炎症刺激显著改变人类脂肪中提取干细胞的microrna的概要文件

文摘

背景。人类脂肪干细胞(hASCs)已被证明具有免疫调节特性在很多研究中得到验证。然而,机制仍然未知。microrna与许多细胞过程,包括免疫反应。因此,我们假设microrna充当immunoregulators当hASCs刺激炎症环境。方法。一系列的细胞因子被用来刺激细胞因子组hASCs,虽然没有细胞因子被用来刺激细胞在正常组。微阵列是用于获得hASCs的microrna的表达谱,和rt - pcr用于验证的microrna两组之间的差异表达。靶基因预测使用在线数据库和KEGG分析来识别路径目标基因的差异表达丰富的microrna。结果。五个microrna明显调节,2 microrna表达下调细胞因子组与正常组相比。我们确定了几个相关的几种途径,有针对性的单独或集体的microrna。结论。炎症刺激改变hASCs的microrna的表达谱。microrna可能发挥关键作用在hASCs免疫反应和可能的目标,通过它可以增强hASCs的免疫调节功能。

1。介绍

间充质干细胞(msc)最初发现在小鼠骨髓,但已经被证明存在于几乎所有的组织。除了拥有著名的自我更新和多功能分化能力,mcs还具有免疫调节特性的临床价值。这些属性负责越来越多的临床试验中,同种异体的msc被用于治疗疾病。

人类脂肪干细胞(hASCs),脂肪组织中的干细胞,最近被证明是最有前途的MSC类型之一。容易和安全地获得脂肪组织产生更多的干细胞比骨髓也没有引起病人不适。除了应用于再生医学、hASCs也被用于治疗自身免疫性疾病和移植物抗宿主病(GVHD)的基础上,他们表现出体内免疫调节效应。在III期随机对照研究中,Cx601细胞,这是扩大外源的hASCs,被证明是有效和安全的治疗复杂肛周的管状器官在克罗恩病(1]。然而,对asc的机制发挥其治疗效果仍然未知。

小分子核糖核酸(microrna)是内源性非编码rna(~ 23元)发挥重要作用在目标基因的转录后的镇压结合互补序列(2]。它们参与各种各样的细胞过程,如开发、增殖和凋亡。数以百计的表达分析研究已经阐明,肿瘤表现出与正常组织不同的microrna的表达模式,一些microrna在肿瘤发生[有着巨大的影响3- - - - - -5]。此外,证明了microrna与炎性疾病(6),需要正常的免疫功能(7]。

在这项研究中,我们假设hASCs在炎症性疾病中的作用可能受到microrna的表达模式。阐明hASCs受到炎症刺激的microrna的表达谱可以帮助识别特定的microrna在炎症条件下差异表达,从而促进hASC的增强免疫调节功能。我们进行了微阵列研究和发现7 microrna hASCs,包括刺激和未刺激之间的差异表达。增加或减少在这些microrna的表达可能参与的机制hASCs调节免疫反应,可用于改善hASC功能。

2。方法

2.1。道德声明

本研究符合赫尔辛基宣言,并执行批准的北京大学第一医院的机构审查委员会。人体皮下脂肪组织的择期手术的病人获得了书面同意关于这项研究的使用他们的组织。

2.2。代hASCs

中描述的脂肪组织样本处理一项研究[8]。简单,组织洗3次无菌磷酸盐(PBS),主要是为了去除红细胞,然后剁碎成1毫米³用剪刀。同等体积的0.1%胶原酶类型我是用来消化组织块在水平摇晃1 h在37°C。获得的细胞球随后在1300转离心3分钟和resuspended与10%胎牛血清的DMEM补充,之后,他们透过100μm过滤器。hASCs被播种在10厘米培养皿和孵化在湿润的气氛中在37°C公司为5%₂。细胞通过3被用于实验。

2.3。流式细胞术

hASCs从通道3收获0.25%胰蛋白酶/ EDTA和流式细胞术洗缓冲区(的边后卫巴萨,1×PBS, 1%)。细胞能整除(1×10⁵细胞)沾异硫氰酸荧光素(FITC)共轭主CD31抗体,CD44、CD45、CD73, CD90、CD105(美国BioLegend,圣地亚哥,CA)在冰上30分钟。FITC-conjugated鼠标IgG1是用作控制同形像。流式细胞仪进行使用细胞分选仪(美国BD,圣何塞,CA),和数据分析使用FlowJo软件(美国FlowJo LLC、亚什兰或)。

2.4。脂肪形成的分化和油红O染色

脂肪生成被培养诱导hASCs脂肪形成的媒介(AM) 2周。我的作文被描述之前,包括以下(9]:DMEM补充10%的边后卫,1μ10 M地塞米松,μ胰岛素,200μM吲哚美辛,0.5毫米isobutyl-methylxanthine (IBMX)。差异化是利用油红O染色证实。简而言之,这些细胞被固定在4%多聚甲醛在室温下1 h和70%乙醇洗,之后他们孵化油红O试剂在室温下3 - 5分钟。几个与蒸馏水洗涤后,细胞与苏木精复染色。

2.5。成骨分化和冯Kossa染色

我们使用商用成骨分化工具包(Gibco)由制造商诱导hASC成骨。在分化培养基孵化后3周,细胞被固定在4%多聚甲醛在室温下1 h和蒸馏水洗至少3次。细胞被染色1毫升的冯Kossa试剂(Leagene,北京)紫外线照射下10分钟。

2.6。在炎症条件下hASC刺激

hASCs要么在正常培养基培养或炎症条件下进行分析。模拟炎症环境中,我们对待下面的细胞因子的细胞的组合,如前所述[10]:il - 1β(25 ng / ml), TNF -α(50 ng / ml),干扰素-α(10 ng / ml)和干扰素-γ(50 ng / ml)(所有从PeproTech落基山,新泽西,美国)。简而言之,这些细胞被处理上述细胞因子在一夜之间,然后收集microrna的提取。

2.7。RNA提取

总RNA提取使用mirVana™RNA隔离设备(应用生物系统公司,AM1556),根据制造商的指示。RNA浓度被NanoDrop量化ND2000(热科学、马、美国),和RNA完整性被琼脂糖凝胶电泳进行评估。

2.8。microrna的数组

Affymetrix microrna的4.0 (Affymetrix公司,圣克拉拉,CA,美国)被用在这个实验。RNA样品标签、微阵列杂交和清洗进行根据制造商的标准协议。简单地说,一个多聚腺苷酸尾添加到总RNA, RNA是biotin-labeled和杂化后到芯片上。洗,染色后,数组是由一个Affymetrix扫描仪扫描3000 (Affymetrix 7 g)。

2.9。验证的microrna的表达

我们使用一个茎环结构rt - pcr方法,量化各种种microrna的表达水平。逆转录酶反应混合物含RT / RI酶混合,ES反应混合,gDNA剂(都来自转基因,AE301,北京),茎环结构RT RNA样本,引物被用于这些实验。30分钟的反应是孵化16°C,在42°C, 30分钟和5分钟在85°C,然后在4°C。实时PCR进行使用记录®绿色microrna的两步qPCR SuperMix工具包(转基因,AQ202,北京)应用生物系统公司7500实时PCR系统。10μl聚合酶链反应混合物包括1μl (RT产品,5μl记录提示绿色qPCR SuperMix, 0.2μ0.2 l的底漆,μl(反向引物。混合物被孵化在94°C的96孔板30年代,之后他们的反应了40 94°C的周期5 s和60°C 34 s。所有的反应都是一式三份。Ct(阈值周期)被定义为周期数的荧光通过阈值。U6作为内部控制。ΔΔCt方法,前面描述的(11),是用来计算的相对表达水平microrna。

2.10。统计和生物信息学分析

命令控制台软件(版本4.0,Affymetrix,圣克拉拉,CA,美国)被用来分析阵列图像获取必要的原始数据,然后表达控制台软件(版本1.4.1,Affymetrix,圣克拉拉、钙、美国)被用来执行RNA正常化。定义每个变体的表达谱,我们进行单向方差分析与转录组分析控制台软件(版本3.1,Affymetrix,圣克拉拉,CA,美国)。microrna与和一个| log2(褶皱变化)| > 1确定为显著差异表达microrna。层次聚类进行显示这些microrna的表达模式的差异样本。

目标基因的差异表达microrna预测使用以下5数据库:米兰达,miRDB, miRTarBase TargetScan, miRecords。为了确保我们的预测的准确性,我们选择基因参加至少两个数据库目标基因并对其进行了进一步分析。

最后,KEGG分析来确定目标的途径所涉及的这些差异表达microrna基因。此外,个人的目标免疫function-related通路使用DIANA-miRPath v3.0 microrna预测。

3所示。结果

3.1。hASC表征

细胞通过3在我们的研究中使用。hASCs纺锤状,被附着到培养皿,倒置显微镜(图做了演示1(一))。的细胞能够分化成脂肪形成的和媒体在特定诱导成骨的血统。冯Kossa染色显示,细胞在骨中孵化3周展出钙沉积,这一现象可能反映了hASC骨(图1 (b)),油红O染色证实,细胞培养2周显示脂滴,表明细胞获得了脂肪形成的属性(图1 (c))。此外,流式细胞术显示,这些细胞是积极的(> 90%)为基质标记,如CD44、CD73, CD90、CD105,负(< 2%)对造血标记,如CD31和CD45(图2)。这些结果符合国际联合会脂肪疗法(IFATS)声明hASC表型(12]。

(一)

(b)

(c)

图1

hASCs分化。(一)hASCs (p3)一个倒置显微镜下观察而悬浮在正常的完全培养基,发现纺锤状。(b)在骨中孵化后3周,细胞受到冯Kossa染色,显示钙沉积的存在(黑色)。(c)油红O染色证实,脂滴(橙色)后形成的脂肪形成的分化培养基的细胞培养2周。比例尺= 100μm . hASCs:人类脂肪干细胞。

3.2。炎症的影响环境在hASCs microrna的表达谱

之间差异表达,以确定哪些microrna hASCs刺激炎症环境和正常细胞,我们microrna的数组进行分析。hASCs从3独立捐助者在正常培养基培养(正常组)或介质与一系列细胞因子(细胞因子组)。RNA然后在每组从细胞中提取,用于比较分析。微阵列分析显示,microrna的表达水平差别明显正常和细胞因子组。共有6631个microrna发现hASCs的两组。microrna的人中,15个不同的表达两组之间用| log2(褶皱变化)| > 1 。5 (mir - 155 - 5 - p, 665年,19 b-3p b-5p 146和543年)的15个microrna是调节,和其他10个microrna (mir - 4530, 4430, 4271, 3177 - 3 - p 4732 - 5 - p 6886 - 5 - p 4640 - 5 - p 6847 - 5 - p, 601年和4497年)在细胞因子表达下调组与正常组。更多细节关于这些microrna如表所示1。15个不同的microrna表达也说明一个热图(图3)。


microrna的	褶皱变化(细胞因子与正常组)	价值

hsa - mir - 665	4.64	0.01
hsa - mir - 146 b - 5 - p	4.13	0.04
hsa - mir - 155 - 5 - p	4.00	< 0.01
hsa-miR-19b-3p	2.10	0.01
hsa - mir - 543	2.02	0.01
hsa - mir - 4430	0.49	0.03
hsa - mir - 4530	0.47	0.01
hsa - mir - 6847 - 5 - p	0.44	0.02
hsa - mir - 4497	0.42	0.02
hsa - mir - 4732 - 5 - p	0.40	0.02
hsa - mir - 4640 - 5 - p	0.34	0.02
hsa - mir - 6886 - 5 - p	0.33	0.02
hsa - mir - 3177 - 3 - p	0.32	< 0.01
hsa - mir - 601	0.27	0.02
hsa - mir - 4271	0.18	< 0.01

15个microrna与确定的微阵列和一个| log2(褶皱变化)| > 1的两组。

3.3。microrna的表达验证

然后我们使用rt - pcr验证的15种microrna的表达水平之间的差异表达的正常和细胞因子组。而不是添加一个microrna通过逆转录多聚腺苷酸尾,我们使用一个茎环结构RT提高特异性引物。PCR结果证实,7的15 microrna是两组之间的差异表达(| log2(褶皱变化)| > 1和 )。有趣的是,调节microrna上面提到的所有5被PCR验证成功,而只有2 (mir - 4430和4497年)的10个表达下调microrna上面提到的成功(图进行验证4)。

3.4。预测microrna的目标基因和通路

microrna表达的7个不同的靶基因预测使用5在线数据库。总共有16872个基因从这些数据库中获得。28从miRecords获得目标基因,3402从miRTarBase获得目标基因,2647从TargetScan获得目标基因,14465从米兰达获得目标基因和3402从miRDB获得目标基因(图5)。然后,我们排除了13606个基因预测的只有一个数据库;因此,3266个基因包括在后续分析。

许多相关通路被KEGG分析确定。20个最重要的途径是bar-plot图(图中显示6)。这一分析给我们概述的所有目标基因通路microrna的影响。然后,我们使用一个microrna的途径分析web服务器(DIANA-miRPath v3.0)来识别个人microrna的通路控制的目标基因。炎症相关的通路的目标7差异表达microrna在表中做了总结2。没有途径发现mir - 4430的目标,-4497年或-665年。


microrna的	ID	描述	价值	基因数

hsa - mir - 543	hsa04350	及信号通路	0.0004	17
hsa - mir - 543	hsa04068	FoxO信号通路	0.0024	26
hsa - mir - 543	hsa04917	催乳激素信号通路	0.0464	14
hsa - mir - 155 - 5 - p	hsa04068	FoxO信号通路	0.0003	26
hsa - mir - 155 - 5 - p	hsa04350	及信号通路	0.0003	11
hsa - mir - 155 - 5 - p	hsa04064	nf -κB信号通路	0.0026	16
hsa - mir - 146 b - 5 - p	hsa04064	nf -κB信号通路	0.0298	7
hsa - mir - 146 b - 5 - p	hsa04620	toll样受体信号通路	0.0298	10
hsa - mir - 146 b - 5 - p	hsa04668	肿瘤坏死因子信号通路	0.0480	10
hsa-miR-19b-3p	hsa04917	催乳激素信号通路	0.0002	18
hsa-miR-19b-3p	hsa04068	FoxO信号通路	0.0002	30.
hsa-miR-19b-3p	hsa04350	及信号通路	0.0417	12

4所示。讨论

卡普兰在1991年提出的msc的存在(13),被认定为“成纤维细胞克隆形成单位”在1960年代初。msc启发科学家的“具备干细胞应用领域的这些细胞组织再生,并增加临床研究提供的证据表明,在组织修复msc是有效的。理解msc的机制发挥他们的治疗效果会指导他们在临床治疗中的应用。msc在传统上被认为发挥他们的细胞替代治疗效果。然而,许多研究表明,成功的MSC治疗不伴有细胞移植来说,这表明其他机制可能参与MSC的影响(14- - - - - -16]。2004年,移植物抗宿主病是成功治疗一个9岁的孩子使用MSC-based疗法(17]。从那时起,许多临床研究使用MSC治疗(1,18- - - - - -20.)导致改善自身免疫性疾病患者的临床结果,结果表明这些细胞免疫调节特性。然而,msc如何应对炎性细胞因子和调节免疫仍然是未知的。

microrna已被证明在各种细胞过程中起着关键作用,抑制目标mrna的翻译。microrna的表达谱异常可能与不同的人类疾病,包括炎性疾病,这表明一些小型非编码rna有免疫调节功能3]。我们假设相声msc和炎症刺激之间发生通过受监管的microrna的表达。

hASCs,孤立和扩大从脂肪组织,是一种有前途的MSC。在这项研究中,我们使用一组炎性细胞因子刺激hASCs microrna的概要,然后探讨了后续变化的细胞使用微阵列分析。我们确认7 microrna之间的明显差异表达细胞因子和正常组。以下5个microrna是调节:mir - 155 - 5 - p, 665年,19 b-3p, 146 b-5p, 543。以下2个microrna表达下调:mir - 4430年和-4497年。

mir - 543的microrna的表达是最显著的调节细胞因子组与正常组。具体来说,mir - 543表达水平不同两组之间的40倍以上。在一项研究中,mir - 543显示调节MSC老化减少AIMP3 / p18表达式[21]。其他调节microrna是所有已知的与炎症性疾病。mir - 155和miR-19b-3p了调节乙型脑炎病毒(JEV)调解的炎症(22,23]。mir - 155也被报道减少msc的免疫抑制能力(24),是由炎症调节启动后foreskin-derived msc (25]。146 b-5p mir - 665,和155 - 5 - p都是调节在溃疡性结肠炎患者的结肠发炎26],mir - 146 b - 5 - p也被证明是调节类风湿性关节炎滑膜组织(27),参与人类视网膜色素上皮细胞的免疫抑制功能(28]。

这些研究,我们的研究结果作为强有力的证据显示,microrna在免疫调节方面扮演着关键角色hASCs的属性。理解这些microrna的机制进一步调节免疫反应,我们预测microrna的目标基因和途径进行分析。不出所料,我们确定了几个相关的几种途径,如T细胞受体信号通路,FoxO信号通路,TGF -β信号通路。我们也分析了路径的目标个人microrna。mir - 543、155 - 5 - p 146 b-5p, 19 b-3p所有目标的几种目标路径。我们也注意到,mir - 155 - 5 - p和NF - 146 b-5p目标κB信号通路,一个发现与之前的研究一致4]。

自体hASCs可以很容易地得到以最小的痛苦和副作用。因此,hASCs的临床应用非常有前途,这些细胞在某些疾病的治疗效果已被报道(1]。阐明hASCs发挥其免疫调节作用的机理可能改善他们的治疗效果。microrna表达的不同确定在本研究可以作为治疗目标,和overexpressing microrna anti-immunity功能可能增强hASCs的免疫抑制特性。然而,这些特定功能的microrna在hASCs体外和体内仍然需要进一步说明。

5。结论

我们第一次发现的microrna的表达谱hASCs炎症刺激下变化显著。五个microrna调节,2 microrna表达下调细胞因子组与对照组相比。这些不同的microrna表达可能参与免疫反应的几个相关的几种途径,因此作为目标,通过它可以增强hASCs的免疫调节功能。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关这篇文章的出版。

作者的贡献

Zicheng王、李海丽和李诚的构思和设计工作。Zicheng王,李诚准备手稿。海丽Zicheng Wang李、王郝同德Lv和完成了实验。李诚和中原张分析数据。剑林和金立群周监督项目和写的手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。Zicheng王、李海丽和李诚是相等的贡献者。

确认

这项研究得到了中国自然科学基金(批准号81670617)和北京大学第一医院的研究基金会(批准号2016 qn18)。作者非常感谢北京指南针生物科技公司提供优秀的技术援助与微阵列实验。作者感谢Xi Yu博士协助英语修订手稿。

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