方法
2．1.试剂
UW溶液(Viaspan)从安斯泰拉制药公司(东京，日本)获得。HBSS和IV型胶原酶溶液来自赛默费雪科学公司(东京，日本)。所用的其他材料均为最高级的商品级。
２.２.动物保健
所有实验方案均符合琉球大学(日本冲绳)医学院研究实验室中心和医学院动物实验研究所制定的实验动物护理和使用指南。实验方案由琉球大学动物实验委员会批准(许可号:A2017101)。
C57BL/6雄性小鼠(8周龄;日本静冈县SLC)保持在可控温度(23±2℃)和光照条件下(08:30-20:30亮灯)。动物喂食标准的啮齿动物饲料颗粒，并可自由取水。所有的努力都是为了尽量减少动物的痛苦。
2.3。从脂肪组织中分离ADSCs
脂肪组织是从8周大的小鼠的腹股沟脂肪垫萃取（雄性， ）.将组织分为三组:未保存对照组、hbss保存组和UW溶液保存组。对照组则在不保存脂肪组织的情况下分离ADSCs过夜。在保存组中，脂肪组织在4°C的HBSS或UW溶液中浸泡16 h直到分离过程。如前所述，从脂肪组织中分离ADSCs [16.］．简单地说，脂肪组织在4°C的温度下储存在HBSS中，并在组织消化之前用HBSS大力清洗三次。用手术刀将脂肪组织切成小碎片，进行酶解(2 mg IV型胶原酶/ml;HBSS)在50ml试管中摇晃(旋转速度20速度/分钟，37°C, 120分钟;BioShaker BR-42FM, TAITEC，埼玉县，日本)。随后离心(800 × g) 5分钟。收集含ADSCs的细胞颗粒，用含10%胎牛血清的新鲜Dulbecco 's Modified Eagle Medium (DMEM)清洗。Gibco-Invitrogen公司，Carlsbad, CA, USA)在消化后去除残留酶，消化后的细胞在T25烧瓶中孵育(步骤说明如图所示1）.所有小鼠研究均由琉球大学动物护理和使用委员会批准。
２.４.评估细胞活力
分离后的ADSCs存活率为0.4%w/v台班蓝溶液(Wako Pure Chemical Corporation，大阪，日本)和C-Chip™血细胞计(NanoEnTek Inc.， MA，美国)。
2．5．流式细胞术
根据制造商的说明，使用NovoCyte®流式细胞仪(ACEA Biosciences Inc.， San Diego, CA, USA)进行细胞流式细胞术。简而言之，ADSCs (1 × 105.将细胞）混合成0.5ml灌注溶液（康宁，Manassas，VA，USA）。将每种抗体（体积的1/100）加入细胞混合物中并在冰上温育30分钟。用亮污染缓冲液洗涤细胞（BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，USA），进行荧光激活的细胞分选（FACS）测量。使用以下一抗抗体：辉煌的紫丁香421™大鼠抗小鼠CD44（BD Biosciences），荧光素异硫氰酸酯（FITC）大鼠抗小鼠CD90.2（BD Biosciences），PERCP / CY5.5抗小鼠CD34（Biolegend，圣地亚哥，CA，USA）和PE / CY7大鼠抗小鼠CD45（BD Biosciences）。同种型 - 相同的抗体用作对照。
2.6。Real-Time PCR和RT-PCR
根据制造商的说明(Qiagen, Hilden, Germany)，使用RNeasy®Mini试剂盒和quantitative®逆转录试剂盒制备RNA进行qPCR。AmpliTaq Gold®360 Master mix是根据制造商的说明使用的(赛默Fisher科学公司，东京，日本)。采用LightCycler 96 Real-time PCR系统(Roche, Basel, Switzerland)进行实时PCR分析。根据制造商的说明，使用了Taqman®Universal Master Mix II，无UNG(美国应用生物系统公司)。采用GeneAtlas 482热循环仪(Astec Co.， Fukuoka, Japan)进行RT-PCR。使用Aplegen®Omega Lum C (Gel Company, San Francisco, CA, USA)记录图像。
用于RT-PCR的引物包括以下内容：(我)Mouse HGF Forward，ActCTTaccaAggaAgacCCattac(2)小鼠HGF逆转，ATACCAGTAGCATCGTTTTCTTGAC（iii）小鼠EGF向前，TATCCATCGGTAATAAGGGTGAAC(iv)鼠标EGF逆转，CCAGCACACACTCATCTATATCAGA(v)小鼠VEGF向前，TGTCTTCACTGGATATGTTTGACTG(vi)小鼠VEGF逆转，TTCTCTGTCATCATCTGTCTCTCTG(七)小鼠SCAI向前，GGTTGTTTTCAGTACCTCTTTCCTG(八)小鼠SCAI逆转，CATGCTCATTACTAGAAAAGCCAGG（IX）小鼠GAPDH向前，AACTCACTCAAGATTGTCAGCAATG(x)小鼠GAPDH逆转，GCTGTAGCCGTATTCATTGTCATAC
2.7。细胞增殖
将细胞以1.0×10的密度接种在24孔板上4.细胞/。用显微镜(×40)拍摄载玻片，并计数图像中的细胞数量。将细胞播种当天的细胞数换算为100%，计算细胞的相对增殖率。
2.8。细胞分化
脂肪细胞分化是根据制造商的说明书，使用OriCell™间充质干细胞成脂诱导分化培养基（GUXMX-90031，赛业生物科学）和血脂测定试剂盒（AK09F，宇宙生物有限公司，日本东京）检查。成骨分化用OriCell™间充质根据制造商的说明干细胞成骨分化培养基（GUXMX-90021，赛业生物科学）和钙化结节染色试剂盒（AK21，宇宙生物有限公司，日本东京）检查。
2.9。统计分析
数据以平均值±标准误差(SE)表示。三组间的差异采用双向方差分析。<0.05的值被认为是统计学意义的。
3。结果与讨论
3.1。脂肪干细胞的特性隔离保护无
分离未保存的ADSCs作为对照组。在含10%胎牛血清的DMEM中培养至80%汇合。显微镜检查证实细胞大小、形状和培养状态无异常(图)2(一个)）.使用小鼠的MSC（CD44和CD90.2），造血干细胞（CD34），和白细胞（CD45）的标记，进行流式细胞术。我们观察到CD44和CD90.2但不是CD34和CD45（图中的表达2(一个))，证实分离的细胞为间充质干细胞。我们诱导ADSCs分化为脂肪细胞(图)2 (b)）和成骨细胞（图2 (b)）.成熟脂肪细胞用Oil Red O染色，成熟成骨细胞用茜素Red S染色。
（一种）
（b）
３．２．ADSCs在HBSS或UW溶液中保存后的细胞活力
为了评估各组细胞的生存能力，我们测量了总细胞数/组织重量(mg)和活细胞数/组织重量(mg)。对照组细胞总数(1.37±0.43 × 10)差异无统计学意义7./g)和2个保存组(HBSS组，1.43±0.16 × 107./ g;UW溶液组，1.52±0.33 × 107./G） （ )(图3(一个)）.这些数据表明，控制中ADSC的分离和两个保存组具有相似的加工效率。我们还计算了活细胞数/总细胞数比。对照和HBSS保存组之间的细胞活力具有显着差异，但不是UW保存的组（对照组：0.83±0.03，HBSS组：0.74±0.03，UW溶液组：0.82±0.01）（ )(图3 (b)）.这些数据表明，与对照组和UW溶液保存组相比，在HBSS中保存的ADSCs的细胞活力明显下降。每组ADSCs以1 × 10的浓度播种4.计数第3、5天的细胞数(图)3 (c)）.UW组的第3天和第5天的细胞增殖率相当于对照组的速率。然而，HBSS组的第3天和第5天和第5天的细胞增殖率明显低于对照组。在UW溶液中保留的ADSC保持了相当于对照组的细胞增殖能力。
（一种）
（b）
（C）
3.3。保存使用HBSS或UW液后的隔离脂肪干细胞的特性
小鼠ADSCs保存后的特性如图所示4.．ADSCs在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养至80%汇合。显微镜检查证实HBSS中细胞大小、形状和培养状态均无异常(图)4(一)）及UW液保存完好的基团（图4 (c)）.使用小鼠MSCs（CD44，CD90.2），造血干细胞（CD34）和白细胞（CD45）的标志物进行流式细胞术。我们观察到CD44和CD90.2的表达，但不是在HBSS中保存的细胞中的CD34或CD45（图4(一))和UW方案(图4 (c))，提示存在间充质干细胞。采用PCR检测方法确定对照组、HBSS组和UW组ADSC表面标记物CD34、CD44、CD45的表达水平。结果与流式细胞仪分析相似(数据未显示)。采用PCR检测肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGFA)和癌细胞侵袭抑制因子(SCAI)的mRNA表达水平。因此，对照组、HBSS组和UW组的细胞功能被评价为等效(补充图)1A）.我们在HBSS中诱导ADSCs的分化(图)4 (b)）及UW液保存完好的基团（图4（d）脂肪细胞)。我们还在HBSS中诱导了ADSCs的分化(图)4 (b)）及UW液保存完好的基团（图4（d）)为成骨细胞。分别用Oil Red O和茜素Red S染色证实成熟脂肪细胞和成骨细胞的存在。分化潜能的维持表现为成骨分化和成脂分化。
（一种）
（b）
（C）
(d)
脂肪组织被认为是一种可靠和丰富的成体干细胞来源的再生治疗。为了获得高质量的ADSCs，脂肪组织必须在分离前保存在适当的溶液中。我们研究了两种储存溶液(HBSS和UW溶液)在分离ADSCs前隔夜保存脂肪组织的有效性，并检测随后的细胞活力。我们发现UW溶液组的细胞存活率(82%)高于HBSS组(74%)。UW溶液对胶原酶消化有抑制作用。组织消化是从脂肪组织中分离ADSCs的最重要步骤，这使其成为一个主要缺点。为了克服这个问题，我们用HBSS或Dulbecco 's磷酸盐缓冲盐水(DPBS)清洗脂肪组织。表格1显示了UW溶液和HBSS的组成。UW溶液中钾(120 mmol/l)、镁(5 mmol/l)和磷(25 mmol/l)的含量高于HBSS溶液。它还含有许多额外的成分，如乳糖酸(100 mmol/l)，棉子糖(30 mmol/l)，腺苷(5 mmol/l)，别嘌呤醇(1 mmol/l)，和谷胱甘肽(3 mmol/l)。这些成分可能有助于维持ADSCs的存活率。然而，UW解决方案比HBSS解决方案贵十倍。同时，HBSS的组成与PBS相似，其特点是含葡萄糖(5.6 mmol/l)，价格低廉。然而，有趣的是，我们的结果表明，葡萄糖对脂肪组织保存16小时几乎没有影响。这与之前的报道一致，即葡萄糖浓度不影响人MSCs的细胞增殖[17.］．然而，在其他报道中，观察到骨髓源性间充质干细胞在糖酵解系统中线粒体较少，糖代谢较低[18.］．此外，有报道称，高糖促进MSC的骨分化[19.］．因此，含有保存溶液的葡萄糖可能是不需要维持ADSC的质量。
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4。结论
已经证实了UW解决方案以显着增强细胞存活和细胞增殖能力作为ADSC的保存溶液。然而，考虑到UW溶液比HBSS大致昂贵，我们的研究结果也表明HBSS具有充分的功能作为防腐剂。
数据可用性
用于支持本研究结果的数据可根据要求可从相应的作者获得。
利益冲突
作者声明本研究没有利益冲突。
作者的贡献
SN，YN，CS和HN设计了这项研究。SN，YN，CS和HN进行了这项研究。SN，YN，CS，TK和HN收集了数据。SN，YN，CS，TK和HN分析了数据。SN，YN，CS，TK和HN解释了数据。TM，NK，MW和JF提供了材料。SN，YN和HN提供了稿件。SN，YN和HN起草了手稿。SN，YN和HN修订了手稿的内容。SN，YN，CS，TK，NK，MW，JF和HN批准了稿件的最终版本。 SN takes responsibility for the integrity of all of the data analyses.
致谢
我们感谢纳奥米Kakazu（琉球大学）的文书协助和萨基Uema，大西结花，希比嘉，纪川平，和沙织Adaniya（琉球大学）提供技术支持。这项工作是由研究实验中心，医学院和研究所的动物实验，琉球大学医学系的支持。（JSPS; KAKENHI授权号16H07094）这项工作由日本学术振兴一部分支持，日本机构医学研究和发展，内藤基金会和冲绳科学技术促进中心（OSTC）。
补充材料
图1:ADSC在HBSS或UW溶液中保存16小时后生长因子表达水平的检测。RT-PCR评价ADSCs生长因子和细胞表面标记物mRNA表达的结果(补充图1A)。用于补充图1A(补充图1B)的印迹全长图像。（补充材料）
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