纤维蛋白胶增强脂肪基质细胞细胞因子分泌和生存赋予加速糖尿病伤口愈合

文摘

介绍。虽然慢性伤口是一个主要的个人和经济负担,治疗方案仍然是有限的。这些选项中,脂肪基质细胞(ASC)基础治疗是一种很有前途的方法,但是伤口受到严酷的环境。这里我们使用一个商用纤维蛋白胶对asc提供交付利基在慢性伤口。材料和方法。调查在体外纤维蛋白胶的影响,培养实验和再生的关键细胞因子进行量化。通过建立小鼠慢性糖尿病患者愈合模型中,我们评估了纤维蛋白胶喷播对细胞生存的影响(体内成像系统,新),伤口愈合伤口关闭(动力学),和愈合伤口(CD31免疫组化)的新血管形成。结果。纤维蛋白胶播种导致显著增强的关键细胞因子的分泌(SDF-1、bFGF和MMP-2)对asc的人类在体外。新成像显示显著延长小鼠ASC生存在糖尿病伤口和显著加速完成伤口关闭在纤维蛋白胶播种。CD31免疫组织化学显示更多新血管形成在愈合伤口处理对ASC喷雾播种在纤维蛋白胶对ASC注入伤口床。结论。尽管一些车辆显示成功作为细胞载体系统在临床前试验,监管问题已经禁止慢性伤口的临床使用情况。通过展示能力的纤维蛋白胶对asc作为载体的工具,同时提高细胞再生功能和可行性,本研究支持临床翻译ASC-based疗法。

1。介绍

慢性伤口是一个主要的医疗问题,大大影响了个人的生活质量和社会上放置一个巨大的经济负担,影响了650万人,每年花费超过250亿美元在美国独自一人(1]。这是得益于日益老龄化和定向研究对有效预防和有效的治疗慢性伤口的1]。尽管1126年临床试验进行了有利于伤口愈合2),最终突破仍然遥遥无期。

在过去的几年里,干细胞疗法已成为一种很有前途的方法来解决无法愈合伤口(3]。骨骨髓来源干细胞(bmsc),脂肪干细胞(对asc)和诱导多能干细胞(万能)已经成功地用于提高伤口愈合(4- - - - - -6]。其中,对asc代表最通用的组织再生的细胞来源,由于易于收获通过抽脂和相对较低的道德和加工的局限性。对asc加速伤口关闭通过分泌proangiogenic和趋化因子,从而影响细胞的伤口环境和循环(3,7- - - - - -10]。此外,由于他们多能——对asc有能力分化成广泛的细胞排列和潜在的增强伤口关闭通过这种机制(9,11]。然而,对asc的使用仍然受到几个因素的限制。老龄化和糖尿病已被证明ASC函数将大幅下降,尤其是他们的愈合能力3,12,13]。由于慢性伤口通常发生在老年患者和相关并发症如糖尿病,干细胞疗法的疗效在病人群体,他们最需要的是大大减少。因此,它是至关重要的优化对asc的交付,从而提高细胞存活率和细胞因子分泌的关键。

慢性伤口是一个严酷的环境和细胞毒性,主要表现为炎症和血液供应(14]。改善环境与治疗车代表延长移植细胞生存能力的一种方式。水凝胶等载体和运载工具可能最初提供细胞利基,促进ASC生存。尽管许多像壳聚糖水凝胶、琼脂糖、海藻酸凝胶,或胶原蛋白用于临床前和临床研究,没有在临床实践中经常使用(15- - - - - -19]。纤维蛋白,在临床实践中常用的止血和胶粘剂性能(20.,21)最近调查作为细胞载体。Mogford等人成功应用纤维蛋白、血小板源生长因子、成纤维细胞增强伤口关闭(22]。Zimmerlin等人显示在体外间质血管分数(SVF)由内皮细胞、成纤维细胞、免疫细胞对asc,能成功地交付使用纤维蛋白胶(23]。为了更好地理解对ASC功能纤维蛋白胶的影响,我们使用了商用Tisseel纤维蛋白胶作为对ASC的运载工具和评估其影响细胞因子ASC和糖尿病伤口愈合的功效。

2。材料和方法

2.1。扩张的细胞

从三个不同的健康的捐赠者对asc买来Lonza集团(瑞士巴塞尔)。标准的细胞培养条件下对asc扩大StemMACS扩张中(Miltenyi研究,Bergisch格拉德巴赫,德国)。

2.2。试验装置

对asc实验播种,是汇集和计算与卡西TT计数器(泛光灯生命科学、不来梅、德国)。三个不同的条件进行了一式三份。标准细胞培养条件 对asc在8毫升resuspended StemMACS扩张中,播种在10厘米菜肴。

在纤维蛋白胶进行细胞培养Tisseel(美国伊利诺斯州的巴克斯特)。这两个组件,纤维蛋白凝血酶,prediluted 1: 4 StemMACS扩张中。 对asc在4毫升resuspended prediluted凝血酶、转让10厘米的菜,然后混合4毫升prediluted纤维蛋白。

作为额外的控制,纤维蛋白胶没有细胞(准备相同如上所述)包括在试验装置。细胞播种后,所有菜都满24 ml StemMACS扩张中,标准的细胞培养条件下培养1周。一个星期后,上层清液吸气和读离心获得的材料进行分析。浮在表面的游离在−整除和存储80°C。

2.3。蛋白质分析

研究蛋白质的表达基质细胞衍生因子1 (SDF-1),碱性纤维母细胞生长因子(bFGF / FGF2)和矩阵metalloproteinase-2 (MMP-2) elisa (DuoSet,研发系统,明尼苏达州,美国)根据制造商的说明进行。

2.4。愈合模型

所有的动物实验都按照制度进行动物的指导方针。

所有老鼠都从查尔斯河实验室订购,妈,美国威尔明顿(http://www.criver.com)。Db / Db老鼠和荧光素酶阳性小鼠被随机分配到三个不同的组。第一组接受治疗与纤维蛋白胶对asc播种,第二组接受注射PBS也和组三个仅接受纤维蛋白胶。

每个鼠标,背部的两个全层切除伤口直径6毫米创建并通过硅胶环固定住。硅胶环稳定的预防与6 - 0尼龙缝线缝合伤口收缩。

治疗后,伤口床满是一个闭塞的酱(Tegaderm;3 m,圣保罗、锰、http://www.3m.com)。文档上执行天0、4、8、12、16、18、20通过数码摄影。伤口面积是通过使用ImageJ软件(NIH)来衡量的。

2.5。在活的有机体内成像系统(新)

生物荧光成像(BLI)被用来评估可行性和位置对asc的移植体内。新是由最初的鼠标异氟烷麻醉2.5%,其次是200μl D-luciferin腹腔注射。使用一个新光谱系统(卡尺生命科学,数据MA),老鼠不断由1.5%异氟烷麻醉,和图像在60秒曝光,直到获得信号达到峰值。光辉量化在光子每秒每平方厘米每球面度[24]。对asc生存评估天0、3、5、7、9。

2.6。评估伤口血管的

多血管愈合伤口( 伤口)被评估为CD31免疫组织化学染色(内皮细胞标记)。伤口是收获后立即关闭和加工石蜡切片的厚度7μm。deparaffinization之后,幻灯片和PBS洗然后封锁在一个湿室2小时。主要抗体在1:100稀释(RbαCD31、Ab28364 Abcam,剑桥,英国,http://www.abcam.com)。幻灯片主要抗体孵育过夜在4°C。二次抗体和孵化申请4小时在室温下(AF547山羊α兔子,生活技术,大岛,纽约,http://www.lifetechnologies.com)。此外,核与DAPI染色(46-Diamin-2-Phenylindol)。

为量化ImageJ使用自动阈值。binarizing荧光信号的每个像素,我们确定了“pixel-positive区域”,然后评估每个幻灯片的总荧光信号。

2.7。统计分析

组间比较,我们学生的使用T以及。由于这样的事实,我们多个组相比,修正结果与Bonferroni方法。所有数据显示为平均值±标准平均误差(SEM)。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。纤维蛋白调节ASC细胞因子分泌

proregenerative细胞因子的数量与纤维蛋白胶对asc播种是明显高于对asc组播种在媒体单独或纤维蛋白(图1)。bFGF的分泌( )和SDF-1 ( )在纤维蛋白/ ASC组显著增加。MMP-2,矩阵metalloproteinase-2,显示水平显著降低纤维蛋白/ ASC组( )。

3.2。纤维蛋白胶显著延长在活的有机体内ASC生存

当比较对ASC luciferase-induced喷洒的纤维蛋白胶到小鼠创面,那些注射了PBS,我们发现天0水平显著增强的ASC, 3, 5, 7, 9 ( )。在PBS对照组,没有荧光信号能被探测到从9天。相反,对asc纤维蛋白组显示过去一天九(图生存2)。

3.3。对asc Fibrin-Delivered显著提高伤口愈合

纤维蛋白胶对asc +显著加速愈合时间与对照组相比,小鼠模型。纤维蛋白/ ASC组伤口愈合的意思是16天相比,平均18天的ASC注射组( )只和一个20天的意思是纤维蛋白组(图3)( )。

3.4。对asc Fibrin-Delivered增强新血管形成对asc注射相比

当比较的总荧光immunohistological照片(大功率的视野=高通滤波器,图4),我们发现了一个显著的增强纤维蛋白/ CD31表达的ASC组相比ASC注射组。伤口注射对ASC在PBS总荧光纤维蛋白的4.27%,而伤口/ ASC组显示,7.41%荧光( )。

4所示。讨论

虽然对asc代表一个有前途的愈合疗法,临床使用仍然有限,由于疗效的差异。在先前的一些研究中,所述的微小差异收获和加工对分化有很大影响,生存能力,对asc和细胞因子的分泌7,25- - - - - -27]。此外,针对病人的临床成功的不可预测的因素。除了伤口床上的差异和病人之间的愈合能力,ASC功能和可行性也由年龄、性别、和并发症如糖尿病3,9,12,13,28- - - - - -32]。尽管解决这些并发症是理想的解决方案,提高这些细胞驻留的利基是另一种典雅的策略。

尽管优秀的结果都在体外和在活的有机体内迄今为止,ASC交付使用的各种方法和车辆没有被翻译到临床实践8,16,18]。在很大程度上,这可能是由于这样的事实,大部分的车辆已经专门为载体研究提出并不是免费的诊所。为了克服这个问题,我们利用对asc交付产品,已经在广泛的临床使用。因此,与车辆有关的监管问题可以很容易地避免。尽管其能力作为细胞载体很少被描述,其临床安全广泛已经证明,在大多数医院是现成的。此外,纤维蛋白胶通常是用来改善皮肤移植术依从性,特别是在大型燃烧的设置,可以提高这些患者的结果。

当考虑与现有研究表明其临床好处(33),我们机械的研究表明显著增强ASC愈合能力提供纤维蛋白胶的利基。纤维蛋白胶显著增强的分泌SDF-1 bFGF,再生细胞因子,促进伤口愈合通过改善循环细胞的招募,支持纤维母细胞功能和促进新血管形成(34- - - - - -36]。

MMP-2是缺氧反应细胞因子矩阵退化(负责37]。虽然有些评论MMP-2描述角化细胞迁移的刺激,其他小鼠以及人体试验显示重要的有益影响选择性MMP-2抑制伤口关闭时间(38,39]。此外,高MMP-2水平在人类伤口液已被证明与发生无法愈合的伤口有关(40]。对asc在纤维蛋白胶有潜力提高伤口愈合的重要upregulation proregenerative细胞因子和伤口愈合的关键差别同时对这些抑制剂。纤维蛋白胶从而代表一个脚手架一样运载工具,可以抵消环境严酷的伤口。此外,连同之前的研究,我们强烈同意,直接注入的细胞组织或局部应用程序可以显著减少细胞功能通过机械力或有限的细胞粘附[23]。

推动临床翻译,我们证实了这些发现在一个成熟的小鼠糖尿病伤口模型(7,8,12,13,25,26,41- - - - - -43)结合一个新系统,对asc luciferase-marked允许我们来跟踪在活的有机体内随着时间的推移细胞生存能力。在严酷的伤口环境减少血液和营养供应迅速枯竭对ASC注入,纤维蛋白利基长期ASC生存。此外,提高细胞因子对asc,纤维蛋白胶的利益维护这些伤口环境中增强对asc在较长一段时间。总的来说,这些改进的新血管形成和影响加速伤口关闭。

5。结论

尽管对asc代表最有前途的方法在再生医学,其临床应用仍受到不确定性。纤维蛋白胶的结合对asc和代表一个可靠、安全,和简单的方法来提高干细胞功能,生存能力,体内伤口关闭时间。它也暗示了其他临床经常使用纤维蛋白胶,如大的烧伤。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

信息披露

作者没有任何财务或个人兴趣,本文中提到的产品。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

乌苏拉效果和马提亚·m·Aitzetmueller贡献同样这项工作。

确认

这项工作是支持的德国研究基金会(DFG)和慕尼黑工业大学(TUM)框架的开放获取出版计划。还没有收到任何额外的资金。

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