隔离、文化和人类胚胎干细胞的功能描述:当前的趋势和挑战

文摘

人类胚胎干细胞(为其举行各种退化性疾病的治疗潜力巨大。多能为有一个伟大的文化接受无限的自我更新能力和分化成体内所有细胞类型。hESC研究的旅途并不顺利,因为它面临着几个挑战,不仅局限于肿瘤形成和immunorejection也是社会、伦理和政治方面。隔离的为人类胚胎被认为是高度令人反感的,因为它需要的毁灭人类的胚胎。问题是公众和政府争论和讨论的平台,导致禁止hESC研究的世界各地的许多国家。禁止有负面影响的进步hESC研究世界各地许多联邦政府停止研究经费。之后,一些国家解除了禁令,允许hESC研究资金,但是伤害已经造成的研究进展。在这些不利的情况下,仍然取得一些进展隔离,文化,并使用不同的策略为其特征。在这次审查中,我们总结了各种策略用于成功分离,文化,为其特征。最后,为其举行了临床应用的巨大希望通过适当的策略来最小化畸胎瘤形成和immunorejection和更好的细胞移植策略。

1。胚胎干细胞:早期发现和隔离程序

胚胎干细胞(ESCs)在1981年首次分离出小鼠胚胎,胚胎干细胞”这个词是由盖尔·r·马丁。尽管如此,世界来了解ESCs突破1998年发现,在汤姆森和他的团队展示了第一次技术分离为从人类胚胎。之后,研究人员已经证明为其分化成所有身体细胞的能力,包括胰岛的β细胞(1),神经细胞(2),心肌细胞(3),和hepatocyte-like细胞(4]。为给了希望的多能功能数以百万计的患者患有糖尿病,帕金森病,心血管疾病和肝脏疾病。考虑为其拥有伟大的治疗潜力,几个hESC行生成的世界各地。为的挑战之一是隔离的方法从人类胚胎的干细胞,是为其只能从内细胞团获得人类胚胎(ICM) [5]。研究人员报道,ICM可以获得新鲜的或冷冻人类胚胎(5- - - - - -7]。此后,开发了几种方法来隔离ICM从一个人类胚胎,其中包括机械剥离,ICM是孤立的机械压力6,7]。ICM的也可以通过使用激光切割[被孤立8,9)和通过使用免疫外科学程序(10- - - - - -12]。有各种各样的好处使用一种免疫外科学过程孤立ICM,但这也有一些缺点。例如,免疫外科学过程需要包含豚鼠血清的培养基;因此,使用动物血清的免疫外科学技术不适合代clinical-grade hESC线(13]。在另一个方法,可以隔绝ICM hESC行显微解剖人类囊胚使用细针。激光辅助xeno-free活检也最有前途的技术隔离的ICM (9,14]。ICM隔离后,茎细胞生长生成ESCs使用支线层,细胞外基质,蛋白质,多肽,合成聚合物(9,14]。ICM隔离的各种方法的优缺点进行了总结表1。

ICM的隔离需要破坏人类胚胎,引发了严重的道德问题(15]。为了满足道德问题,研究人员展示了另一种方法来隔离为从单个卵裂球而不杀死或破坏人类胚胎。例如,在胚胎植入前的基因检测、胚胎活检携带单个卵裂球可以从患者获得([16,17];Klimanskaya et al ., 2009)。据报道,5 hESC行成功获得从单个卵裂球活检(16]。获得高质量的成功为其取决于囊胚和隔离程序的质量和文化条件。据报道,2 hESC线路已获得4胚泡,而只有3 hESC线可以分离出13囊胚和,在某些情况下,只能从58囊胚分离3 hESC线(13]。这些差异在隔离hESC行不同胚泡主要是由于胚胎的质量也取决于胚胎的方法隔离和文化协议(18,19]。例如,如果一个胚胎获得通过在体外施肥方法,然后是一个伟大的可能性,胚胎将postzygotic高发的染色体异常可能最终给为其质量差(13]。

在老鼠中,多能干细胞还可以来源于post-implantation-stage胚胎的外胚层,俗称外胚层干细胞。这些多能干细胞显示启动特性和高度依赖FGF和激活素信号通路的激活他们的自我更新20.,21]。因此,三个不同的多功能条件,即天真,影射,和地面多能性条件,定义了在老鼠22]。

2。为有或没有馈线细胞的培养

一旦收集胚叶细胞,它通常是与父母的胚胎活检cocultured介质包含纤连蛋白、层粘连蛋白等。培养基中添加层粘连蛋白重要的形成胚胎干细胞(ESC)像聚集。此外,有报告表明,增加血清媒体和纤维母细胞生长因子增强干细胞增殖,防止胚胎干细胞进行分化(23,24]。我们已经简要地描述各种培养条件已被用于提高质量、数量为一代。

2.1。鼠标馈线为细胞生长

小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)细胞或鼠标馈线细胞被认为是最重要的元素为因为MEF提供了有利的条件,为其增长和扩张(图1)。据报道,mef非常重要的成功的一代hESC线(11,12]。此外,早期hESC纹都是生长在媒体含有生长因子和细胞因子分泌MEF细胞,这些生长因子和细胞因子是必要维持干细胞的多能性。MEF源自鼠标来源,为其带来了严重的伦理或健康问题。此外,使用动物性的细胞可以传播动物传染性病原体为,让他们不适合人类的利用率。据报道,MEF细胞含有病毒颗粒,能够感染为其在文化(25]。此外,一些研究人员使用牛血清文化为,但是使用动物血清可以传送朊病毒和胚胎干细胞文化中动物病毒(26]。据报道,动物细胞和血清可以传播病毒和其他病原体为胚胎干细胞通过信息交互过程中在体外文化(27,28]。此外,这些致病分子会污染整个hESC文化。以防为这种病原体污染,污染问题可能会持续下去,甚至为其后来都转移到另自由文化条件。老鼠馈线细胞和动物血清的另一个问题/蛋白质是他们也包含非人类唾液酸(Neu5GC),也可能带来严重的污染问题为(29日]。例如,据报道,动物唾液酸代谢为其进入细胞表面和受污染的胚胎干细胞(29日]。

2.2。另加料器为细胞生长

为了避免动物性产品和跨物种污染,研究人员已经开发出文化媒体不含动物成分,同时支持胚胎干细胞的生长和扩张。据报道,人类细胞可用于hESC文化;例如,人类输卵管细胞(30.),胎儿包皮(31日),胎儿肌肉和皮肤(32),转基因胎肝基质细胞(33),骨髓(34),脐带(35),胎盘细胞(36,37),子宫内膜细胞(36,38,39)已报告支持干细胞文化和扩张。在这些人类细胞中,人类脐基质细胞提供了更好的馈线来源细胞也可以收集使用非侵入性的方法,而使用包皮,胎儿,或骨骨髓来源支线层提出了一些道德问题。

除了支线细胞,人类细胞系还提供一个替代鼠标馈线细胞。最近,几个hESC行派生和传播使用商用人包皮成纤维细胞行(40,41]。子宫内膜细胞也被证明是有效的在体外文化的干细胞(38,39,42]。消除动物病原体污染的风险的另一种方法是使用支线层来源于人类干细胞线(43,44]。碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)是显示从内部产生的人类馈线细胞用于hESC文化([33,45];刘et al ., 2014)。这些支线细胞也分泌TGFβ、苯丙酸诺龙一个参与维护ICM的多能性(46,47]。尽管有各种好处,馈线cell-dependent hESC文化有许多的局限性;例如,维护支线层是费力太多支线细胞群之间的差异。这种差异可以影响hESC人类应用要求。

2.3。Feeder-Free文化为其生长

动物和人类馈线细胞都有局限性,研究人员探索和成功地设计化学文化媒体文化为其定义,定义媒体最棒的地方是,它们不包含任何支线细胞。feeder-free增长的第一个方法尝试媒体使用的细胞外基质蛋白和生长因子来创建一个在体外干细胞增殖和文化条件更新(图2)。在这些蛋白质中,基底膜基质(48)主要是与生长因子或结合使用条件培养基培养为(48,49]。尽管各种好处,基底膜基质发现有太多的变化其成分构成hESC文化问题。人工基底膜的使用也提出了临床问题很少有批人工基底膜污染的报道称老鼠单链RNA virus-lactate脱氢酶提高病毒(50]。除了人工基底膜,纤连蛋白、层粘连蛋白和胶原IV型也适合使用xeno-free hESC文化,和细胞可以长到20通道(51,52]。文献[53)报道,人类placenta-derived ICM被用来为其文化,他们发现强烈的遗传稳定性40通道。此外,为其也生长在xeno-free文化传媒80通道(40,41]。

毫无疑问,使用化学定义媒体以及蛋白质显著提高了为其文化。此外,不同的蛋白质和重组蛋白也用于提高hESC文化xeno-free条件下。其中钙,钙粘蛋白/层粘连蛋白521,和激酶抑制剂bFGF已知导致健壮的干细胞增殖xeno-free条件下(54]。综合设计的床面也被用来刺激干细胞文化(Melkoumian et al ., 2010);例如,康宁Synthemax表面,合成丙烯酸酯表面共轭vitronectin,展示了提高干细胞不仅hESC殖民地扩张(森et al ., 2014)。吴等人最近描述了新型合成材料的使用与蜘蛛丝蛋白作为一个合适的衬底来刺激hESC文化(吴et al ., 2014)。许多聚合物合成表面也报告以支持增长和扩张hESC行(Melkoumian et al ., 2010;Brafman et al ., 2010;Villa-Diazet。, 2013)。不同的化学物质的列表用于提高文化为其表所示2。

3所示。Multilineage的潜力为

为的最大特点之一是分化成三个血统外胚层、中胚层和内胚层(图3)。为多能干细胞,他们有独特的功能分化成各种体细胞;例如,为其可分化为神经元,心脏细胞,肝细胞,肌肉细胞。据报道,为第一个形式拟胚体基本结构有三个胚芽层。这些拟胚体是由多能为生长在三维(3 d)文化和对所有三个胚芽层表示遗传标记(55- - - - - -57]。多能为其有巨大的区别(表的能力3)成肾上腺细胞和角化细胞58),胰岛素生产细胞(59),神经细胞(60,61年),心肌细胞(62年),肝细胞(63年],胰岛瀑样(64年]。某些生长因子如视黄酸和神经生长因子被用于诱导为其分化成神经元功能。此外,一些lineage-specific生长因子被用于分化成心肌细胞,肝细胞,骨骼肌,胰腺细胞和肾细胞。这些分化细胞也正在测试用于检查它们的功能在体外和在活的有机体内条件。这multilineage潜在的为已被证明是至关重要的细胞疗法治疗不同的退化性疾病。虽然很容易区分为不同类型的细胞,很难得到大量的分化成熟的细胞治疗应用程序(65年]。获得大型、成熟和功能分化细胞,文化媒体应该包含lineage-specific生长因子。同样重要的是产生大量的细胞为其所需细胞移植,这可以通过培养为其分化和细胞生物反应器控制条件(66年]。

4所示。为测试使用在体外和在活的有机体内模型

成功后为其分化为不同的细胞类型,下一个逻辑步骤是检查是否派生分化细胞有一些功能。干细胞和分化的功能前体或成熟细胞被广泛研究在体外和在活的有机体内条件。分化神经元的功能,心肌细胞,肝细胞,和其他类型的细胞进行了测试在各种动物模型(67年]。发现的神经元移植引起的帕金森病动物模型的部分恢复功能(68年,69年]。为及其分化细胞的移植动物模型的测试心血管疾病、中风、糖尿病、脊髓损伤(67年]。在动物中,小型啮齿动物,如老鼠和老鼠一直在研究细胞移植的一种选择。此外,小型啮齿动物是轻松地访问和可以轻易操纵手术和基因。尽管各种好处的小型啮齿动物,老鼠的能力/老鼠实验来预测干细胞疗法的疗效仍存在争议(70年)尽可能多的鼠标/鼠模型并不代表人类疾病表型。为了克服这个问题,研究人员开始研究的大型动物接近人体解剖学和生理学。在大型动物,狗、山羊、绵羊、和非人灵长类动物模型被认为是比老鼠/老鼠的干细胞测试(70年]。使用大型动物的主要优点之一是他们的长寿命,和许多解剖、生理参数更接近人类[70年]。虽然这些动物模型证明干细胞在宿主组织的有效交付,完整的功能和行为复苏仍未实现。进一步的研究需要开发接近人类疾病的动物模型。

尽管hESC研究进展,hESC-based细胞疗法的一个重要的挑战是hESC-derived细胞的同种异体免疫排斥接受者(71年]。在一周内发现,移植的干细胞死于强烈的宿主免疫反应中生成的动物。停止移植干细胞的死亡,动物被注射免疫抑制抑制引发的免疫干细胞移植。令人惊讶的是,当动物被给予免疫抑制或药物如他克莫司和西罗莫司,28天为只能生存,开始死亡之后(72年]。虽然我们不知道原因,缺乏理解和信息交互的可能的原因之一。是很重要的测试为或分化细胞在体外动物试验前状态。在体外模型提供了更好的机会学习和信息交互,细胞迁移,或单元集成与一个伟大的详细的方式,这也许很难研究动物。可以减轻这个问题最近一次突破的技术诱导多能干细胞(万能)核重编程的患者体细胞与定义的因素,这可能成为一个可再生细胞疗法的自体的细胞来源。对人类的细胞则细胞疗法的一个主要优势是,特定的细胞则是自体,和,因此,假定细胞来源于它们可以移植到同一个病人没有免疫排斥反应[担忧71年]。然而,最近的研究揭示了异常表观遗传学,基因组稳定性和免疫原性的细胞则提高了安全担忧iPSC-based疗法(73年,74年]。

5。为其治疗的应用

为其持有很多承诺的患者患有退化性疾病,已经进行了各种尝试探索人类的治疗潜力。干细胞治疗的主要目的是恢复或修复丢失或损坏的身体细胞或组织。为适合临床应用,必须制造衍生干细胞按美国食品药物管理局(USFDA),目前的良好生产规范(cGMP)干细胞临床移植指南,分别为(75年]。化学品、试剂、细胞和干细胞文化中使用的机器和设备应该进行安全卫生检查,和所有的生产过程必须监控和记录按照cGMP的指导方针。如果我们分析当前使用的多少hESC行符合cGMP指南,你会发现许多hESC行不符合cGMP的指南,因为许多为暴露于免疫原性或致病性动物组件在隔离和传播阶段。不符合cGMP指南的另一个原因是,大多数hESC文化作品在大学的实验室进行的,在许多这样的研究实验室不符合cGMP的指导方针。直到今天,只有少数研究人员能够产生hESC行按照cGMP指南(14,76年,77年]。

考虑为其的潜在商业利益,一些生物技术公司也参与资助干细胞研究的干细胞商业化产品的唯一目标。这些公司已经开始生产为其在cGMP的条件下,开始检测干细胞在临床设置。2009年,Geron公司(加州生物科技公司)应用于食品及药物管理局开始使用细胞来源于为首次临床试验。临床试验是2010年10月开始,3患有脊髓损伤患者注射150万少突细胞前体细胞来源于为(78年]。审判意外停止时,我们不知道原因,可能是因为的初步试验结果表明,细胞为其没有导致任何明显改善脊髓损伤。此外,FDA还批准了另一项试验的使用为黄斑变性疾病(79年- - - - - -85年]。另一个公司,先进细胞技术公司位于马尔伯勒,马萨诸塞州,开始使用为其临床试验。细胞被注射的患者患黄斑变性的肌肉萎缩症和年龄相关性黄斑变性干燥。视网膜色素上皮(RPE)细胞为其使用(83年]。在这项研究中,RPE细胞接种的病人,和posttransplantation 4个月后,发现病人显示轻微改善视觉功能,没有任何迹象表明免疫排斥反应或形成畸胎瘤的迹象83年]。干细胞也测试了I型糖尿病患者,在胰腺癌的患者服用前体细胞(86年]。

6。摘要和结论

人类胚胎干细胞的治疗潜力的治疗各种疾病,如癌症、帕金森病、阿尔茨海默氏症和糖尿病。在体外和体内研究表明,仍有希望,未来的胚胎干细胞将提供治疗各种疾病。但干细胞疗法的成功取决于细胞成熟和功能的可用性。获得成熟和功能的细胞,它会更好,如果干细胞是在三维(3 d)培养条件。大多数hESC线是通过二维(2 d)培养条件。有一些使用2 d文化的局限性,为这已经在2 d条件并不代表人类细胞的人体和大部分的二维培养为死细胞移植后立即报告;这些细胞存活仍无法修复身体组织。可以处理这个问题,通过培养为其在三维条件下,细胞可以生长在三个方向和细胞移植后细胞存活的几率将提高。另一个需要考虑的重要的一点成功的干细胞疗法是严格评价干细胞细胞在动物模型在人类身上测试。的信息集成、信息交流、细胞迁移、细胞功能需要评估彻底在动物模型中使用短期和长期试验方法。 The issue related to trauma formation and immunorejection must also be resolved by developing stem cell lines which do not cause immunorejection and do not form tumor after transplantation. This can be achieved by silencing the gene/molecular pathways which trigger tumor formation and immunorejection, respectively. Moreover, the cell-based therapy also demands many mature cells, and efforts should also be directed towards isolation of large quantity of stem cells and their precursors by bringing a new innovative approach and methodology. Finally, human embryonic stem cells still hold a great promise for the treatment of various degenerative diseases as well as diagnostic applications.

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

这手稿是所有作者提交批准。

确认

作者感谢整个管理研究所的研究和医疗咨询(IMRC),伊玛目阿卜杜·本·费萨尔大学,达曼,沙特阿拉伯王国,他们的支持和鼓励。

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