文摘

自发的胞质钙瞬变和振荡已报告在各种组织的非人类和人类的起源而不是在人类midbrain-derived干细胞。使用共焦microfluorimetry,我们研究自发钙瞬变和calcium-regulating机制在人类腹侧中脑的干细胞系经历增殖和神经元分化。自发钙瞬变被发现在一个大的增殖(> 50%)和微分(> 55%)的细胞。我们提供的证据存在的细胞内钙商店应对毒蕈碱的激活的细胞,具有灵敏度和阿诺定thapsigargin可能反映出IP₃受体活性和阿诺定受体的存在和钙腺苷三磷酸酶泵。观察到的钙瞬变活动潜在的支持/钙转运体的存在和存在的钙流入引起的损耗的钙商店。我们得出这样的结论:这些细胞发展最重要的机制管理胞质钙稳态。这是第一次自发钙瞬变的比较报告在人类midbrain-derived干细胞增殖和分化提供了证据的机制可能涉及。我们认为观察到的自发钙瞬变可能导致机制参与细胞增殖、表型分化,和一般细胞成熟。

1。介绍

钙是一个多才多艺的胞内信使控制广泛的细胞过程(1- - - - - -3包括细胞增殖,细胞分化,和一般的基因转录4- - - - - -7]。钙信号被认为是参与受精的大多数物种8- - - - - -11)以及在随后的胚胎发育(12- - - - - -18]。

自发钙瞬变和振荡已报告在许多非人类起源的组织19]。最近,自发钙振荡曾被观察到在产后早期小脑浦肯野神经元(20.),胚胎小鼠皮层脑片(21),小鼠脊髓神经元(22),切片的文化从小鼠胚胎脊髓和背根神经节准备(23),未分化的细胞和神经祖细胞来源于小鼠骨髓(24]。也有报道自发钙振荡在人类间充质干细胞(25- - - - - -27),人类胚胎干细胞的神经元(28),和人类心脏祖细胞(29日]。看来钙供应细胞溶质被IP来自细胞内钙的商店₃端依赖通过门店渠道发布和钙流入。去除钙依赖于质膜钙泵活性和Na⁺ca^{2 +}交换(25- - - - - -27]。

据报道,在干细胞调节自发钙振荡的机制可能会改变在他们从增殖,分化和成熟27,30.- - - - - -33]。但是,没有报告描述钙调控的变化尤其是人类midbrain-derived干细胞在发展神经元。

目前调查最初是为了执行研究自发钙信号在人类midbrain-derived接受神经干细胞分化(34- - - - - -37]。因为我们观察到自发钙瞬变的很大一部分分化细胞,这是进一步探索感兴趣的calcium-regulating机制通过对比机制的发展分化细胞在增殖细胞与机制操作。

使用共焦成像技术,我们在这里提供的证据存在的细胞内钙商店应对毒蕈碱的激活,对利阿诺定有敏感,thapsigargin可能反映出IP₃受体活性和阿诺定受体的存在和钙腺苷三磷酸酶泵。观察到的钙瞬变活动可能支持/钙转运体的存在和存在的钙流入引起的损耗的钙商店。

我们得出这样的结论:相同calcium-regulating机制运作在人类midbrain-derived干细胞的增殖和神经元分化。

2。材料和方法

2.1。道德声明

人体组织后被捐赠给研究提供了寻求堕胎的妇女的书面知情同意。组织采购符合赫尔辛基宣言和执行协议的网络伦理指南的欧洲中枢神经系统移植和修复(花蜜)。批准使用这些组织研究隆德大学医院伦理委员会和他们的使用符合西班牙法律35/1988辅助生殖。伦理语句关于人类胎儿起源的细胞可以用于目前的研究发现在原始报告描述细胞系(37]。

2.2。人类Midbrain-Derived干细胞的培养使

细胞分离、基因改造、和一般特征描述(其他地方34- - - - - -37]。腹侧中脑的短暂,细胞被孤立的人类胎儿10周大。不朽是由感染v-myc逆转录病毒载体编码。衍生品产生的细胞系(hVM1细胞)被用于稳定的Bcl-X逆转录病毒超表达_l,基本上被Liste et al。(38]。感染后,细胞被选中GFP-based fluorescent-activated细胞排序,导致细胞行hVMbcl-x_l(34- - - - - -36在目前的研究中使用。

细胞通过20人镀上poly-L-lysine(锁相环;Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)涂T75培养瓶血压得到较好的控制包含15毫升HNSC100培养基(DMEM / F12 Glutamax (Gibco,罗克维尔市,医学博士,美国),0.6% (w/v)D葡萄糖(Sigma-Aldrich), 0.5% (v/v)1 M玫瑰(Gibco), 0.5% (w/v)AlbuMAX-I (Gibco), 1% (v/v)氮气补充(Gibco), 1% (v/vNEAA (Sigma-Aldrich), 1%笔/喉炎的症状(Gibco))补充20 ng / ml重组人表皮生长因子(EGF、研发系统)和20 ng / ml重组人类基本的纤维母细胞生长因子(bFGF、研发系统)。细胞被传播在36°C控制大气中5%的有限公司₂和95%的湿润空气。媒介是改变每隔两天,细胞通过融合80%。使,贴壁细胞用磷酸盐缓冲盐水洗净(PBS)没有钙和镁,在分离之前trypsin-EDTA (Gibco)稀释1:10在PBS 3 - 5分钟36°C。使胰蛋白酶化细胞resuspended,离心机在4°C(130 5分钟),镀新烧瓶。

2.3。神经元分化的协议

干细胞分化成神经元(> 90%)使用CK4协议(34,35]。总之,细胞被镀在PLL-coated 24-well文化托盘(Nunc) 5000个细胞的密度/厘米²HNSC100介质与连续的50 ng / ml重组纤维母细胞生长因子8(研发系统),25岁μM forskolin (Sigma-Aldrich), 5 ng / ml胶质细胞重组line-derived神经营养因子(WI Promega,麦迪逊,美国),和25 ng / ml重组声波刺猬(研发系统)。细胞荧光染色是生长在14 mm PLL-coated玻璃盖玻片。细胞分化为10天36°C控制大气中5%的有限公司₂和95%的湿润空气,一半的介质是改变每隔两天。

2.4。细胞固定和免疫细胞化学

细胞被固定在4%多聚甲醛在0.15 M PBS, pH值7.4 20分钟,然后冲洗3×15分钟在0.05三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐(TBS, pH值7.4)/ 0.1% Triton x - 100 (Sigma-Aldrich)。文化在TBS然后preincubated 30分钟/ 10%驴(微孔)或羊血清(Sigma-Aldrich)在孵化前的以下主要抗体在TBS / 10%驴或羊血清24 h在4°C: beta-tubulin III (β浴缸三世,单克隆鼠标;Sigma-Aldrich) 1: 2000;酪氨酸羟化酶(TH,多克隆兔子;Chemicon) 1: 1200;γ酸氨基丁酸(GABA,多克隆anti-rabbit;Sigma-Aldrich) 1: 500;microtubule-associated蛋白质2 ab (Map2单克隆anti-mouse;Sigma-Aldrich) 1: 2000;胶质原纤维酸性蛋白(GFAP、多克隆anti-rabbit;美国DAKO Carpenteria, CA) 1: 5000;doublecortin(克莱斯勒、多克隆几内亚anti-pig;Chemicon) 1: 400;人类细胞核(HN单克隆anti-mouse;Chemicon) 1: 500; nestin (anti-human; AbD Serotec) 1 : 2000; and Ki67 (polyclonal anti-rabbit; Neomarkers Inc.) 1 : 500. Control stainings were performed by excluding primary antibodies or using IgG rabbit (DAKO) 1 : 20,000 and IgG₁鼠标(DAKO) 1: 200。

文化在TBS冲洗3×15分钟/ 0.1% triton - x - 100,然后孵化1 h后的生物素化的二次抗体在TBS / 10%驴或羊血清:anti-guinea猪搞笑(杰克逊ImmunoReseach) 1: 200年,anti-rabbit搞笑1:200或anti-mouse Ig 1: 200 (Amersham)。细胞被冲洗3×15分钟在TBS / 0.1% Triton x - 100和60分钟孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭链霉亲和素(DAKO)稀释1:200年TBS / 10%驴或羊血清。文化被冲洗3×15分钟前在TBS可视化为3.33.3 -diaminobenzidine(50毫克-diaminobenzidine (Sigma-Aldrich)和33μl H₂O₂每100毫升TBS 5 - 10分钟)。在TBS冲洗15分钟后,一度在蒸馏水中,文化在Aquatex盖玻片(VWR)。

免疫荧光染色的增殖细胞培养也执行。总之,文化在TBS冲洗3×15分钟/ 0.1% Triton x - 100然后在TBS preincubated 30分钟/ 5%山羊血清(Chemicon),然后孵化24 h在4°C以下主要抗体稀释TBS / 5%山羊血清:HN(单克隆anti-mouse;Chemicon) 1: 500;巢蛋白(多克隆anti-rabbit;Abcam) 1: 1000;和β浴缸III(单克隆anti-mouse;Sigma-Aldrich) 1: 2000;Ki67(多克隆anti-rabbit;Neomarkers Inc .) 1: 500。随后,细胞被洗了3×15分钟在TBS / 0.1% Triton x - 100和孵化Alexa面粉®555 -共轭老鼠免疫球蛋白和Alexa®488 anti-rabbit免疫球蛋白两个小时。盘子洗2×15分钟在TBS TBS添加4和1×15分钟6-diamidino-2-phenylindole (DAPI;Sigma-Aldrich)一般的细胞核染色。短暂在蒸馏水洗后,细胞在盖玻片和延长安装黄金(分子探针,宏伟的岛,纽约,美国)到玻片上。共焦图像被使用FluoView FV1000MPE多光子激光扫描显微镜(奥林巴斯,汉堡,德国)。

2.5。测量细胞内钙

层的干细胞数量为2天或分化为10天PLL-coated玻璃盖玻片上装有5μM Fura-2 / AM (acetoxymethyl Fura-2酯;分子探针)或Fluo-4-AM(见下文)30分钟在黑暗中在室温下。细胞外的染料被反复删除样本的稀释Krebs-Ringer解决方案。然后,细胞在缓冲盐溶液适合孵化实验,也就是说,含有不同浓度的钙或钙免费有或没有EGTA补充道。对于一些实验,增加2μM thapsigargin(分子探针)calcium-free加载解决方案是为了消耗细胞内钙商店使用。

细胞内钙的^{2 +}集中监控使用共焦显微镜(倒置荧光显微镜数字化;蔡司Axiovert 35)和Ca^{2 +}影像系统(直到光子学GmbH)。Fura-2很兴奋在360 nm和380 nm。排放测量在510 nm长通滤波器。图像采集的帧率0.33赫兹。TILLVision软件(直到光子学GmbH)是用于生成率图像和分析单个细胞荧光强度利用感兴趣的区域(ROI)。细胞内钙([Ca^{2 +}]_我)表示为一个比激发引起的荧光发射在360 nm和380 nm(激发比360/380 (F_360年/ F_380年))。图像系统的性能测试由外部校准使用校准设备(分子探针)(免费的Ca^{2 +}浓度从0μ米到39μ米)。平均isosbestic点是363海里,我们发现几乎(Ca之间的线性关系^{2 +})和荧光强度(激发比360/380)从17海里1.35μM (Ca^{2 +}]。Fura-2-loaded细胞被用来可视化在分化干细胞自发瞬变。细胞内钙使用Fluo-4-loaded细胞在增殖干细胞是测量。荧光测量进行使用FluoView FV1000MPE多光子激光扫描显微镜(奥林巴斯)。在488 nm Fluo-4很兴奋。排放测量在510 nm长通滤波器。图像采集的速度0.45赫兹。

2.6。化学物质

Fura-2-AM、Fluo-4-AM thapsigargin,阿诺定校准套件提供的分子探针。所有其他化学物质都从Sigma-Aldrich购买和默克。

Krebs-Ringer解决方案(毫米):氯化钠,139;氯化钾、5;MgCl₂1.2;CaCl₂,2;葡萄糖,10;消息灵通的,10的pH值被氢氧化钠调整到7.4。N-methyl-D-glucosamine (NMDG)取代钠钠的解决方案。

2.7。数据分析和统计

数据报告为均值和SEM。学生的t以及用于统计比较未配对组。一个值低于0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。一般采用描述干细胞增殖和分化的衍生品

研究人类神经元自发钙瞬变,我们使用一个良好的人类腹侧中脑的干细胞线(34,35,37]_。之前分析的钙瞬变,细胞分化为10天在体外根据我们的神经分化协议(CK4协议)的纤维母细胞生长因子8 (50 ng / ml), forskolin (25μ米),神经胶质细胞line-derived神经营养因子(5 ng / ml),和声波刺猬(25 ng / ml)添加的顺序(34,35]。

首次一般细胞学鉴定和质量控制,细胞要么是传播的表皮生长因子(EGF, 20 ng / ml)和碱性纤维母细胞生长因子(bFGF, 20 ng / ml)为4天或分化为十天如上所述。细胞分裂细胞,然后应用标记神经祖细胞,新生成的神经元,成熟的神经元,astroglial细胞,和特定的神经元亚型(图1)。

探讨增殖能力在传播文化中,细胞Ki67的应用。传播的第四天,几乎所有细胞在细胞分裂的不同阶段(图1(一)),他们中间丝巢蛋白表达(图1(b)),这是一个通用的标志神经前体细胞。在传播文化中,只有少数细胞开始分化成神经元如图所示的很少β微管蛋白3 (β浴缸III)阳性细胞,新生成的神经元(图的标记1(c))。

在10天大的区分文化中,一些细胞被发现表达doublecortin(克莱斯勒)(图1(d)) microtubule-associated蛋白质表达神经元迁移和发展完全分化的细胞中表达下调。众多β浴缸III-positive神经元(图1(e))和microtubule-associated蛋白2 (MAP2)积极成熟的神经元被发现在所有区分文化(图1(f))。相比之下,只有少数细胞染色阳性astroglial标志物胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)(图1(g))。标记的细胞也应用更具体的神经元亚型。许多细胞表达酪氨酸羟化酶(TH),发现含有儿茶酚胺的神经元的标记(图1(我)),而只有少数细胞表达了GABA ergic神经元的标记(GABA)(图1(h))。

综上所述,所有的干细胞文化是可行的并显示一个健康的外表,分化后,他们高度丰富的神经细胞(>细胞总数的90%)。

3.2。区分Midbrain-Derived干细胞

3.2.1之上。钙供应自发分化神经元的胞质钙瞬变

自发钙瞬变被观察到在分化细胞(数字的51%2(一个),2 (b),2 (d);补充图 ,视频在网上https://doi.org/10.1155/2017/9605432)。清除细胞外钙以及损耗显著降低细胞内钙的店铺分数与自发钙瞬变的细胞( )。损耗的细胞内钙的商店是由接触细胞2μM thapsigargin calcium-free介质的实验之前30分钟。细胞自发钙瞬变的比例也显著减少了添加2μM thapsigargin细胞即使在细胞外钙的存在( )。相比之下,培养的细胞在10μM阿诺定利阿诺定受体结合的内质网(39,40),显著增加( )细胞钙瞬变的分数。没有钙瞬变store-depleted细胞当孵化calcium-free介质(三个独立控制实验中,不显示)。

钙瞬变的数量在20分钟孵化在每个分化细胞(图计算2 (c))。钙瞬态被定义为的峰值0.05荧光单元或多个基线。我们观察到3.38(平均值)瞬态部分的细胞显示自发钙瞬变和完整的钙商店,当细胞在对含钙中孵化。瞬变每个细胞的数量明显减少,如果细胞被孵化calcium-free介质(1.88瞬变细胞)以及如果细胞钙商店被耗尽的预培养的细胞和2μM thapsigargin,即使期间钙在场潜伏期(1.98瞬变细胞)( )。当2μM thapsigargin被加入到细胞,即使在细胞外钙的存在,每个细胞的瞬变数量也减少(2.43瞬变细胞)( )。然而,通过孵化的细胞与10μM阿诺定,瞬变的数量每个细胞(3.04瞬变)类似于细胞观察值与完整对含钙中钙商店当孵化。

3.2.2。区分神经元胞质钙瞬变的模式

而自发瞬变(图的外观2(一个))变化在频率和峰值大小与完整的钙商店和细胞暴露在细胞外钙,只有少数窄峰值出现细胞外钙时经常省略。小的外观,而且广泛的山峰是钙损耗的结果。休息的胞质钙水平之间的峰值在这些细胞并没有改变。相比之下,基线钙thapsigargin-treated细胞随时间逐渐下降,在ryanodine-treated细胞逐渐增加。瞬变倾向于出现在观察期结束thapsigargin-treated细胞。在ryanodine-treated细胞,有许多不同大小的瞬变。

3.2.3。Thapsigargin效应在区分神经元胞质钙和钙除了对Thapsigargin-Primed细胞的影响

暴露的分化细胞2μM thapsigargin诱导的胞质钙瞬态增加所有的细胞(图5独立评估实验3(一个))。的细胞被孵化calcium-free Krebs-Ringer解决方案包含10μM EGTA确保没有细胞外钙会导致胞质钙的变化。

最初的比率平均值为0.69,增加到最大平均值0.77添加thapsigargin后1 - 2分钟。然后,它逐渐下降到稳态水平的平均值为0.65在接下来的5 - 6分钟。

图3 (b)显示了神经元细胞外钙对thapsigargin-primed差异化的影响。有逐渐减少的比率是0.67是0.63在最初的孵化与thapsigargin分化细胞的细胞外钙的缺乏。当细胞与thapsigargin孵化,添加钙造成立即增加的比率是0.73在2分钟之内。增加钙是不变或适度升高在孵化的最后8分钟(图3 (b))。

3.2.4。Calcium-Induced区分神经元胞质钙的增加没有孵化或钠的存在

分化细胞是染料在对含钙溶液加载。细胞外的染料是被反复清洗的细胞。他们培养10分钟calcium-free中没有或钠(图的存在4(一))。添加钙造成时间、持续增加的胞质钙在细胞培养在含钠的解决方案。相比之下,后一个初始钙增加,细胞的胞质钙离子浓度似乎平整孵化的钠。

AUC(曲线下的面积)的荧光强度的时间变化(激发比360海里/ 380海里)在钙明显更大的刺激(12分钟)当钠从孵化解决方案(图中被省略了4 (b))( )。细胞与胞质钙增加的分数计算在每一个实验(图4 (c))。增加钙的反应增加钙在86%和70%的细胞没有(A)或(B)存在钠,分别为( )。相比之下,自发钙增加细胞溶质不会受到钠(C, D)。然而,遗漏的钠极大地促进了胞质钙离子浓度表示为AUC在自发增加胞质钙(列C图4 (d))相比,自发钙瞬变的细胞培养在含有钠Krebs-Ringer解决方案( )(列在图4 (d))。

3.2.5。氯化氨甲酰胆碱对神经元分化的影响

表达的基因编码的胆碱能毒蕈碱的受体(CHRM_{1 - 5})确认使用基因表达微阵列(数据没有显示)。

氯化氨甲酰胆碱是一种稳定的毒蕈碱的受体激动剂用于研究的反应区分干细胞毒蕈碱的乙酰胆碱受体激活(41]。几乎有一个日志量之间的线性关系碳酰胆碱和细胞钙瞬变的一部分在每个实验(补充图),细胞暴露于碳酰胆碱,持续15分钟。遗漏的细胞外钙在细胞反应没有影响。然而,响应被pirenzepin抑制(10μ毒蕈碱的M M)₁受体拮抗剂(40]。为了量化细胞内钙的增加,我们计算AUC利用GraphPad棱镜4软件。计算的基线被使用原产地7.5估计。表达的AUC是任意单位每15分钟荧光强度。补充图B显示了碳酰胆碱的作用的剂量反应曲线的平均值AUC每个细胞的活跃的细胞。10μ米和100μAUC M碳酰胆碱引起的大量增加,抵消了10μM pirenzepine。在calcium-free解决方案中,几乎没有碳酰胆碱的影响。

3.3。人类干细胞增殖Midbrain-Derived

目的是探讨自发钙瞬变和calcium-regulating机制,我们的分析扩展到包括增殖干细胞。一般采用所描述,如图1和5,表达的不成熟的干细胞增殖标记Ki67前驱细胞巢蛋白标志。只有少数细胞(少于0.1%)显示自发分化与表达β浴缸III。

3.3.1。Thapsigargin和钙对干细胞增殖的影响孵化Calcium-Free介质

接触的细胞2μ米thapsigargin calcium-free介质诱导的胞质钙瞬态增加超过2/3的细胞(补充图两个独立的实验)。细胞被孵化calcium-free Krebs-Ringer解决方案包含10μM EGTA确保没有细胞外钙会导致胞质钙的变化。

干细胞也影射了2μ30分钟的M thapsigargin calcium-free Krebs-Ringer解决方案。增加2毫米钙(没有thapsigargin)诱导包含332个细胞的钙瞬态在七个独立的实验中,所有以相应的钙瞬变响应的钙(补充图)。这些实验也类似于实验如图3(一个)。

当细胞被装载在钙的存在和孵化calcium-free介质的thapsigargin紧随其后的钙,钙瞬变两个观察(图6)。

3.3.2。在增殖干细胞自发钙瞬变

代表从细胞钙的痕迹在六种不同的实验条件(从每组五个细胞痕迹)(图7(一))。57%的细胞自发钙瞬变观察孵化与钙(图2毫米Krebs-Ringer解决方案7 (b);控制样品;第一条)。遗漏的钙在孵化中(图7 (b);2 bar)造成明显降低分数的细胞钙瞬变到28% ( )。消耗细胞的胞内钙通过加载Fluo-4的2μM thapsigargin calcium-free中紧随其后的是孵化中calcium-free媒介进一步减少细胞钙瞬变7%的分数( 相比,样品在calcium-free解决方案)(图7 (b);第三条)。

增加10μM卡巴可孵化中细胞钙瞬变的比例上升到54%,这是通过添加10中和μM pirenzepine孵化介质( ;第四和第五条)(图7 (b))。

培养的细胞在含钠盐溶液与钙(图7 (b);6 bar)显著增加细胞钙瞬变的比例到81% ( 相比,控制价值)。钠取代NMDG为了维持生理同渗重摩。

3.3.3。胞质钙瞬变的模式在增殖干细胞

的痕迹的外观控制样本,样本细胞calcium-free介质以及calcium-depleted细胞,与分化细胞类似于跟踪观察。Carbacholine-stimulated细胞显示广泛的钙瞬变,基线水平逐渐增加钙在孵化中含钠介质。

4所示。讨论

4.1。区分人类Midbrain-Derived干细胞

钙信号有重要作用的神经系统发展的神经诱导增殖,迁移,分化的神经细胞(42- - - - - -44]。

我们发现自发海拔的胞内钙浓度(钙瞬变)在人类midbrain-derived接受神经干细胞分化(见附加图(视频)和图2)。钙瞬变率和形状不同。基底钙水平似乎改变根据使用泵和钙channel-active药物用于实验(thapsigargin和阿诺定,resp)。钙的钙瞬变的来源可能是细胞外钙离子通过钙通道进入细胞溶质或细胞内钙商店释放钙通过打开IP₃——或者ryanodine-sensitive频道。

以下4.4.1。钙源在区分神经元自发钙瞬变

清除细胞外钙大大减少的比例在每个实验细胞钙瞬变证明质膜钙离子通道的开放有助于钙瞬变。类似的结果之前报道的人类胚胎干细胞的神经元(28]。瞬态/活性细胞的数量减少了在缺乏外部钙但剩下的活动也可能表明钙释放细胞内的商店。这与以前的报告(28]。然而,有一个瞬变的形状变化从狭窄的山峰calcium-free媒介广泛而持久的钙增加calcium-depleted细胞。这必须通过但无特征由于大量钙钙通道。添加thapsigargin瞬变活动减少,基底的胞质钙水平随着时间的推移逐渐减少支持的观点逐渐商店损耗无效的微调休息在胞质钙离子浓度。

4.1.2。神经元Thapsigargin对分化的影响

Thapsigargin专门抑制内质的钙atp酶活性从而抑制钙的吸收进入内质网(42]。Thapsigargin (1μ米)已被证明导致大量消耗细胞内的Ca^{2 +}商店在海拉细胞衍生品(43]。为了检查如果区分人类神经干细胞包含细胞内储存的钙钙泵,提供细胞孵育2μM thapsigargin。观察到的瞬时增加胞质钙(图3(一个))似乎表明抑制thapsigargin-sensitive泵通常抵消钙泄漏从细胞内的商店。增加引起的胞质钙离子流入细胞外钙不是一个可能的解释,因为细胞孵化与10 calcium-free解决方案μM EGTA。

4.1.3。Store-Regulated钙流入区分神经元

receptor-operated钙入口的概念引入了30多年前(44]。它似乎是一个calcium-activated钙释放通道(45,46]。最近,一个可能的传感器腔内钙浓度在内质网已被确认47- - - - - -49),而第二个蛋白质,Orai1或CRACM,被确认为CRAC (Ca的调制器^{2 +}release-activated Ca^{2 +}渠道)或坚固本身50,51]。我们观察到一个相当快的胞质钙增加添加钙分化干细胞与thapsigargin影射calcium-free介质,这被认为是空胞内钙商店。这可能反映出的门店在细胞钙通道,这被认为是一个重要的机制,进入胞质钙(52]。然而,我们不能排除这样一种可能性,即胞质钙的增加可能导致电压门控钙通道开放。最近,暴露的神经干细胞系(hVM1) 60毫米钾后12天的区别被证明在9.5%的细胞,增加细胞内钙的兴奋性和钙通道的发展这些细胞的质膜(53]。

4.1.4。阿诺定在神经元分化的影响

阿诺定结合CRAC心脏和骨骼肌的肌浆网以及各种组织的内质网(54,55]。这些细胞器构成一个主要的细胞内储存的钙在哺乳动物细胞。微摩尔的浓度的阿诺定一个高亲和性结合网站的频道(56,57)和锁通道subconductance状态以开放统一的概率(58- - - - - -60]。我们的观察增加数量的钙瞬变的阿诺定治疗是依照以前的观测大鼠嗜铬细胞(61年]。时间和逐渐增加的胞质钙的存在利阿诺定也可能被解释成subconductance的发展状态ryanodine-sensitive钙通道允许释放到胞质钙。这可能猜测,显著增加细胞钙瞬变的分数可能是由于calcium-activated控制质膜的通道或内质网。

4.1.5。Na⁺/ Ca^{2 +}换热器在区分神经元

维护low-cytosolic钙浓度需要有效的传输机制的进入细胞内钙商店和跨质膜细胞外介质。等离子体膜Ca^{2 +}腺苷三磷酸酶(PMCA)泵和Na⁺/ Ca^{2 +}换热器挤出Ca^{2 +}向外,而内质网腺苷三磷酸酶(SERCA)泵隔离Ca^{2 +}细胞内的商店(2]。Na的周转率⁺/ Ca^{2 +}换热器是相当大的高于Ca^{2 +}腺苷三磷酸酶(PMCA)泵而Ca的亲和力^{2 +}较低(62年]表明钠⁺/ Ca^{2 +}换热器活动对胞质Ca的规定很重要^{2 +}。我们的观察时间的增加细胞的胞质钙孵化在缺乏钠可能表明减少Ca^{2 +}挤压能力和内稳态的损失。Ca的细胞被孵化^{2 +}无解决方案10分钟前增加钙的媒介。这可能有助于降低细胞内钙的商店,从而激活store-regulated钙通道,允许大量钙的补充钙。控制实验在钠的存在证明calcium-free曝光的效果是增加胞质钙但是程度低于观察钠介质。一致,细胞含钠介质的AUC显著大于细胞孵化的AUC钠的存在。我们得出这样的结论:这些细胞的质膜包含Na的交流机制⁺和Ca^{2 +}。可能猜测的比例的增加细胞钠溶液中钙瞬变的结果store-regulated钙通道开放。

4.1.6。Carbacholine钙瞬变诱导的神经元分化

毒蕈碱的受体的激活₁,米₃,米₅是与细胞内三磷酸肌醇的合成(IP₃),这在内质网钙通道开放,允许流出进入胞质钙(63年,64年]。我们使用了稳定毒蕈碱的受体激动剂氯化氨甲酰胆碱研究如果区分神经元对毒蕈碱的激活41],然后如果激活转导细胞内钙释放到胞质。分数的增加存在剂量依赖的相关性的细胞对碳酰胆碱刺激可能表明毒蕈碱的受体激活。这被pirenzepine观察支持的抑制,这被认为是毒蕈碱的M₁受体拮抗剂(41]。在协议中,量化钙瞬变(AUC)演示了响应的用药剂量增加碳酰胆碱和pirenzepine的抑制。可能因此推断卡巴可激活一个M₁毒蕈碱的受体在神经干细胞分化的点。在Ca控制实验^{2 +}无解决方案支持的胞质钙增加^{2 +}是由于知识产权₃敏感的Ca的内质网允许流出渠道^{2 +}进入胞液。此外,虽然calcium-free解决方案不影响细胞钙瞬变的一部分,它影响的量化参数(AUC)胞质钙增加。一个可能的解释可能是,协调从细胞内钙供应商店和细胞外介质是大型和长期的需求增加的胞质钙。

4.1.7。可能的角色分化神经元的自发钙瞬变

我们曾研究了胞内钙瞬变的影响基因表达(65年),在未成熟的细胞可能是细胞分化的先决条件。Dolmetsch et al。5)报道,细胞内钙振荡t淋巴球增加功效和钙信号的信息内容,导致基因表达和细胞分化。此外,最近的报告显示,自然在人类未成熟树突状细胞钙振荡与易位的转录因子NFAT(核转录因子的激活t细胞)核(66年)和内源性钙激增活动非洲爪蟾蜍tropicalis调节基因通路参与神经元发射机的发展规范(67年]。我们建议自发钙瞬变,我们观察到人类midbrain-derived干细胞可能导致分化的机制。

4.1.8。总结在区分神经元钙调节

我们为活动提供了证据的胞内钙商店与灵敏度thapsigargin和阿诺定的内质网腺苷三磷酸酶(SERCA)泵和阿诺定受体。此外,很可能我们的细胞包含毒蕈碱的M₁在质膜受体可能启动IP₃合成,从而激活IP₃受体在内质网。挤压质膜钙的似乎发生由store-activated钙/钙交换和流入渠道。自发钙瞬变是由钙从细胞内的商店或细胞外介质。可用钙供应影响活动的模式。定量大钙增加(AUC)似乎需要一个协调的钙的供应来源。虽然看来,这些细胞发展的机制控制所需的钙强化作为人类间充质干细胞还报告说,需要进一步的实验来评估机制之间的相互作用,导致胞质钙增加和减少,以及分别阐明voltage-activated或receptor-activated可能作用在质膜钙通道。

4.2。人类Midbrain-Derived干细胞增殖

4.2.1。准备证据商店和Store-Regulated钙离子通道的质膜增殖干细胞

Thapsigargin阻止钙腺苷三磷酸酶,供应能量再摄取钙细胞内储存的钙。观察到的钙瞬变的细胞的主要部分(补充图)支持认为增殖干细胞确实包含细胞内钙的商店。thapsigargin的影响也可能被解释成一个令人不安的影响thapsigargin之间的平衡和再吸收的钙释放到商店商店导致损耗的钙。损耗的钙商店被激活store-regulated质膜钙通道。当细胞被影射与thapsigargin calcium-free介质,随后的孵化与钙(补充图)诱导的钙瞬态可能是开放的结果位于质膜上的钙通道的损耗的细胞内的商店。这种观点是支持的结果如图6从商店和thapsigargin释放钙这将导致大量的钙。

4.2.2。钙供应在增殖干细胞自发钙瞬变

我们报告在增殖神经干细胞自发钙瞬变(数字7(一)和7 (b))。超过55%的细胞显示在观察期间自发瞬变。的细胞含有Fluo-4钙的存在为了避免细胞内钙的消耗。然后,这些细胞被孵化的钙。疏忽引起的细胞外钙明显降低细胞钙瞬变的分数大约一半的价值控制样本。这可能表明,细胞外钙有助于细胞内钙瞬变。然而,在缺乏外部供应的钙的情况下,仍有相当大一部分细胞钙瞬变,这几乎是废除当细胞被使用thapsigargin calcium-free媒介。这种治疗可能会空胞内钙商店,这表明这些可能是钙供应商自发钙瞬变。

我们得出结论,有自发钙瞬变期间在神经干细胞增殖,钙瞬变供应是通过介导的细胞内的商店和钙离子流入细胞外介质。

4.2.3。氯化氨甲酰胆碱在增殖细胞中钙瞬变感应

如果细胞包含细胞内钙商店,很可能他们会回应的质膜受体激活产生三磷酸肌醇。我们有刺激的细胞乙酰胆碱calcium-free介质模拟碳酰胆碱,观察分数的增加细胞与细胞培养相比,钙瞬变calcium-free介质( )。这种效应被pirenzepine抵消,这是一个选择性抑制剂的M₁乙酰胆碱受体。这些观察结果支持神经干细胞增殖的视图包含细胞内钙商店和毒蕈碱的M₁在质膜受体。很可能碳酰胆碱激活诱导合成三磷酸肌醇,从细胞内释放钙商店。

4.2.4。存在Na⁺/ Ca^{2 +}换热器在增殖干细胞

减少细胞内钙瞬变的峰值后引起thapsigargin(补充图)可能是由于清除胞质钙通过射流在质膜,因为再摄取细胞内钙不太可能存储在thapsigargin的存在。挤压的机制可能是一种细胞内钙为细胞外钠的交换。我们有孵化干细胞缺乏自中含钠钠介质的情况下,钙是废除的挤压。这导致显著增加细胞钙瞬变的分数比控制价值( )以及基线的钙含量。因此,我们观察支持了这样一种观点,即神经干细胞已经开发出一种Na⁺/ Ca^{2 +}在质膜转运体。

5。结论

这是第一次自发钙瞬变的比较报告在人类midbrain-derived干细胞增殖和分化提供了证据可能涉及的机制。我们认为观察到的自发钙瞬变可能会影响信号通路参与干细胞增殖、表型分化和成熟。

的利益冲突

作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。

确认

专家的技术援助Dorte Lyholmer和安妮特Kragh拉斯穆森。作者与bioimaging谢谢Pia Jensen博士的帮助。这项研究受到了丹麦帕金森协会,粗俗的m . Brogaard og Hustrus Mindefond, Hørslev Fonden,才是Almene喜爱,和克里斯汀•og弗雷迪约翰森喜欢。在AMS实验室工作支持由自治Cumunidad马德里(s2010 - bmd - 2336)和西班牙祝您健康卡洛斯三世(RETICS雄鹰,RD12/0019/0013)。

补充材料