文摘
脂肪形成的分子是由一个复杂的网络,包括成纤维细胞生长因子。角质细胞生长因子(KGF)之前已经报道过老鼠preadipocytes促进扩散,尽管其特定受体的表达,FGFR2-IIIb / KGFR,实际上并不是在间充质细胞检测。在这里,我们表明,人类脂肪干细胞(对asc)显示在去KGF表达的增加,特别是在早期的步骤。此外,KGF能够引起瞬态ERK和p38 MAPK通路的激活这些细胞。此外,KGF促进ASC分化和支持分化途径的激活,如PI3K / Akt和视网膜母细胞瘤(Rb)的蛋白质。值得注意的是,我们观察到只有对asc FGFR2-IIIb量低,这似乎不是KGF活动负责。这里,我们第一次证明Neuropilin 1 (NRP1),一个跨膜糖蛋白表达对asc作为coreceptor对于某些生长因子,负责KGF-dependent途径激活这些细胞。我们的研究有助于阐明人类脂肪形成的分子基础,展示KGF的角色在这个过程的早期步骤,并指出NRP1作为一个前所未知的调解人的角色对asc KGF行动。
1。介绍
脂肪间充质干细胞(对asc)代表人口的自我更新和多功能细胞,存在于脂肪组织的血管基质,当适当的刺激,可以分化成多种细胞类型,即脂肪细胞,细胞,软骨细胞,骨细胞(1]。这些细胞在开发中扮演着重要角色,产后生长、组织修复和再生2,3]。基于这些属性,对asc是一个强大的工具不仅再生细胞治疗,也为研究分子机制参与脂肪形成。
脂肪形成的差异化已被证明是由一个复杂的转录因子网络,代数余子式和中间体从众多的信号通路,始于CCAAT /增强子结合蛋白的瞬时表达β(CEBPβ)和CEBPδ,进而激活过氧物酶体proliferator-activated受体γ(PPARγ)和CEBPα(4]。
纤维母细胞生长因子(FGF)的几位家人已报告调节脂肪形成。特别是FGF1产生脂肪组织和行为通过其特定受体FGFR1增强扩散,承诺,和分化preadipocytes [5- - - - - -7]。FGF2在脂肪组织和FGF10也表达了,每一个涉及脂肪形成。FGF2通过脂肪形成的差异化监管并显示浓度对脂肪形成的基因的表达(两相的影响8,9]。FGF10脂肪组织的发展是至关重要的,因为一方面它刺激preadipocytes扩散通过RAS / MAPK通路的激活(10- - - - - -12),另一方面它调节脂肪形成的分化,导致CEBP等脂肪形成的基因的表达β和PPARγ(13]。
KGF, fgf的另一个成员的家庭,也称为FGF7,一直也在脂肪组织中发现14,15]。KGF主要由间充质细胞起源和旁分泌的方式作用于上皮细胞、器官形成中起着重要的作用,血管生成,不同器官的再生(16,17)以及在扩散和迁移等细胞过程(18,19]。众所周知,KGF行为绑定FGFR2-IIIb受体,也叫做KGFR,通常表达于上皮细胞。它或者拼接异构体FGFR2-IIIc主要表达间充质细胞谱系,通常结合FGF家族的其他成员,如FGF1和FGF2 [20.]。然而,最近有报道称KGF能够促进小鼠preadipocytes扩散通过PI3K-Akt信号通路的激活21]。此外,KGF似乎刺激脂肪形成的关键调节因素的表达,比如CEBPα,CEBPδ,sterol-regulatory元素绑定蛋白1 (SREBP-1),在肺泡II型细胞(22]。然而,KGF对asc影响人类还没有被调查。
此外,尽管KGF据报道为preadipocyte核扩散和脂肪生成以自分泌的方式,参与FGFR2-IIIb的行动并没有被证实,和以前的工作表明KGF preadipocyte扩散通过一个未知的可能发生的刺激受体而不是FGFR2-IIIb [21]。
Neuropilin 1 (NRP1)是一种跨膜糖蛋白,是各种类型的配体的受体,如3班semaphorins神经元、血管内皮生长因子(VEGF)家族在内皮细胞和血小板源生长因子(PDGF)在巨核细胞23,24]。NRP1,尽管普遍认为coreceptor对于这些生长因子,已经发现一些诱导激活的信号通路也独立于其他酪氨酸激酶受体表达(25]。
我们的研究已经集中更好地定义KGF在人类脂肪形成的潜在作用通过分析其表达在脂肪形成的差异化,在脂肪干细胞增殖和评估其对asc激活细胞信号的影响。然后,我们分析了其作用机理,试图确定对asc的受体参与KGF-mediated刺激。
这项工作可能有助于更好的理解脂肪形成的分子基础,而且它还将突出未知Neuropilin 1作为调停者的角色KGF行动在这些细胞。
2。材料和方法
2.1。脂肪组织捐助者
从腹壁皮下脂肪组织样本收获还有七个健康的捐赠者(年龄范围:22-55年,BMI范围:18.5 - -24.9公斤/米2),他接受了选择性整形手术。捐赠者没有系统性疾病或糖尿病,也把药物可能影响质量的脂肪组织和新陈代谢。鉴定样本运送到了实验室在24 h的收集和处理。
脂肪组织的临床样本的使用ASC隔离遵守赫尔辛基宣言1975年修订,2008年已通过实验医学部门的机构审查委员会Sapienza大学的罗马(Ref 11.1.2/27-10-2015)。获得书面同意从所有科目。
2.2。细胞隔离和文化
脂肪组织样本转移到无菌管和清洗广泛无菌磷酸盐(PBS)含2% PSG去除污染碎片和红细胞。然后,脂肪组织转移到培养皿中,与0.075%胶原酶消化(I型;Gibco,佩斯利,英国)在PBS 37°C 30 - 60分钟,与柔和的风潮,分解细胞外基质。胶原酶的灭活与同等容积的杜尔贝科的修改鹰的介质(DMEM;Gibco)补充10%胎牛血清的边后卫,悬架是轻轻地用移液器吸取到100年解体和过滤μm筛网过滤器移除碎片。stromal-vascular分数(SVF),其中包含对asc,随后在2000 rpm颗粒状通过离心5分钟。的颗粒状细胞resuspended DMEM-Ham F-12媒介(/卷,卷1:1)(DMEM / F12;Gibco)补充20%的边后卫,100 U /毫升青霉素,链霉素100毫克/毫升、谷酰胺和2毫米和镀75厘米2组织培养瓶涂有胶原蛋白(IV型;Sigma-Aldrich,意大利米兰)。SVF分数包含一个unpurified基质细胞,其中包括对asc,而且循环细胞,造血干细胞、内皮祖细胞。对asc的选择SVF在随后的组织培养的段落,因为它们是塑料组织cultureware附着。
对asc保持在5%的股份有限公司2孵化器在37°C在湿润的气氛中,与介质变化每周两次。当融合达到80 - 90%,细胞分离与0.5毫米EDTA / 0.05%胰蛋白酶(Gibco) 5分钟在37°C和山肩。对asc扩展和细胞生存能力被利用台盼蓝排斥试验评估。细胞形态是相衬显微镜评估的。均匀的人口对asc随后检查通过分析表面标记表达谱。对asc的所有实验中,使用段落2和6之间。
腺癌的细胞系MCF-7和mda - mb - 231从美国获得类型文化集合(ATCC-LGC Promochem,特丁顿,英国)和在杜尔贝科的修改鹰培养基培养(DMEM;表达载体,卡尔斯鲁厄,德国),补充10%胎牛血清(的边后卫;英杰公司)和抗生素。人类成纤维细胞的主要文化(HFs)建立了从1厘米2全层皮肤活检从健康捐献者,如前所述[26),包含10%的边后卫在DMEM和维护。
2.3。流式细胞术
流仪分析通过使用FACSCalibur血细胞计数器(BD生物科学,圣何塞、钙、美国),如前所述[1]。简而言之,培养对asc是收获,离心机,30分钟在冰冷的2%多聚甲醛固定。单细胞悬浊液洗在流式细胞术包含PBS缓冲,2%的边后卫,0.2%渐变20然后孵化与单克隆抗体30分钟CD29, CD34, CD44, CD45, CD90、和CD166共轭异硫氰酸荧光素、藻红蛋白或phycoerythrin-Cy5 (BD生物科学)。的单克隆抗体都是IgG1同形像。细胞特异性的荧光是由孵化与共轭马伯反IgG1 (DakoCytomation、斯特鲁普、丹麦)。
2.4。Multilineage分化
chondrogenic脂肪形成的,对asc和成骨分化的培养是通过使用人类间充质干细胞功能识别工具包(研发系统,Inc .,明尼阿波利斯,美国),它包含特殊配方媒体补充剂和一组抗体定义成熟脂肪细胞的表型,软骨细胞,骨细胞,之前报道(27]。特别是,脂肪形成的分化,细胞resuspendedαMEM (Gibco)补充10%的边后卫,100 U /毫升青霉素,100μg / ml链霉素,2毫米谷酰胺和播种在盖玻片上24-well盘子,密度约为3.7×104细胞/。媒介是每2 - 3天更换一次,直到confluency达成100%,然后用脂肪形成的分化细胞培养介质(ADM,αMEM补充解决方案包含氢化可的松、isobutylmethylxanthine和消炎痛;研发系统),诱导脂肪形成。在KGF-treated细胞,ADM补充1 ng / ml KGF(纽约北部的生物技术,普莱西德湖)。ADM和ADM + KGF取代每3 - 4天。脂质空泡的出现被显微镜检查监控。
2.5。免疫荧光分析
如前所述(执行免疫荧光28]。短暂,细胞生长在盖玻片上24-well板固定在4%多聚甲醛在室温下30分钟,接着用0.1米甘氨酸在PBS 20分钟在PBS和0.1% Triton x - 100额外5分钟允许透化作用。细胞培养用以下主要抗体:反CD29单克隆抗体,反CD166单克隆抗体(BioLegend、圣地亚哥、钙、美国),反CD34单克隆抗体(BD生物科学),和山羊anti-mouse FABP4抗体(研发系统)。在PBS适当的洗涤后,主要抗体可视化使用FITC-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白(美国接头研究产品,达勒姆,NC)或德州Red-conjugated兔抗体免疫球蛋白(杰克逊ImmunoResearch实验室、西树林,PA,美国)。
免疫荧光实验,非特异性荧光是由省略主要抗体。核可视化使用4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)盐酸盐(Sigma-Aldrich)。single-stained和合并图像获得与AxioVision软件(卡尔蔡司,耶拿,德国)使用20 x物镜。定量分析是由计数细胞表现出FABP4表达式(FABP4-positive细胞的百分数表示)。每50多个彩色细胞微观统计。结果从三个微观领域,表示为均值±标准差,在图表报告。
2.6。油红O染色
后21天从感应ADM和ADM + KGF,细胞被固定在10%福尔马林在室温下30 - 60分钟,孵化60%异丙醇5分钟和沾油红O解决方案,确定脂质,5分钟。获得的图像与AxioVision软件(卡尔蔡司,耶拿,德国)使用20 x物镜。随后,彩色油滴治疗与异丙醇洗提油红O染色,在490 nm和吸光度是量化。结果从三个独立的实验中,表示为均值±标准差,据报道在图。
2.7。MTT试验
细胞被镀到96孔板的密度2.5×103细胞/在DMEM-Ham F-12补充10%的边后卫,然后为18 h和血清饥饿处理与否与20 ng / ml KGF 1 - 5天。然后,肝癌和0.5毫克/毫升(3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化;σ,圣路易斯,密苏里州,美国)补充说,混合到每个好,孵化在37°C。4 h后,MTT-medium混合物被100人μl二甲亚砜(DMSO溶液;σ,圣路易斯,密苏里州,美国)添加在每个。吸光度值为490 nm的ELISA标仪(美国Bio-Rad大力神,CA)。结果从三个独立的实验中,表示为均值±标准差,据报道在图。
2.8。rt - PCR和实时定量PCR(存在)
对asc是收获和总RNA提取试剂盒的使用试剂(表达载体)。互补脱氧核糖核酸与低聚糖生成(dT) 1μ使用上标3 g的RNA逆转录酶工具包(表达载体)。具体NRP1 PCR引物(表1)使用,PCR条件如下:坚持2分钟在94°C,紧随其后的是40个循环组成的变性在94°C(15秒),退火在62°C(30岁),和伸长72°C(20岁)。放大产品受到1.5%琼脂糖凝胶电泳。GAPDH基因被用作参考。实时定量PCR检测(存在)进行了一式三份ABI 7500实时仪器(应用生物系统公司)如前所述29日]。简单地说,大量的KGF、FABP4或NRP1使用适当的量化实时TaqMan基因表达分析工具包(应用生物系统公司被生活技术,卡尔斯巴德,CA,美国)。还有(PPIA) mRNA作为内生控制。FGFR2-IIIb和FGFR2-IIIc具体定制TaqMan底漆/探针分析开发和使用的浓度1 x /。引物和探针在桌子上1。目标记录的绝对拷贝数是根据获得的质粒DNA标准曲线,如前所述[30.]。脂肪形成的分化标记PPAR的分析γ使用SYBR执行绿色PCR大师混合工具(应用生物系统公司),和引物设计根据纽厄尔et al。6]。
2.9。免疫沉淀反应和免疫印迹分析
细胞,治疗与否与20 ng / ml KGF表示时间,细胞溶解在里帕缓冲区。免疫沉淀反应实验,800年μg的溶解产物被孵化anti-NRP1抗体在一夜之间在4°C,然后在4°C 2 h 20μl蛋白A / G PLUS-Agarose (Santa Cruz)。免疫复合物是由离心收集和清洗三次冰冷的里帕缓冲区。最后一个洗后,上层的丢弃,颗粒在SDS裂解resuspended缓冲区,然后煮4 x SDS加载染料为5分钟。蛋白质是解决减少条件下10% sds - page和转移到Immobilon-FL膜(美国默克密理博,Billerica的)。膜被封锁在TBS含有0.1%渐变20 (TBS-T)和5%牛奶1 h 25°C,然后孵化一夜之间在4°C以下主要抗体:anti-Neuropilin 1 (a - 12)和anti-FGF7(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国)。膜被孵化与山羊anti-mouse IgG1重链,(合)共轭二次抗体(Abcam,剑桥,英国)1 h在25°C。结合抗体检测,增强化学发光检测试剂(IL皮尔斯生物技术公司,罗克福德,美国),根据制造商的指示。免疫印迹分析,总蛋白(50 - 150人μg)减少条件下解决了7 - 10% sds - page和转移到Immobilon-FL膜(美国默克密理博,Billerica的),如前所述[28]。膜被封锁在TBS含有0.1%渐变20 (TBS-T)和5%牛奶1 h 25°C,然后孵化一夜之间在4°C以下主要抗体:anti-phospho-p44/42 MAPK (Thr202 / Tyr204), anti-phospho-Akt (Ser473) anti-Akt, anti-phospho-p38 MAPK (Thr180 / Tyr182), anti-p38 MAPK, anti-phospho-Rb (Ser807/811) anti-Rb(细胞信号技术Inc .,丹弗斯,妈,美国),anti-ERK2, anti-Bek (C - 17), anti-Neuropilin 1 (a - 12), anti-FGF7(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国),和反β微管蛋白(Sigma-Aldrich)。FGFR2-IIIb表达式是通过使用一个自制的鼠单克隆抗体引起对肽氨基酸对应人类FGFR2-IIIb (314 - 36131日]。
膜被孵化与适当的辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体(圣克鲁斯生物技术)1 h在25°C。结合抗体检测,增强化学发光检测试剂(IL皮尔斯生物技术公司,罗克福德,美国),根据制造商的指示。微管蛋白,估计蛋白质等于加载。光密度分析使用数量执行一个程序(Bio-Rad实验室开发。贝鲁斯科尼,MI、意大利)。
2.10。高性能薄层色谱分离法
对asc未经处理或处理20 ng / ml KGF 24 h在裂解缓冲细胞溶解含1% Triton x - 100, 10毫米TRIS-HCl (pH值7.5),150毫米氯化钠,EDTA 5毫米,1毫米Na3签证官4,75 U的抑肽酶和被允许站在4°C为20分钟。细胞悬液是机械Dounce同质化而中断(10中风)。然后,溶解产物在1300×g离心5分钟去除细胞核和细胞碎片。评估后由布拉德福德染色试剂测定蛋白质浓度(Bio-Rad, 500 - 0006),溶解产物受到脂质分析。中性脂质提取分离的高性能薄层色谱法(分离法使用己烷溶剂系统/乙醚/醋酸(70:30:1、v/v/v)和被染色检测到2%醋酸铜溶液在8%磷酸和随后在120°C加热15分钟。大约3分钟后,自由胆固醇,胆固醇酯和甘油三酯白色背景上的红色斑点,10分钟后转化成pink-brown斑点。定量分析是用NIH Image1.62软件(Mac OS X,苹果电脑国际)。
2.11。的差别siRNA-Mediated对这些FGFR2, NRP1
FGFR2-specific (siBek)或NRP1-specific (siNRP)短干扰RNA,它专门击倒FGFR2 Neuropilin - 1基因表达,分别小干扰RNA (siNC)以及消极的控制,不会导致任何的具体降解细胞信使RNA,买来圣克鲁斯生物技术。对asc的最终浓度与核转染25 nM,使用HiPerFect转染试剂(美国试剂盒,瓦伦西亚,CA)根据制造商的指示。转染细胞孵化在37°C 48 h在饥饿之前,接受20 ng / ml KGF在5分钟37°C,免疫印迹分析和处理。FGFR2的减少或NRP1表达对asc证实了免疫印迹。
2.12。统计分析
数据分析使用单向方差分析(方差分析)Bartlett测试后方差的同质性和Kolmogorov-Smirnov高斯分布的测试,其次是Newman-Keuls多重比较测试,或者在适当的时候,学生的t假设一个双尾分布以及对配对样本。所有数据报告在至少三个不同的实验,验证报告为平均值±标准偏差(SD)。只有值< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。ASC文化的表型特征
首先,我们获得的主要文化对asc从脂肪组织。培养对asc显示典型的梭形间充质干细胞的表型,相差显微镜观察到(图1(一))。然后,我们分析了特定的细胞表面标记的模式在我们ASC文化通过免疫荧光(图1(一)罪犯)和流式细胞术(图1 (b)),为了排除污染元素,如造血干细胞的存在。ASC描述了使用特异性表面标记物的表达,据报道其他地方的标准(1]。特别是,CD29、CD44、CD73 CD90、CD105,和存在被认为是典型的间叶细胞具备干细胞标记,而CD34、CD45被假定为造血干细胞表达的。免疫荧光分析证实,我们的细胞表达CD29和存在(图1(一),B和C)和负CD34(图1(一)对asc, D)。此外,流式细胞术在确认的表达CD29、CD44, CD73, CD90、CD105,和存在,而没有表达CD34、CD45的发现(图1 (b))。我们也评估对asc分化成各种细胞类型的能力。脂肪形成的,成骨,chondrogenic分化诱导21天,评估如前所述27]。特别是,细胞受到脂肪形成的差异化显示明显的胞内脂质堆积,被油红O染色(图1 (c)的)和表达lineage-specific FABP4蛋白质(图1 (c),对asc B)。诱导成骨的分化显示新创骨基质沉积,作为评估茜素红S染色(图1 (c)、C)和骨钙蛋白特异性蛋白的表达(图1 (c),D)。最后,对chondrogenic细胞颗粒诱导分化显示分泌硫酸粘多糖,作为积极为阿尔新蓝染色(图所示1 (c),E)和大型的表达蛋白聚糖aggrecan(图1 (c)F)。对asc进一步特征间叶细胞的表达和上皮标记(波形蛋白和细胞角蛋白14日resp)免疫荧光和免疫印迹分析,确认没有上皮污染物。对asc一直与他们间充质来源、波形蛋白阳性(图1 (d),一个;图1 (e)),而没有表达细胞角蛋白14 (K14)中检测出我们的文化(图1 (d),B;图1 (e))。因此,我们可以获得对asc没有污染的主要文化元素,如造血干细胞或上皮细胞。
(一)
(b)
(c)
(d)
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3.2。KGF表达在ASC脂肪形成
评估的潜在参与KGF在脂肪生成,我们通过脂肪形成的诱导细胞分化的培养基含有特定的补充剂(ADM)和评估的转录水平KGF对asc在几个分化时期(0、3、7、14和21天)的存在(图2(一个))。我们发现KGF表达波动在ASC分化,但它总是高于未分化细胞(0)天。特别是,我们观察到在早期和晚期分化最大upregulation(第三天,增长了1.9倍, 增长了2.0倍,天21日, 、职责)。为了更好地描述的参与KGF脂肪形成的早期阶段,我们评估了它的表达式在第一次的区别(图3天2 (b)),我们观察到的峰值在第一天去感应KGF表达(增长了5.3倍, ),因此建议的潜在作用KGF upregulation脂肪形成的早期阶段。我们还执行世行分析对asc第0天在21天的脂肪形成的差异化,以评估KGF蛋白表达(图2 (c))。即使是在蛋白质水平,对asc分化显示KGF表达增加(2.2倍),从而确认获得的数据被实时PCR在mRNA水平。
(一)
(b)
(c)
3.3。KGF对ASC扩散的影响
KGF是否也可以诱发ASC增殖,细胞血清饥饿,然后处理KGF 1, 2, 3, 4或5天,扩散是通过MTT试验评估(图3(一个))。没有观察到的细胞数量增长在前2天,这是兼容这些细胞的长期人口倍增时间(27]。在接触KGF 3和4天,我们观察到显著诱导细胞增殖(46%, 和21%, 、职责),这不是保持,直到第五天,可能由于KGF退化。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
评估KGF-mediated扩散机制在ASC文化中,我们分析了活化的细胞外signal-regulated激酶(ERK)途径和p38MAPK途径。我们发现一个一致的激活ERK1/2 KGF治疗5和30分钟后(1.5倍和3.4倍,分别地;图3 (b))。KGF治疗也能强烈使磷酸化p38蛋白质在相同的时间间隔(5.1倍和10.3倍,分别地;图3 (c)),从而表明这两种途径可能参与KGF-mediated ASC扩散。
为了更好地解决ERK和p38MAPK通路参与KGF-induced ASC增殖,我们决定评估ASC扩散的选择性抑制剂对这两种途径。首先,功效的ERK抑制剂U0126和p38MAPK抑制剂SB202190证实了免疫印迹分析ERK和p38磷酸化水平治疗后与KGF在每个抑制剂(人物的存在与否3 (d)和3 (e))。正如所料,与KGF治疗5分钟后,我们发现激活ERK1/2(1.6倍, ;图3 (d)和p38蛋白(1.8倍, ;图3 (e))。Cotreatment SB202190选择性地抑制p38磷酸化(0.8倍;图3 (e)),在不影响ERK磷酸化(1.5倍, ;图3 (d))。相反,治疗U0126强烈抑制KGF-mediated ERK的磷酸化(0.1倍, ;图3 (d))在不影响激活p38蛋白质(2.3倍, ;图3 (e))。然后,我们评估了ASC增殖。简单地说,细胞血清饥饿,然后用KGF治疗3天单独或结合ERK抑制剂U0126或p38MAPK抑制剂SB202190,通过MTT试验(图和扩散是评估3 (f))。在KGF-treated细胞中,我们观察到显著诱导细胞增殖(48%, ),如预期。有趣的是,没有增加细胞数量达到当KGF治疗进行SB202190 p38MAPK抑制剂的存在,甚至在细胞数量明显减少对asc KGF处理时结合ERK抑制剂U0126 (−35.4%, ),从而证实了这两种途径参与KGF-mediated ASC增殖。
3.4。KGF对ASC分化的影响
我们评估了KGF治疗对ASC中性脂质含量的影响。对asc是培养有或没有KGF 24 h,然后脂质提取并分析了高性能薄层色谱法。在数据报告4(一)和4 (b)KGF治疗显著增加的自由胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TGs)和胆固醇酯(CEs)(2.0倍、3.0倍和1.9倍,分别地。 )。
(一)
(b)
(c)
(d)
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(f)
然后我们分析的影响长期KGF对asc治疗诱导分化的脂肪形成的血统的标准协议。在21天的分化,细胞治疗与否与KGF沾油红O .定量可溶性油红O染色显示,脂滴的数量是高于KGF-treated细胞对控制细胞(CTRL)(2.3倍, ;图4 (c))。细胞还与脂肪细胞进行免疫荧光分析标记FABP4(图4 (d))。KGF治疗决定增加的百分比FABP4-positive细胞(30.6%比17.9%未经处理的细胞(CTRL), )。以来对asc KGF-treated证明增强比控制细胞分化,我们进一步研究了KGF能否调节特定基因的表达中存在参与脂肪形成。在21天的脂肪形成的差异化,PPAR的表达水平γKGF-treated细胞显示仅略有增加对未经处理的细胞(CTRL)(1.2倍;图4 (e)),而FABP4的水平明显高于在KGF-treated细胞(6.3倍, ;图4 (f)),从而加强与免疫荧光分析获得的数据。
为了澄清KGF影响细胞分化的机制,我们首先评估其影响持续ERK激活,激活后分化程序需要关掉ERK信号。我们证明了在对asc, KGF促进只有短暂的ERK激活,没有检测ERK的磷酸化后24 h (KGF治疗(图5(一个))。
(一)
(b)
(c)
然后,我们决定研究KGF在途径参与细胞分化的影响,比如PI3K / Akt和视网膜母细胞瘤(Rb)的蛋白质。报道在图5 (b)KGF能够产生一种蛋白激酶磷酸化,5和30分钟(1.9倍和3.3倍,分别地)。对asc我们还观察到一个重要的Rb蛋白的磷酸化KGF引起的治疗,5分钟后,30分钟后更加一致(1.6倍和5.3倍,分别地;图5 (c))。
综上所述,这些数据表明,KGF参与ASC核扩散和脂肪形成,通过促进多个通路的刺激。此外,这样的证据强调了在这些细胞的膜受体能够调解KGF下游信号。
3.5。对asc FGFR2-IIIb的表达和功能
KGF已知行为通过绑定到FGFR2-IIIb同种型(也称为KGFR),上皮细胞表达的起源,而另外拼接FGFR2-IIIc同种型通常是表达间充质细胞。我们决定调查对asc FGFR2亚型的表达,通过绝对量化存在的记录。简单地说,使用一系列的稀释质粒DNA作为模板,我们得到一个标准曲线FGFR2-IIIb FGFR2-IIIc,从我们获得的精确拷贝数都在对asc亚型,以及在人类成纤维细胞(HFs),用作间叶细胞谱系,控制和在人类乳腺癌细胞系MCF-7,用作控制上皮血统(图6(一))。正如预期的那样,我们观察到的高表达间充质同种型FGFR2-IIIc对asc和HFs中(大约2263和2302册/ 25 ng总RNA,职责),和强大的表达上皮细胞系的FGFR2-IIIb MCF-7(3768册),也表达少量FGFR2-IIIc(482册),由于其肿瘤的特性,如前所观察到的32,33]。HFs中没有表达大量FGFR2-IIIb(16张),但是,令人惊讶的是,我们发现一定数量的同种型对asc(252册)。
(一)
(b)
因此,评估存在FGFR2-IIIb记录这些细胞是否会对应于大量的蛋白质,我们做免疫印迹分析相同的细胞模型。免疫印迹与商业抗体针对FGFR2 (Bek),不歧视两个亚型FGFR2-IIIb FGFR2-IIIc,显示一致的FGFR2表达蛋白在所有三种类型的细胞(图6 (b))。然后,我们评估FGFR2-IIIb表达式通过使用自制抗体(31日),能够明确认识这个同种型。如图6 (b)免疫印迹分析MCF-7 FGFR2-IIIb确认一致的表达的细胞和在HFs中几乎检测不到表达。然而,我们发现一个微弱但不是表达对asc FGFR2-IIIb的可以忽略不计,从而确认中存在的数据。
这些结果对asc第一次证明,尽管他们间充质性质,能够合成和FGFR2-IIIb信使rna和蛋白质的表达量低。
所以,我们想知道这种低对asc的FGFR2-IIIb足以支持KGF-mediated途径激活这些细胞。为此,我们实现了对asc FGFR2基因表达的downmodulation转染FGFR2-specific小干扰RNA (siBek)。一个非特异性核作为负控制(siNC)。首先,我们分析了FGFR2沉默效率通过免疫印迹Bek多克隆抗体与KGF对asc或不治疗的5分钟37°C。微管蛋白是用来评估等于加载(图7(一))。SiBek专门FGFR2表达减少了80%以上,在未经处理的(CTRL)和KGF-treated细胞(0.1——0.2倍增加,分别地。 ),对治疗的细胞控制核(siNC)(图7(一))。应该注意到,KGF治疗诱导FGFR2蛋白质含量,减少可能由于受体的内吞作用和溶酶体降解(见图1时间课程实验)。然后,我们调查的效果上差别FGFR2对这些ERK激活KGF引起的。如图7 (b),基因转染对asc和FGFR2 siRNA没有导致显著减少ERK的磷酸化KGF (siNC siBek的1.7倍和1.6倍),因此建议KGF活动在这些细胞不是通过FGFR2-IIIb进行,但可能是由先前推测未知的受体。
(一)
(b)
3.6。识别潜在的替代对asc KGF在受体
为了找到另一个受体可能是负责KGF对asc途径激活,我们分析了KGF Entrez基因数据库34]。第一个互相作用的东西中报告基因“交互”部分是Neuropilin 1 (NRP1)等其他生长因子,已知coreceptor VEGF-A或PDGF。这样的交互已经证明了西方et al。35]。
我们第一次评估NRP1对asc表达,RNA和蛋白质水平(数字8(一个)和8 (b)、职责)。mda - mb - 231细胞被用作Neuropilin积极控制表达式。然后,确定NRP1受体与KGF在分子复杂的蛋白质,KGF共沉淀与NRP1受体的能力评估在对asc治疗与否与20 ng / ml KGF 5分钟。蛋白溶解产物与anti-NRP1抗体,免疫沉淀反应和immunoprecipitates探测存在KGF或NRP1受体的免疫印迹与相应的抗体。KGF蛋白质中发现NRP1免疫沉淀反应(图8 (c)KGF治疗后),从而表明KGF对asc和NRP1能够互动。这些数据可能促使我们调查NRP1参与ERK激活KGF引起的。为此,我们表达下调对asc NRP1的表达式通过一个特定的核(siNRP)。NRP1沉默的效率与KGF对asc或不治疗5分钟进行免疫印迹anti-NRP1抗体。微管蛋白是用来评估等于加载(图8 (d))。NRP1沉默是达到约70 - 80%的效率,在治疗和KGF-treated细胞(0.3倍和0.2倍,分别地。 ),对治疗的细胞控制核(siNC)(图8 (d))。在这个例子中,我们没有观察到明显降低与KGF NRP1蛋白质水平治疗后5 ,正如前面所示为FGFR2(图7(一))。为了更好的解决这一点,因为这种现象预计将如果NRP1函数对asc KGF在受体,我们执行时间课程实验来评估FGFR2的蛋白质含量和NRP1 KGF治疗后。细胞治疗与KGF 5 ,15 ,30. ,1 h, 2 h, 3 h然后分别受到世行分析FGFR2 NRP1(图1)。我们观察到,正如预期的那样,明显降低FGFR2水平5之后治疗( ),按照之前图所示7(一),然后FGFR2水平仍然明显低于未经处理的细胞治疗直到2 h ( )。关于NRP1,我们观察到,尽管在较小程度上,在长时间的KGF曝光,15后显著下降的表达式和30KGF治疗( 和 、职责)。因此,从时间课程实验中获得的数据并不冲突的潜在作用NRP1 KGF受体。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
然后,我们分析ERK激活诱导KGF在NRP1-silenced细胞。如图8 (e)显著差别,NRP1对这些抑制KGF-dependent ERK的磷酸化(siNC siNRP的1.0倍和1.3倍)。进一步评估NRP1 KGF-mediated信号通路,我们分析ERK的磷酸化p38MAPK, Akt在30分钟NRP1-silenced细胞KGF治疗(因为之前的实验显示更强的通路激活在这个时间点,见图3和5)。报道在图9,我们首先评估的效率NRP1沉默与KGF对asc或不治疗30分钟的免疫印迹anti-NRP1抗体。微管蛋白是用来评估等于加载(图9)。NRP1沉默达到治疗和KGF-treated细胞(0.4倍和0.3倍,分别地。 ),对治疗的细胞控制核(siNC)。NRP1沉默后,我们观察到显著减少KGF-induced激活ERK (siNC siNRP的0.4倍和1.9倍),p38 (siNC siNRP的1.0倍和1.9倍),和一种蛋白激酶(siNC siNRP的0.6倍和2.1倍)。
(一)
(b)
(c)
(d)
总之,NRP1似乎直接负责对asc KGF-dependent通路激活,因此建议其作为另一种生长因子在这些细胞受体。
3.7。FGFR2-IIIb和NRP1表达在ASC脂肪形成
评估的作用FGFR2-IIIb NRP1脂肪形成,我们通过脂肪形成的诱导细胞分化通过ADM介质和评估两个受体的转录水平上对asc数次分化(0、1、2、3、7、14和21天)的存在(图10)。我们发现FGFR2-IIIb表达式(图10 ())开始增加在ASC分化的第三天。特别是,我们观察到的最大upregulation中晚期的分化(第七天,增长了5.7倍, 第14天,增长了6.7倍, 、职责)。至于NRP1(图10 (b)),其表现为所有的分化过程中保持稳定,在天与峰值略有增加2和3的脂肪形成的感应(增加1.3倍),因此建议NRP1的潜在作用的反应对asc,内生KGF upregulation脂肪形成的早期阶段(见图所示2 (b))。
(一)
(b)
4所示。讨论
目前的研究提供了一个新颖的见解对asc KGF在人类脂肪形成的作用。众所周知,对asc以及骨髓干细胞(bmsc),释放可溶性旁分泌因子,包括KGF在内的这些细胞的作用是至关重要的治疗策略,以恢复上皮组织的结构和功能。然而,目前没有证据直接KGF对bmsc的影响。有趣的是,最近的证据表明KGF在人类脐cord-derived分化的间充质干细胞(hUC-MSCs)成汗水稍细胞(国网公司),与潜在领域的影响破坏汗腺的再生和受伤的皮肤36]。此外,KGF的角色在促进扩散途径在小鼠preadipocytes [21),在诱导脂肪形成的关键调节因素的表达在肺泡II型细胞(22,之前已经报道过了。然而,人类ASC KGF核扩散和脂肪形成的作用仍然需要阐明。在对比中观察到小鼠preadipocytes [21),我们演示了显著改变KGF信使rna表达水平在ASC脂肪形成的差异化,在第一天峰的分化。这个观察表明upregulation KGF表达可能需要ASC的适当的诱导分化,促使我们进一步研究KGF在脂肪生成的作用。
自一个KGF对preadipocytes扩散的影响就得以证实在小鼠模型(21),我们决定是否KGF也可能诱发ASC扩散。我们决定分析细胞外signal-regulated激酶(ERK)的激活途径和p38MAPK通路,因为它们都表示要求不仅为间充质细胞增殖也为有丝分裂克隆扩张,代表脂肪形成的第一步(37,38]。基于我们的研究结果,我们建议KGF可能促进对asc的扩散和有丝分裂克隆扩张启动脂肪生成通过激活ERK和p38MAPK通路。此外,在对比与观察到Zhang et al。21),我们表明,在人类对asc,增殖和分化并不相互排斥,因为KGF也能够促进脂肪形成的分化。这种双重角色在脂肪生成之前也为其他生长因子和受体,如诺的家人和FGF家族的5,12,39]。
然而,ERK在脂肪生成和p38MAPK通路的作用仍有争议。兵的情况下,其激活似乎最初的增殖所必需的步骤,但需要关闭,允许适当的途径分化(38]。我们的数据符合这一观点,因为我们只证明了KGF诱发瞬态ERK活化,磷酸化的不再是可检测后24 h (KGF治疗。关于p38MAPK通路,在描述了脂肪细胞的分化对立的角色,但Aouadi等人证明了这条通路在人类脂肪形成的积极作用调节脂肪形成的转录因子(40]。因此,我们的证据p38MAPK激活引起KGF不在与ASC分化作用的生长因子。此外,这个角色是由我们的观察KGF-mediated持续刺激PI3K / Akt和Rb通路,对脂肪形成的分化(被认为是重要的41,42]。特别是,据报道,Akt在脂肪生成过程中发挥作用在两个鼠3 t3-l1 preadipocyte [43]对asc和人类[44]。关于视网膜母细胞瘤蛋白Rb,它在脂肪生成复杂角色。Phosphorylation-dependent失活的Rb许可进展通过有丝分裂克隆扩张,通过释放E2F转录因子家族的成员(19]。然而,Rb也退出细胞周期中的一个重要的角色,以及它与C / EBP的转录因子家族的成员。特别是,Rb已经证明刺激脂肪生成C / EBP的激活α(45]。Rb磷酸化可能重要的早期改变antiadipogenic macrophage-secreted因素3 t3-l1脂肪细胞分化的影响(46]。其他的研究表明,复审委员会作为分子开关确定白色和棕色脂肪生成,表明Rb磷酸化作为一个关键的功能细胞周期监管机构在脂肪细胞谱系的承诺和分化47]。此外,众所周知,p38激活可以调解Rb的磷酸化的增加48]。因此,我们的数据在Rb磷酸化p38MAPK观察到激活的途径是一致的。
我们的方法去评估KGF作用也在考虑评估中性脂质。新创脂生物合成是由固醇调节元件结合蛋白(如),这不仅是一般能够激活细胞内的改变,膜脂肪酸和胆固醇水平也强烈诱导脂肪形成的分化期间,由于胆固醇积累是需要很早就在脂肪生成,在准备甘油三酯合成和脂滴的形成49]。此外,以前作品展示了KGF在脂质代谢的作用,无论是在体外对肺上皮癌细胞线(22和体内大鼠模型50]。同意这些数据和我们最初的假设,我们可以证明KGF-dependent增加中性脂质(胆固醇、胆固醇酯和tryglicerides),暗示的制备步骤启动脂肪形成。此外,我们发现KGF在脂肪生成治疗能够提高细胞分化,决定提高油红O染色的脂质滴,增加成熟的脂肪细胞表达FABP4 KGF-treated细胞中蛋白质和高FABP4 mRNA的表达对未经处理的细胞。不过,我们能够发现在PPAR只略有增加γ表达KGF-treated细胞的分化。自从PPARγupregulation在脂肪生成是一个迟到的事件,我们可以假设,在这一过程的先进措施,外生KGF的影响可能会被部分掩盖的内生KGF upregulation期间出现分化。
众所周知,FGFR2基因受到另一种拼接获得FGFR2-IIIc同种型,通常表达间充质细胞,或FGFR2-IIIb同种型(也称为KGFR),优先在上皮细胞中找到。重要的是,只有研究报告一个KGF对脂肪细胞的影响未能发现FGFR2-IIIb的表达,唯一已知的受体,它支持KGF信号(21),这表明KGF对preadipocytes的影响可能是通过一个未知的受体介导而不是FGFR2-IIIb。这样的假设是也提出的另一项研究表明KGF对来自小血管内皮细胞增殖的影响,不表达FGFR2-IIIb [51]。然而,由于进一步的研究证明FGFR2-IIIb在血管平滑肌细胞的表达52),我们决定评估人类对asc FGFR2-IIIb表达式。我们的数据对asc第一次证明了,尽管他们间充质来源、FGFR2-IIIb转录和蛋白质的表达量较低。然而,开放的问题是确定这样FGFR2-IIIb能够函数即使在一定程度上表达了。这一目标,我们考虑ERK的活化的主要信号通路下游KGF。FGFR2表达的沉默的小干扰RNA没有确定任何变异ERK的磷酸化,从而使我们得出这样的结论:FGFR2-IIIb不负责对asc KGF-mediated信号通路激活。这样的结论是由已知的功效FGFR2-IIIb沉默在KGF对沉默的影响细胞的减少,正如前面证明了我们组(33]。
探索模KGF受体的假说,我们专注于NRP1,因为它是表示作为一个潜在的KGF关联。Coimmunoprecipitation实验让我们证明NRP1能够绑定KGF对asc。此外,除了其作为受体类3 semaphorins NRP1也被认为是一个coreceptor对于某些生长因子,VEGF或PDGF等。大多数数据表明它缺乏定义的信号活动,但最近的黑色素瘤细胞中获得的证据表明,NRP1能够激活VEGF-mediated信号转导途径也独立于VEGFR-2表达式(25]。与这个数据一致,我们的研究结果表明,NRP1是必要的和充分的表达KGF-mediated ERK的活化,p38和Akt通路,从而表明这非经典数理KGF受体分子作为一种以前未被认识的。有趣的是,我们发现一个微分表达式FGFR2, NRP1 KGF及时治疗课程实验(见图1)。特别是,被发现不一致的差别NRP1对这些比FGFR2,和有限的15 - 30分钟KGF治疗。然而,众所周知,配体结合应该不一定诱导受体退化。事实上,也对FGFR2本身,之前已经证明了受体可以有另一种命运取决于配体,因为它是ubiquitinated KGF治疗后和退化但不是FGF10治疗后,可能由于不同的受体的内吞作用的运输规定53]。在未来,这将是有趣的调查NRP1 KGF治疗细胞内的命运。
FGFR2-IIIb的评价和NRP1表达水平在脂肪生成代表这个假说的进一步确认。事实上,我们发现内生KGF对asc水平差异化增加脂肪形成的第一步(天1和2,见图2),但在这个时间点,FGFR2-IIIb表达式仍然是在基础水平,对应于很低的蛋白质(见图6)。一致的NRP1蛋白质对asc在未分化(见图8 (b))及其进一步增加在第一天的脂肪生成(见图10)支持我们的假设,NRP1可能调解FGF7活动期间对asc克隆扩张,而FGFR2-IIIb介导FGF7行动随后(可能与NRP1 coreceptor)。当然,肯定验证这种工作模式,未来的工作将致力于执行稳定击倒FGFR2-IIIb对asc和NRP1受到脂肪形成的分化。
5。结论
我们的研究旨在评估KGF在人类脂肪形成的作用,在增殖和细胞信号激活。我们相信增加的发现KGF表达在脂肪形成的分化可能导致更好的理解人类脂肪形成的分子基础,与潜在影响对asc的治疗应用再生医学,以及引入肥胖和其他疾病的新治疗策略与脂质代谢的改变有关。未来的工作将致力于更好地评估KGF在脂肪生成的作用,通过方法涉及对asc击倒KGF蛋白质表达和后续评价脂肪形成的分化。
此外,发现NRP1的角色,非经典数理KGF受体广泛表达的分子,表明它可能不限于上皮组织的影响。因此,深入调查的具体贡献规范化受体FGFR2-IIIb替代受体NRP1 KGF信号在不同的细胞环境中可能导致更好地了解许多生理和病理过程涉及不同的组织和器官。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
西蒙娜切和克里斯蒂娜•Nodale同样这项工作。
补充材料
补充图S1:免疫印迹分析表达式对asc FGFR2-IIIb和NRP1未经处理或处理KGF 5 ,15 ,30. ,1 h, 2 h, 3 h。可用anti-tubulin抗体作为加载控制。图片是代表至少有三个独立的实验。乐队的强度是由光密度分析评估;从一个代表性的实验值归一化,表示为成倍增加对未经处理的样品(CTRL)和作为一个图表。误差棒表示标准偏差。 和 。(补充材料)