间充质干细胞保护从Compression-Induced髓核细胞凋亡,抑制线粒体途径

文摘

客观的。髓核细胞的过度凋亡(npc)引起的各种压力,包括压缩,导致椎间盘变性(类)的发展。间充质干细胞(msc)可以受益npc的再生和延迟类,但潜在的分子机制了解甚少。本研究旨在评估antiapoptosis骨骨髓来源MSC (BMSC)对大鼠的影响npc暴露在压缩和线粒体通路是否参与调查。方法。bmsc和npc cocultured压缩器在1.0 MPa 36 h。细胞活力、细胞凋亡、线粒体功能,apoptosis-related蛋白质的表达进行了评估。结果。结果表明,coculturing bmsc增加细胞活力和npc细胞凋亡减少暴露于压缩。同时,bmsc可以缓解compression-induced线粒体损伤的npc通过减少活性氧水平和维持线粒体膜电位以及线粒体的完整性。此外,coculturing bmsc镇压caspase-3激活,激活caspase-9,降低胞质细胞色素的表达式c和伯灵顿,bcl - 2的表达增加。结论。我们的研究结果表明,bmsc可以防止compression-induced npc通过抑制神经细胞凋亡的线粒体途径,从而增进我们的了解MSC-based治疗类。

1。介绍

椎间盘变性(类)的主要原因是下腰痛(LBP)患病率高,导致残疾和全球造成了沉重的经济负担1- - - - - -3]。椎间盘(试管)是由三部分组成:髓核(NP),环纤维(AF)、软骨终板。中央坐落NP包括NP细胞(npc)和细胞外基质(ECM)和外AF主要由胶原纤维。证据表明,试管逐步退化与NPC的数量损失,减少ECM和I型胶原合成增加4]。最近,许多体外和体内的研究表明,过度凋亡npc引起的各种压力,包括压缩、缺氧或活性氧(ROS)在类的发展中扮演着重要的角色5- - - - - -7]。

试管的功能作为一个减震器,脊椎和外部力量导致强烈的强调,在试管法。从机械的角度,椎间盘细胞嵌入在不同领域面临大范围的机械载荷(8,9]。不当或过度压缩力刺激作用于椎间盘(试管)是一个重要的因素在导致椎间盘变性。先前的研究已经表明,过度负荷影响ECM的合成,促进炎性因子的分泌在npc (10,11]。我们报道,细胞凋亡可能是由压缩级1 MPa通过线粒体或兔子的内在途径npc之前(12]。然而,很少有研究研究如何扭转npc诱导的细胞凋亡的压缩,从而修复类。

间充质干细胞(MSC),尤其是骨骨髓来源基于MSC - (BMSC)的治疗,在类常用的修复和显示激动人心的观点(13,14]。大量的研究探讨msc之间的交互和npc在不同条件下。据报道,coculture MSC和npc促进MSC分化向NP细胞表型(15,16),促进了ECM的合成在退化npc (15,17]。然而,有限的研究展示了antiapoptosis msc对npc的影响在压缩条件下和特定的机制。因此,本研究旨在评估antiapoptosis bmsc对老鼠的影响下npc压缩和线粒体通路是否参与调查。

2。方法

2.1。bmsc与npc文化

实验程序批准的机构动物保健和使用委员会华中科技大学同济医学院的科学和技术。npc被隔绝Sprague-Dawley老鼠(男,3个月和250 - 300 g)如前所述[18]。获得的细胞悬浮培养在杜尔贝科的修改鹰的中/火腿的F-12(美国Gibco DMEM / F-12)含10%胎牛血清(美国Gibco的边后卫)补充1% penicillin-streptomycin(σ)37°C公司为5%₂。媒体改变了每两天,主要文化是1:2亚文化当细胞达到80%的融合。第二代NP细胞被用于这项研究。

我们使用相同的大鼠隔离并同时获得骨髓msc,如前所述[19]。msc被维护在DMEM / F-12(美国Gibco)包含10%的边后卫(美国Gibco)补充1% penicillin-streptomycin(σ)37°C公司为5%₂。npc和bmsc来自同一来源在每个coculture系统。

2.2。间接Cocultures和压缩装置的应用

间接cocultures 6-well板块与0.4中进行μ孔隙大小transwell插入。通道2 npc和通道3 bmsc。伴着被播种到transwell插入,而npc镀到众议院。细胞被播种在50的比例:50 (10×10⁴每)。Cocultured细胞保持在10% DMEM / F-12 37°C公司为5%₂。

确定antiapoptosis bmsc对npc的影响暴露于静态压缩,cocultured细胞培养在一个定制的压缩装置(如前所述)(12,18]。coculture系统受到1 MPa压缩荷载(CL) 36 h。实验的组织如下:(i)人大单独控制;(2)人大+ BMSC;(3)人大+ BMSC +氯;及(iv)人大+ CL。

2.3。细胞生存能力测量

细胞生存能力是衡量CCK-8 (Dojindo、日本)和修改。CCK-8工作溶液是由混合CCK-8溶液和10% DMEM / F-12介质1:9 (v/v)。文化不同的治疗后,插入以及原始培养基被移除和2毫升CCK-8工作解决方案是补充道。板块在37°C和5%孵化有限公司₂2 h。然后,100年μL反应溶液被转移到一个96孔板。幸存的细胞计数测定吸光度检测在450 nm分光光度计(美国BioTek)。

2.4。通过流式细胞仪检测细胞凋亡

细胞凋亡率被膜联蛋白V-FITC /π凋亡检测工具(凯基生物生物技术,中国)。总之,收集细胞,并在500年用PBS然后resuspended洗净μL绑定缓冲。5μL膜联蛋白V-FITCπ被添加和标本孵化在黑暗中在室温下15分钟。标记细胞通过流式细胞仪检测(BD LSR II,正欲),和数据分析FACSDiva软件(美国,正欲)。

2.5。观察细胞形态

与压应力处理后,细胞被倒置显微镜观察(奥林巴斯、日本)。进一步观察凋亡特性,赫斯特33258染色。收集到的细胞用PBS洗净,然后沾赫斯特33258年(美国σ)15分钟在黑暗中根据制造商的指示。此后,形态学变化的npc倒置荧光显微镜下观察和成像(奥林巴斯、日本)。

2.6。TUNEL染色

更敏感TUNEL染色法被用来评估细胞凋亡。在4%多聚甲醛固定后1小时在室温下,这些细胞被permeabilized tritonx 0.1% - 100 10分钟。与PBS洗后,这些细胞被孵化与TUNEL染色(罗氏公司、德国)1 h在37°C在黑暗中,根据制造商的协议。凋亡改变倒置荧光显微镜下观察(奥林巴斯、日本)。

2.7。ROS测量

细胞内ROS水平衡量,7-dichlorofluorescin二乙酸(DCFH-DA;Beyotime,中国)。的ROS, DCFH-DA氧化成荧光二氯荧光素(DCF)。治疗后,收集细胞resuspended DCFH-DA和孵化在黑暗中30分钟37°C。DCF的平均荧光强度(MFI)是通过流式细胞术来衡量的。

2.8。线粒体膜电位(MMP)测定

MMP是衡量JC-1 (Beyotime中国)根据制造商的指示。总之,收获npc resuspended混合物中含有500μL DMEM / F-12和500年的10%μL JC-1染色液。在黑暗中孵化后30分钟37°C,冰冷的染色的细胞被洗缓冲区(1 x)和500年resuspendedμL染色缓冲区(1 x)。MMP染色的值表示为红色/绿色荧光强度的比率通过流式细胞仪测定。

2.9。透射电子显微镜(TEM)

TEM进行如前所述[18]。短暂,收获细胞被洗PBS和去离子水分别,然后通过离心分离颗粒状。细胞以2.5%的戊二醛2 h,在1%的四氧化锇2 h后缀。然后细胞在乙醇和渗透脱水和嵌入在环氧树脂812。超薄部分与醋酸双氧铀染色和柠檬酸铅和检查Tecnai G²范12 TEM(公司、荷兰)。

2.10。免疫印迹分析

npc细胞溶解在冰使用标准缓冲(Beyotime,中国)。总蛋白提取的蛋白分离设备(Beyotime,中国)和细胞线粒体隔离设备(Beyotime,中国)被用来提取线粒体血浆蛋白胞质细胞色素c检测。细胞溶解产物在12000×g离心10分钟在4°C。蛋白质转移后,膜被封锁的脱脂牛奶,然后孵化一夜之间在4°C老鼠多克隆抗体对裂解caspase-3 (Abcam, 1: 500),伯灵顿(Abcam, 1: 1000)、bcl - 2 (Abcam, 1: 1000)、裂解caspase-9 (Abcam, 1: 1000),细胞色素c(Abcam,1: 1000)β肌动蛋白(Abcam 1: 3000)。几次洗涤后,膜与二次孵化抗体在室温下1 h。最后,通过增强化学发光免疫反应性的膜是可视化(ECL)方法后,制造商的指令(美国Amersham生物科学)。

2.11。统计分析

所有测量数据进行至少三次。数据被表示为平均值±标准偏差(SD)。学生的t测试被用于双官能团的分析参数。单向方差分析(方差分析)测试中使用的比较多组数据,其次是图基的事后考验。 被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。npc Coculturing bmsc增加了细胞的可行性

确定的影响bmsc compression-treated npc的可行性,CCK-8试验进行。如图1(一),压缩时间的方式抑制npc的可行性从0到48 h(图1(一), )。npc被分成coculture和对照组。为npc cocultured bmsc压缩应力下,伴着显著增加的可行性相比npc细胞暴露于压缩。从时间点36 h,每组的价值低于0.001(图1 (b))。因此,时间点36 h用于以下实验。

3.2。保护作用的bmsc Compression-Induced npc细胞凋亡

压缩治疗36 h, npc展出萎缩或丝状的形态,几乎脱离板块(图2(一个))。此外,赫斯特33258年染色显示明亮彩色凝结核,和TUNEL-positive细胞的数量增加(数据2 (b)和2 (c))。正如所料,bmsc可以明显减弱的形态学变化的细胞凋亡(图的说明2)。流式细胞术证明细胞凋亡率的npc治疗36 h压缩是明显高于控制( )。然而,coculturing bmsc部分阻止这个compression-induced凋亡(数字2 (d)和2 (e), )。有趣的是,与bmsc coculturing主要减少凋亡细胞的比例在早期阶段(图2 (e), )。和对照组没有显著区别cocultures不是受到压缩。

3.3。bmsc抑制Compression-Induced ROS生产

过多的活性氧可能损害线粒体功能和增加npc的细胞凋亡率。所示的荧光图像,压缩治疗增加了荧光强度,这表明活性氧的生产。相反,与bmsc coculturing减少了DCF压缩引起的荧光(图3(一个))。与荧光结果一致,流式细胞仪分析表明,npc细胞内ROS水平生产处理压缩比未经处理的对照组显著增加( ),而与bmsc coculturing抑制ROS compression-induced增产(数据3 (b)和3 (c), )。

3.4。bmsc抑制MMP Compression-Induced减少(Δψ_米)

MMP的分析应用于评估线粒体功能。在对照组,npc沾JC-1表现出强烈的红色荧光绿色荧光较弱。但相反,npc的绿色荧光受到压缩变得更强,而红色荧光较弱。Coculturing bmsc可以部分逆转的有害变化,减少Δ的损失ψ_米(图4 (c))。流仪分析表明,npc接触压缩表现出显著的减少Δψ_米相对于控件( ),这表明了红/绿荧光比率的下降。然而,coculturing bmsc显著增加红/绿荧光比率和维护Δψ_米compression-treated npc(数据4(一)和4 (b), )。

3.5。通过TEM观察线粒体超微结构的npc

为了直观地观察线粒体超微结构的npc压缩处理,应用TEM评估线粒体完整性和状态。在对照组,定义良好的嵴线粒体超微结构正常。但在compression-treated npc,瓦解观察线粒体嵴和肿胀,这说明线粒体受损。毫不奇怪,coculturing bmsc表现出显著改善线粒体的超微结构崩溃。这些结果表明coculturing bmsc可以改善线粒体的npc接触压缩(图5)。

3.6。用bmsc块Coculturing Compression-Induced线粒体通路的激活

mitochondria-mediating蛋白的表达(裂解caspase-3和9,细胞色素c伯灵顿,bcl - 2)是由西方墨点法。如图6、压缩处理导致增加裂解caspase-3和9,胞质细胞色素c,伯灵顿和bcl - 2相比,对照组下降。然而,coculturing bmsc部分逆转蛋白质水平的变化( )。这些结果表明,bmsc可以防止npc compression-induced抑制细胞凋亡的线粒体或内在途径。

4所示。讨论

目前,有有限的持久和有效的治疗类治疗。近年来,许多研究已经证明,msc、特别是BMSC-based疗法,是有前途的试管修复(20.- - - - - -22]。在一个盘体内细胞疗法的短期随访,Omlor et al。23)建议bmsc可以保持代谢活动在猪nucleotomy模型后3天。和其他不同的退行性椎间盘模型,据报道,BMSC移植可以改善ECM合成和椎间盘高度(24- - - - - -26]。这些结果提供了一些迹象表明bmsc能够适应退行性微环境和启动保护功能或合成代谢反应,因此,再生阀瓣。除了bmsc,其他种类的msc,如脂肪msc (27]和脐cord-derived msc [28),也可以推迟类。

虽然msc显示类鼓励再生效果,但机制尚不清楚。很多研究表明,再生效果是通过msc之间的交互和npc在不同条件下29日]。一方面,coculturing msc和npc促进msc分化和迁移(15,16,30.]。另一方面,msc增加合成代谢和分解代谢减少npc和诱导抗炎效应(15,17,31日- - - - - -33]。然而,很少有报道讨论MSC在NP细胞死亡的影响,如细胞凋亡。

在目前的研究中,建立了间接coculture系统暴露于压缩探索antiapoptosis BMSC对npc的影响在压缩条件下和底层机制。在先前的研究中,我们表明,过度压缩会诱发NPC细胞凋亡,导致类(12,18]。这项研究的结果是一致的,更重要的是,我们发现bmsc可以防止compression-induced凋亡,由流仪显示分析和形态学观察。

有两种细胞凋亡的信号通路,线粒体(内在)和外在途径。线粒体通路已被证实参与各种压力诱导细胞凋亡的npc在我们之前的研究和其他研究4,5,12]。因此,我们认为,线粒体通路参与了antiapoptosis bmsc对compression-treated npc的影响。

ROS主要形成线粒体和发挥重要作用的细胞信号和体内平衡在正常生理水平。但各种各样的压力,如压缩,可以增强活性氧的生产(12]。过多的活性氧会损害线粒体功能和激活线粒体凋亡途径,表现为降低MMP和释放细胞色素c然后导致细胞凋亡(34]。我们的数据表明,压缩治疗可以显著提高ROS水平和降低MMP和coculturing bmsc部分逆转的变化。的保护作用也证实了TEM,直观地展示在不同组织线粒体超微结构的变化。这些结果表明,bmsc可以防止compression-induced线粒体损伤,和线粒体通路可能涉及antiapoptosis效果。

在分子水平上进一步验证我们的假设,我们测量caspase-3和9的表达,胞质细胞色素c伯灵顿,bcl - 2。伯灵顿proapoptotic蛋白质,而bcl - 2是一种凋亡蛋白。他们都是两个经典的生物标记线粒体通路和属于bcl - 2家族蛋白(35- - - - - -37]。王在nondegenerative人体腰椎椎间盘,et al。38)报道,有一个高bcl - 2的表达和伯灵顿的低表达。相反,在退行性试管,bcl - 2表达和伯灵顿的增加而减少。和伯灵顿/ bcl - 2复杂的分离导致了细胞色素的释放c。细胞色素c以及Apaf-1和caspase-9,形成multiprotein apoptosome,最终产生裂解caspase-9和3和导致细胞凋亡39]。事实上,增加裂解caspase-3和9,upregulation胞质细胞色素c的差别和伯灵顿,对这些基因bcl - 2检测压缩的npc治疗与对照组相比,这是符合我们之前的研究(12]。更重要的是,这种效应被与bmsc coculturing明显减弱。很明显,我们的研究结果证实了compression-induced NPC细胞凋亡是通过线粒体凋亡通路介导(补充图1),线粒体凋亡通路参与了antiapoptosis bmsc的效果。

当然,也有一些研究的局限性。首先,antiapoptosis bmsc对npc的影响进行体外和基于鼠细胞。因此,进一步的研究与人类细胞和动物实验需要进行。其次,在目前的研究结果表明,压缩加载可以通过线粒体凋亡通路诱导NPC细胞凋亡。然而,npc如何感觉到压缩加载和转换凋亡信号仍不清楚。据报道,跨膜钙离子通道受体酪氨酸激酶,整合蛋白主要mechanosensors [8]。因此,还需要进一步的研究来确定mechanosensors(补充图1)。最后,尽管在目前的研究结果表明,bmsc可以防止compression-induced npc通过抑制神经细胞凋亡的线粒体途径,antiapoptosis作用的确切机制并不完全理解。使用0.4μ米孔隙大小transwell插入确保只有分泌因素很容易通过。它表明,伴着抑制细胞凋亡的npc,至少部分通过旁分泌机制。据报道,一些介质(包括生长因子、细胞因子、趋化因子、抗炎因子,和液)扮演了一个至关重要的角色,在msc和试管细胞之间的交互40- - - - - -43]。具体什么分泌因素中起着重要作用antiapoptosis效应还有待探索(补充图1)。

总之,我们的研究结果证明了antiapoptosis BMSC对npc的影响受到压缩体外。此外,我们的数据表明,线粒体凋亡通路参与了antiapoptosis效果。这些结果的研究澄清底层antiapoptosis效应的分子机制,增强对msc的再生效果的理解。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Zengwu邵设计实验和写的手稿。盛,Lei赵,Deyao Shi,东华黄和吴Fashuai进行实验。盛陈和象屿邓分析了实验数据。挂梁修订后的手稿。所有作者回顾了手稿。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(批准号81572203和81572203)和中国国家重点研究和发展计划(批准号2016 yfc1100100)。

补充材料

原理图的机制和信号通路的antiapoptosis bmsc对npc的影响下压缩。压缩载荷增强活性氧的生产,线粒体膜电位降低,抑制bcl - 2的表达,伯灵顿的表达增加。和伯灵顿/ bcl - 2复杂的分离导致了细胞色素的释放c。细胞色素c,连同Apaf-1 caspase-9,形成multiprotein apoptosome,最终产生裂解caspase-9和3,导致细胞凋亡。这些影响被与bmsc coculturing明显减弱。分泌的npc和旁分泌因子的潜在mechanosensors bmsc仍有待探讨。(补充材料)

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