有效的人类病毒转染骨髓间充质基质细胞显示使用胎盘生长因子超表达

文摘

背景。人类间充质基质/干细胞(hMSCs)蕴含着巨大的潜在治疗由于其免疫调节和组织再生能力。增强的生物特性的hMSCs转染细胞,已成为调查的重点以基因为基础的疗法。然而,许多当前瞬时转染的方法导致转染效率低或高细胞毒性。方法。为了找到一种转染方法,解决当前问题的转染效率低和高细胞毒性,6商用阳离子脂质和聚合物试剂测试对人体骨骨髓来源msc (hBM-MSCs)利用绿色荧光蛋白作为报告基因。转染方法使用公交- 2020被选中和测试重点是细胞质量(可行性、身份和产量),以及疗效与人类胎盘生长因子(PlGF)质粒。结果。交通- 2020取得了最高的荧光信号每个细胞的方法并没有减少细胞复苏。使转染GFP 5 hBM-MSC捐助者使用交通- 2020取得了24 - 36% GFP-expressing细胞生存能力为85 - 96%。hBM-MSC身份是影响CD90、CD105和CD73标记在转染后留存(> 95%)。当该方法应用到PlGF表达式,有分泌增加220倍。增长和分泌的PlGF overexpressing hBM-MSC持续超过7天,可持续性和适用性的确认运输- 2020转染体系。讨论。我们报告的一种简单而有效的方法对瞬时转染hBM-MSCs尚未报道,包括高水平的质粒表达基本hBM-MSC特征没有显著变化。

1。介绍

多功能人类间充质基质/干细胞(msc)是一个异构的基质细胞能够支持造血作用,中介组织修复和免疫调节1]。基于这些重要的生物功能,增殖能力和immunoprivileged特征,msc已经成为一个主要的焦点调查许多潜在的治疗应用。这包括心血管、免疫和神经退行性疾病与未满足临床需要2]。尽管msc可以从许多组织来源获得,最常见的是那些来自骨髓(hBM-MSCs) [3]。值得注意的是,hBM-MSC治疗的临床效用可以极大地增强了基因修改旨在改善某些生物学特征等重要特征生存和效力4,5]。策略从交付使用细胞作为一个向量的治疗药物,旨在组织修复/再生[6,7)提供抗肿瘤药物对癌症(恶性网站8- - - - - -10]。基因修改hBM-MSCs时,重要的是不要妥协细胞质量(可行性、身份和产量),强度和安全,因为所有在翻译时要考虑的重要方面研究成果诊所(11,12]。

哺乳动物细胞的基因改造通过外源性核酸可以执行病毒(复古、lenti或腺病毒)和病毒的方法,如阳离子脂质和聚合物。由于难以使转染hBM-MSCs,一些病毒基因运载系统的效率高了他们一个有吸引力的转染方法(4,13]。然而,病毒转染与重大的健康风险,因为他们可以引起免疫原性反应和不受控制的转基因表达,从而导致转基因细胞的特征变化(14- - - - - -17]。

而病毒的方法,如阳离子脂质和聚合物通常没有转染效率高达病毒方法,减少劳动强度,低免疫原性(18- - - - - -23]。这些阳离子脂质和聚合物复合物通过静电相互作用与磷酸盐骨架的核酸。聚合物和阳离子脂质转染符合方案屏蔽DNA的负电荷通过使用带正电荷脂质或合成聚合物链,分别以促进核内体吸收的基因传递,随后介绍了细胞通过内吞作用[24,25]。此外,阳离子脂质和聚合物可以交付更大的转基因和使用时可以像病毒一样有效的方法治疗noninherited疾病(26- - - - - -29日]。截至2012年,脂质转染是第二个最流行的病毒的基因修改系统在临床试验中使用的5.9%30.]。本研究的目的是找到一个有效的手段维护高瞬时转染的细胞质量通过比较报道和报道转染系统hBM-MSCs商用。

2。材料和方法

2.1。hBM-MSC细胞培养

hBM-MSC细胞系购买这项研究(12 rb hBM-MSC # 15 #, # 37 rb, # 48 rb, # 56 rb和# 85 rb)来自6个健康男性捐赠者的骨髓的公司“知情同意”(补充表1)。hBM-MSC # 15是来源于单核细胞(猫。# 1 m - 125 d)与世隔绝Lonza (Lonza Walkersville,医学博士,美国)并使用无血清MesenCult-XF生长介质(猫。# 05429,干细胞技术;加拿大温哥华)在烧瓶内涂有MesenCult-SF附件衬底(猫。# 05424,干细胞技术)。所有hBM-MSC RB(猫。# msc - 001)细胞生成的主细胞库和特征是RoosterBio Inc .(美国马里兰州弗雷德里克)。RB细胞生长在low-serum-containing RB完全培养基组成hBM-MSC高性能基础培养基和hBM-MSC媒体助推器,GTX公司补充(猫。# kt - 001, RoosterBio Inc .)。我们进一步执行hBM-MSC描述使用人口倍增,hBM-MSC表面标记和分化潜能(补充表1)。hBM-MSCs前所述协议[后是有区别的31日]。RB细胞,StemXVivo Chondrogenic基地媒体(猫。# CCM005、研发系统;明尼阿波利斯,美国)被用于软骨细胞的基底媒体。最低必要的媒介α(热费希尔科学)HyClone定义的边后卫(热费希尔科学)是用作脂肪细胞和骨细胞基底媒体。抗体是来自eBioscience(美国圣地亚哥,CA)和BD生物科学(米西索加、加拿大);补充表中可以找到的细节2。所有流式细胞术样品进行分析使用LSRII流式细胞分析仪(BD生物科学)和FlowJo V10(美国FlowJo LLC、亚什兰或)。最少40000事件记录。

2.2。质粒的制备

pCMV6-AC-GFP(猫。# PS100010)和pCMV6-AC-PlGF(猫。# SC320206)质粒买来OriGene(罗克维尔市,医学博士,美国)。pCMV6-AC-GFP放大使用Alpha-Gold主管细胞(猫。# CC100001 OriGene)和pCMV6-AC空向量生成甘油股票(猫。# PS200020-GLY OriGene)。使用一个EndoFree这些质粒纯化质粒马克西工具包(猫。# 12362,试剂盒;加拿大多伦多)。浓度和纯度(> 1.80 260/280和260/230 > 2.0)每次使用前评估2000年NanoDrop(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。

2.3。屏幕上的阳离子脂质和聚合物转染多变量分析

发布的多元96孔板法Sandbichler et al。32)是适应评估6商用阳离子脂质转染效率和聚合物试剂;Lipofectamine第(表达载体)猫。3000 # 15338 - 100,Lipofectamine(表达载体)猫。2020 # l3000 - 008, Trans-IT (Mirus)猫。5400 #米尔Trans-IT 293 (Mirus)猫。2700 #米尔jetPRIME (Polyplus)猫。# 114 - 01,表面(σ)猫。# 408727。hBM-MSC # 15细胞的转染(6.0×10³细胞/嗯,96孔板),介质被取代后24小时。执行与GFP转染质粒(pCMV6-AC-GFP)在不同条件下根据每个制造商的协议概述了在图1(一)。hBM-MSCs孵化了各自的复合物在孵化前24小时在活细胞成像解决方案(猫。# A14291DJ表达载体;美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)1:10000年赫斯特33342年(表达载体)1小时前总GFP信号的量化和细胞复苏在扫描板(GFP例:485/20,em: 528/20和宏彻例:360/40,em: 460/40) 2的协同作用(热费希尔科学)板读者。总细胞恢复从播种密度是由插值生成标准曲线(0 - 15000细胞/)使用赫斯特33342年。这也是用于规范化GFP表达每个细胞的表达总GFP荧光信号的比值(RFU)在细胞内插在每个的数量。

2.4。细胞转染效率和质量的定量评估6-Well盘子

24小时后播种,hBM-MSC # 15 (1.5×10⁵细胞/ 6-well板)的培养基是补充。细胞培养与交通- 2020:质粒复杂,试剂/ DNA (R / DNA)比例的2.0 (5μ2.5 l的试剂μ3.0 (7.5 g的DNA)μl试剂到2.5μg (DNA)或4.0 (10.0μl试剂到2.5μg (DNA)前24小时收获细胞表面标记染色。

hBM-MSC # 37 rb,细胞被播种在1.0×10⁵细胞/转染前24小时达到70 - 90%融合6-well板。细胞培养与交通- 2020:质粒复杂在完全培养基比3.0 24小时(24 h-cm),在Opti-MEM(猫。# 51985034,热费希尔科学)4小时前被替换为厘米剩下的20小时(4 h-om)或Opti-MEM总共24小时(24 h-om)(补充图2)。流仪分析,细胞被洗和悬浮在PBS含有2%的边后卫和2毫米EDTA然后用4海里SYTOX橙色(猫孵化。# S34862热费希尔科学)5分钟来评估细胞的可行性。门做了选择的细胞群,把紧身衣,排除使用SYTOX橙染料死细胞。

与4 h-om转染条件重复4额外hBM-MSC捐助者(# 12 rb, # 48 rb, # 56 rb和# 85 rb)同时还包括捐赠# 37 rb。细胞检测CD90、CD73和CD105表面标记表达式(补充表2转染后)和区分能力。细胞毒性也评估使用皮尔斯posttransfection™乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试验设备(猫。# 88954,热费希尔科学),生产后的协议cell-conditioned媒体。

2.5。评估ELISA的转染效率

hBM-MSC # 37 rb细胞转染使用R / DNA比值为3.0 4 h-om转染条件与胎盘生长因子(PlGF)质粒(pCMV6-AC-PlGF),一个空的矢量控制(pCMV6-AC),或者只转染试剂控制(R), 24小时后,细胞生长是评估和cell-conditioned媒体收集并冻结在−80°C的后人类PlGF水平的量化PlGF酶联免疫试剂盒(猫。# ab100629 Abcam;英国剑桥)根据制造商的协议。细胞转染过程扩大到750000在T75瓶血压得到较好的控制,PlGF丰富水平和细胞生长也评估从PlGF-overexpressing hBM-MSCs。转染后,hBM-MSC # 37 rb细胞被播种在37500细胞/ 6-well板后评估增长和PlGF水平1、5、7天。细胞生长计算百分比除以活细胞计数在每个时间点的初始细胞播种和乘以100。活细胞测定用台盼蓝排斥%简历的不到20%。

2.6。微观评估

代表的照片hBM-MSC # 15被转染后24小时使用evo FL显微镜(英杰公司)(客观4 x,索尼ICX285AQ彩色CCD摄像机,和evo®FL细胞成像系统软件)。代表的照片hBM-MSC RB细胞被使用一个Axio观察者Z1显微镜(卡尔蔡司、从、德国),与10-20X目标,Axiocam 506相机,A-Plan10x / 0.25(或20 x / 0.3) Ph1客观镜头,和禅宗2 Pro采集软件。

2.7。统计分析

对于每一个实验,数据表示为标准误差的平均值(S.E.M.)至少3独立实验(图1, ;图2, ;和图3, 实验),技术重复或一式三份,注明图传说。意义分析了单向或双向方差分析(方差分析)Dunnet或Bonferroni事后分析,在适当的时候,一个——或者双尾的学生t以及,纠正使用Holm-Sidak校正时必需的。统计分析使用GraphPad棱镜版本6.0 (GraphPad软件公司,拉霍亚,CA,美国)。一个 - - - - - -值< 0.05被认为是统计学意义,意义差异是标有一个星号( ),双星号( ),或一式三份星号( )。

3所示。结果

3.1。选择运输- 2020 6阳离子脂质聚合物hBM-MSC转染

从6商用阳离子脂质聚合物测试hBM-MSC # 15在96孔板使用(图2使转染条件1(一)),4试剂(3000年Lipofectamine Lipofectamine肝,交通- 2020和运输- 293)显示,GFP表达显著增加每个细胞试剂相比,他们只控制(R),相对荧光报道单位(RFUs)(数据1 (b)和1 (c))。所有的转染试剂,除了Lipofectamine肝移植,细胞恢复(图显示无显著变化1 (d)),当基因修饰细胞作为一个重要方面最终细胞产量通常是重要的临床翻译。由于交通- 2020转染系统显示最高的GFP表达没有减少细胞复苏,这是选择进一步验证其性能。

3.2。成功的扩大使用交通- 2020同时保持GFP表达,hBM-MSC表面标记,和生存能力

调查关注交通- 2020系统,我们扩大6-well板来评估方法的可行性在更大的范围和测试三种不同的R / DNA比率(2.0,3.0,和4.0 R / DNA),因为R / DNA比率可以影响转染效率。3.0的R / DNA比GFP +细胞的比例最高(35.4±6.6%)和平均荧光强度(MFI) (39390±6340 MFI),没有明显影响表面标记表达式(> 95%),同时保持超过80%的可行性(补充图1),导致我们选择R / DNA比值为3.0,追求进一步的测试。

交通- 2020的进一步测试是通过额外hBM-MSC捐赠者,hBM-MSC # 37 rb验证适用于hBM-MSC在不同文化条件下产生的。除了24小时的潜伏期在完全培养基(24 h-CM)推荐的制造商,我们检查了2条件下使用Opti-MEM介质4 (4 h-om)或24小时(24 h-om) R / DNA复合物的孵化时间来验证效率是否会增加无血清条件下(补充图2)。

获得了GFP +细胞的比例最高的24 h-om条件(52.1±6.4%),而4 h-om和24 h-cm条件导致32.0±4.8%和38.7±7.8% GFP +细胞,分别为(补充图3 (b))。所有条件明显表达GFP比R(0.53±0.09%、0.37±0.05%和0.35±0.07%,分别)。然而,4 h-om条件达到最高的平均荧光强度(MFI)衡量的每个细胞,GFP表达量为39469±5185相比MFI 24 h-om (27500±3555 MFI)和24 h-cm条件(21178±3661 MFI)(补充图3 (c))。尽管24 h-om条件GFP +细胞的比例最高(补充图3 (b)),统一GFP表达(补充图3 (a))和高MFI(补充图3 (c))的4 h-om表示,这种情况导致转基因hBM-MSCs与最有效的转基因表达。这促使我们继续4 h-om为未来的实验条件。

4因此h-om条件测试4额外hBM-MSC RB捐助者为了确定donor-donor可变性的数量以及其他hBM-MSC捐助者的适用性。GFP表达的范围(图24 - 36%2 (b)(图),生存能力的85 - 96%2 (c))、LDH(图1.7 - -2.3%的细胞毒性2 (d)),表明有效GFP表达而不影响细胞的健康。转染后,CD73、CD90、CD105表面标记物表达水平> 95% +(图2 (e))和测试所有细胞能够分化为骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞(补充表3),确认hBM-MSC身份并没有改变。

3.3。应用4 h-om转染条件PlGF过度hBM-MSCs

4 h-om基于GFP记者质粒转染条件优化工作流然后进行适用性检测使用PlGF质粒编码。此外,由于hBM-MSC至少37 rb细胞GFP的表达质粒在所有记者捐助者测试,证明优化的适用性是选择4 h-om条件使用PlGF质粒。我们发现严重超标的分泌PlGF PlGF-transfected hBM-MSCs (315±50 pg / ml)相比与空质粒转染的细胞(5.25±0.75 pg / ml),没有明显影响细胞生长(268±14%)或可行性(96.1±0.24%),表明PlGF没有组成细胞的有效生产卫生数据3 (b)- - - - - -3 (d))。显示方法的潜力成为进一步扩大生产临床相关的剂量的转基因hBM-MSCs,相同的工作流是扩大T75,血压得到较好的控制屈服PlGF分泌水平增加了220倍2353±195 pg / ml,这是相比明显高于空质粒转染细胞为10.2±1.4 pg / ml。PlGF-overexpressing细胞维持293±17.9%增长和95.9±0.8%可行性(数据3 (e)- - - - - -3 (g))。知道细胞能否维持PlGF产量随着时间的增加,潜在的临床应用的重要特征,overexpressing hBM-MSCs收获和受移植者监控PlGF cell-conditioned介质的分泌水平。PlGF表达水平在显著提高整个7天期和107.3±13 pg / ml相比空plasmid-transfected细胞(50.48±5.2 pg / ml)后7天内(图3 (h))。此外,hBM-MSCs继续长大后7天内,可以达到400%以上增长与空质粒转染与PlGF转染(图和超过600%的增长3(我))。在一起,这些结果表明,一个功能的质粒,PlGF可以在hBM-MSCs没有降低生存能力和增长。

4所示。讨论

由于基因修改的治疗潜力骨骨髓来源msc、有强劲需求的有效方法是暂时性的把hBM-MSC转染。然而,许多方法面临挑战等低效率或低细胞质量。开展这项研究之前,我们首先测试Lipofectamine 3000系统hBM-MSCs由于报道的成功与Lipofectamine系统(19,33]。然而,我们观察到的低细胞复苏posttransfection(数据没有显示)。这促使我们比较Lipofectamine 3000 5个额外的商用转染系统从3不同类别(脂类、聚合物和lipid-polymer-based系统)为了为hBM-MSCs找到最适合的方法。这些转染系统,Lipofectamine第(34],裴[35],Lipofectamine 300036)先前报道DNA转染成hBM-MSCs而交通- 2020,TransIT293, jetPRIME尚未报道。交通- 2020被选为候选系统因为它转染效率最高,而不影响细胞复苏基于我们与GFP的多元屏幕记者质粒。高细胞复苏以来治疗的目的是特别重要的临床相关的剂量的hBM-MSCs需要数以百万计的细胞(37,38]。

先前的研究表明,血清可能影响转染效率(39];因此,Opti-MEM被用作无血清培养基培养细胞的DNA和复杂交通- 2020 4小时(4 h-om),类似于其他无血清培养协议(19),或24 (24 h-om)小时。使用4 h-om条件,一个可观的GFP表达(26 - 35%),高细胞生存能力(85 - 96%)和低细胞毒性(1.7 - -2.3%)中观察5捐助者、强调测试多个捐助方的重要性来验证方法的适用性。自LDH释放质膜受损,LDH数据,以及可行性数据从台盼蓝和SYTOX橙色,提供了一个互补的意思是确定转染后细胞的健康在我们的研究中。

尽管GFP基因是一个很好的记者评估和优化转染效率,它几乎没有相关性增强临床有用的生物学特性。PlGF被选为一个概念验证质粒由于它在血管生成中的作用40)和神经保护hBM-MSCs overexpressing PlGF使用adenoviral向量改善脑缺血大鼠模型(27),已知的MSC的功能。使用优化转染的hBM-MSCs pCMV6-AC-PlGF 4 h-om转染工作流作为概念,展示一种分泌蛋白,通常表示在低水平hBM-MSCs [41),可以有效地中长达7天没有显著影响细胞的完整性。转染导致增加PlGF生产多达220倍当扩大T75这一点是重要的,因为治疗效果是血压得到较好的控制在活的有机体内当一个300倍增加了使用一个adenoviral的感染复数向量3000微升/细胞(27]。的成功扩大4 h-om条件使用公交- 2020转染方法从一个96孔板T75是非常重要的,因为它显示了潜在的血压得到较好的控制方法的可伸缩性可以用于生产转基因hBM-MSC临床相关的剂量。相比,显著增加细胞生长与PlGF-transfected细胞空向量可能与PlGF增加扩散的能力在各种类型的细胞,如内皮细胞和成纤维细胞(42]。

高达26 - 35%使用GFP记者质粒转染效率与多个捐赠者,我们的方法具有可比其他脂质转染效率和生存能力和聚合物转染方法(19,22,43]。虽然与转染效率高达58%已报告评议等Lipofectamine 2000,结果不一致的效率低于10%以来报道相同的试剂(33,44]。此外,我们的研究强调细胞通过细胞毒性分析和质量方面保留MSC的身份。hBM-MSCs > 95%阳性CD90、CD105和CD73转染后表面标记,可能不是所有报道转染方法的情况。细胞也表现出较低的细胞毒性与交通- 2020相比,其他所有捐助者转染方法检测LDH (44]。此外,其他大多数质粒转染的研究只使用记者并没有测试工作流使用感兴趣的基因的质粒编码,如PlGF。此外,虽然病毒转染可以产生更高的转染效率接近90%以上见腺病毒转染的BMP-2 msc、限制转染工作流由于增加观察免疫原性防止病毒转导利用通过合理要求更高的转染率高。不产生的结果,通过合理降低免疫原性影响转染效率份额(20 - 30%)与病毒的同行所示本研究表达病毒转染的好处(45]。总之,我们报告一个有效的和可访问的瞬态hBM-MSC转染不影响细胞的生存能力,身份,和产量,为临床使用[hBM-MSC质量的重要参数11,12]。应用于hBM-MSCs时,这种方法可以提高hBM-MSC细胞治疗通过增加大量的生物活性分子如PlGF显示潜在的治疗方法专注于再生医学。这个4 h-om优化转染的方法基于交通- 2020基因是一种很有前途的方法修改hBM-MSCs但需要进一步研究成功地翻译到诊所。如indication-specific临床前研究调查以及测试tumourigenicity临床翻译所需和免疫原性。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

我们感谢安德鲁跟踪狂的流式细胞仪设备中心的生物制剂评估与流式细胞术对他的帮助。

补充材料

补充1。补充表1:进程内hBM-MSCs工作细胞库的数据。补充表2:信息对hMSC表面标记抗体染色。补充表3:分化转染和untransfected hBM-MSCs骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞。

补充2。补充图1:转染hBM-MSC #使用运输15 - 2020不影响细胞的生存能力和表面标记分析。(一)代表荧光叠加的图像GFP +细胞(绿色)和细胞(亮场)交通- 2020转染hBM-MSCs 24小时后在3种不同的R / DNA比率6-well盘子。酒吧代表1000μm。(b)代表流量的转染细胞转染24小时后在所有3 R / DNA比率使用交通- 2020,在试剂(R)被用作控制。无污点的细胞(美国)和untransfected细胞(UT)也包括控制。(c)通过流式细胞术的GFP +细胞百分比量化。(d)转染细胞的平均荧光强度(MFI)通过流式细胞术量化。(e)的比例量化可行的细胞通过流式细胞术使用SYTOX橙色。(f)量化比例CD90 + CD105 +和CD73 +细胞转染后24小时在所有3 R / DNA比率使用Trans-IT 2020,只在试剂(R)被用作控制。结果从三个独立的实验技术副本。误差线代表使用单侧S.E.M.统计学意义了t以及, 。补充图2:图不同的孵化条件进一步优化转染GFP记者使用公交- 2020和质粒。补充图3:Opti-MEM孵化对交通的影响- 2020 hBM-MSCs转染。(a)代表GFP-transfected细胞的荧光图像使用公交- 2020,绿色代表GFP +细胞。转染是hBM-MSC # 37 rb文化24小时后在3种不同转染条件。酒吧代表500μm。孵化15分钟后R / DNA复合物,细胞被保存在完全培养基24小时(24 h-cm)或在Opti-MEM 4小时之前切换到CM为其余20小时(4 h-om)或Opti-MEM总共24小时(24 h-om)。(b)量化3转染GFP +细胞百分比的条件和各自的转染试剂(R)控制。(c)量化的GFP转染细胞的平均荧光强度(MFI)仪分析流动。(d)的比例量化可行的细胞通过流式细胞术使用SYTOX橙色。结果来自4个独立实验技术复制和误差代表使用单侧S.E.M.统计学意义了t以及面板1 b和多个t测试了Holm-Sidak面板1 c(校正 , )。

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